FTO 減少DKK2的m6 A修飾和促進(jìn)DKK2表達(dá)而減少心肌纖維化

李 溪 ,王坤榮

(1.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院心血管內(nèi)科,寧夏銀川 750004;2.山東醫(yī)專附屬費(fèi)縣人民醫(yī)院,山東臨沂 273400)

在各種心血管疾病中,急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)是造成死亡及殘疾的最主要原因之一[1]。心肌梗死后主要的病理過(guò)程是心肌纖維化,而有效抑制心肌纖維化能改善預(yù)后,提高患者生存率[2]。但目前對(duì)于心肌纖維化的具體機(jī)制還不甚清楚。已發(fā)現(xiàn)N6甲基腺苷(N6-methyladenosine,m6A)具有多種生物學(xué)功能,是目前研究的熱點(diǎn)[3]。m6A 是一種RNA 修飾方式,在真核細(xì)胞中極其豐富,能調(diào)控RNA 的定位、輸出、剪切、穩(wěn)定和翻譯等,進(jìn)而與多種人類疾病的進(jìn)展密切相關(guān)[4]。近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn),m6A 同樣影響冠心病、AMI和心力衰竭等多種心血管疾病的進(jìn)展[5]。其中脂肪量和肥胖相關(guān)蛋白(fat mass and obesity-associated protein,FTO)是m6A 去甲基化酶的最主要成員,能減低m6A 修飾水平[6]。MATHIYALAGAN 等[7]研究發(fā)現(xiàn),FTO 在心力衰竭哺乳動(dòng)物心臟和缺氧心肌細(xì)胞中的表達(dá)下調(diào),其可對(duì)心肌收縮相關(guān)基因選擇性地去甲基化,減少缺血誘導(dǎo)的m6A 增加,從而降低降解而改善在缺血條件下的蛋白表達(dá)水平,最終改善心臟收縮功能。這提示FTO 調(diào)控的m6A 甲基化修飾在心力衰竭進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。雖然目前已有研究報(bào)道FTO 與多種心臟疾病相關(guān)[8],但對(duì)于其具體作用機(jī)制還研究不多。

Wnt/β-catenin信號(hào)通路是調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、遷移、黏附的重要途徑,已被證實(shí)在心室重構(gòu)中發(fā)揮重要作用,而dickkopf 2(DKK2)是此通路的主要拮抗劑,具有抑制多種纖維化進(jìn)程的作用[9-11]。有研究顯示,DKK2能抑制α-平滑肌肌動(dòng)蛋白和Ⅱ型膠原等促纖維化基因的表達(dá),進(jìn)而抑制肝星狀細(xì)胞的活化而減少肝纖維化[10]。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn),DKK2在心肌纖維化過(guò)程中具有重要作用[11],且序列分析表明,DKK2含有m6A 修飾位點(diǎn)。因此,FTO 在心肌纖維化過(guò)程中發(fā)揮作用是否與DKK2相關(guān)值得深入研究。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

人心肌成纖維細(xì)胞(cardiac fibroblasts,CFs)和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)補(bǔ)充劑-2(ScienCell研究實(shí)驗(yàn)室);C57BL/6 小鼠(寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心);DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、雙抗、Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑、TRIzol Plus RNA 純化試劑盒和DKK2一抗(Thermo Fisher Scientific公司);血管緊張素Ⅱ(AngⅡ,Sigma公司);過(guò)表達(dá)載體和All-in-One第一鏈cDNA 合成試劑盒(GeneCopoeia公司);siRNA和引物(上海吉瑪公司);TB Green Fast qPCR Mix(TaKaRa公司);Magna RIP RNA 結(jié)合蛋白免疫沉淀試劑盒(Millipore公司);CCK-8試劑盒、蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒和RIPA裂解液(上海碧云天公司);FTO一抗和二抗(Cell Signaling Technology 公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及急性心肌梗死小鼠模型構(gòu)建及心功能評(píng)價(jià)

原代人CFs用DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng),加入1 mL/L成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)補(bǔ)充劑-2、100 mL/L 胎牛血 清、100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素。用100 nmol/L AngⅡ刺激CFs 48 h誘導(dǎo)纖維化表型。

將C57BL/6小鼠于特定無(wú)病原體環(huán)境中飼養(yǎng)。用7-0外科縫線永久結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支,構(gòu)建AMI模型,然后將含有FTO 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒的納米粒以200μL體積腹腔注射于AMI小鼠體內(nèi)。在AMI后14 d進(jìn)行超聲心動(dòng)圖測(cè)定心臟功能,測(cè)量左心室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)、左心室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)、左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)和左室短軸縮短率(LVFS)并通過(guò)超聲心動(dòng)圖軟件自動(dòng)計(jì)算。小鼠麻醉后,用二氧化碳進(jìn)行窒息安樂(lè)死,摘取心臟組織測(cè)量各組小鼠的心臟質(zhì)量(HW)和體質(zhì)量(BW),并計(jì)算其比值;留取心臟組織進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。本研究經(jīng)寧夏醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物研究所倫理委員會(huì)批準(zhǔn);本實(shí)驗(yàn)根據(jù)美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南進(jìn)行。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和實(shí)時(shí)定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)

使用Lipofectamine 3000 轉(zhuǎn)染試劑將空載體(EV)和FTO 過(guò)表達(dá)載體(FTO-O)分別轉(zhuǎn)染CFs,或共轉(zhuǎn)染FTO-O 和DKK2 siRNA(5'-GGGCCAAACTCAACTCCAT-3'),然后將各組CFs 與100 nmol/L AngⅡ孵育48 h。使用TRIzol Plus RNA 純化試劑盒從小鼠心臟樣本或培養(yǎng)的CFs中提取總RNA,接著使用All-in-One第一鏈cDNA 合成試劑盒合成cDNA。使用TB Green Fast qPCR Mix進(jìn)行RT-qPCR 檢測(cè)FTO、DKK2、α-SMA、collagen Ⅰ和collagenⅢ的m RNA 表達(dá)。所用引物序列見表1。

表1 RT-qPCR 各基因引物序列Tab.1 Gene sequence of primers for RT-qPCR

1.4 DKK2的m6 A修飾水平的檢測(cè)

使用Magna RIP RNA 結(jié)合蛋白免疫沉淀試劑盒進(jìn)行RIP分析。將3×107個(gè)CFs用150μL RIP裂解緩沖液裂解,然后在4℃下與包被有m6A 抗體的磁珠孵育過(guò)夜。純化共沉淀RNA后,用RTqPCR 通過(guò)擴(kuò)增m6A 共有序列區(qū)域,檢測(cè)m6A+DKK2 mRNA 水平。

1.5 細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(CCK-8)檢測(cè)細(xì)胞存活力

將CFs接種到96孔板,轉(zhuǎn)染按“1.3項(xiàng)”步驟進(jìn)行,然后用AngⅡ刺激,將10μL CCK-8溶液加至各組CFs中,37℃下培養(yǎng)2 h。通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)量450 nm處的吸光度值。

1.6 組織病理學(xué)觀察和免疫組織化學(xué)染色

將所取心肌組織進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色以評(píng)估形態(tài)學(xué)變化。進(jìn)行Masson染色以確定梗死面積和膠原纖維程度。梗死區(qū)面積按以下公式計(jì)算:梗死百分比=(左心室梗死內(nèi)徑長(zhǎng)度+左心室梗死外徑長(zhǎng)度)/(左心室梗死內(nèi)徑周長(zhǎng)+左心室梗死外徑周長(zhǎng))×100%。使用Image J軟件測(cè)量心肌纖維化面積,然后計(jì)算膠原體積分?jǐn)?shù)=纖維化面積/左心室總面積×100%。

1.7 Western blotting檢測(cè)蛋白表達(dá)

用預(yù)冷RIPA 裂解各組CFs獲得含總蛋白的細(xì)胞裂解物,40μg蛋白上樣進(jìn)行電泳,轉(zhuǎn)膜后分別加入DKK2(1∶800)或FTO(1∶600)一抗于4℃孵育過(guò)夜后,加入辣根過(guò)氧化物酶(HRP)結(jié)合的二抗(1∶5 000),室溫下孵育1 h。最后用化學(xué)發(fā)光底物(ECL)顯影,拍照定量分析蛋白條帶的灰度,評(píng)估蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 20.0軟件,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,在滿足正態(tài)性及方差齊性的條件下,組間比較采用方差分析,多重比較采用LSD-t檢驗(yàn);不滿足參數(shù)檢驗(yàn)條件時(shí),組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)。P＜0.05被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FTO 調(diào)控DKK2 的m6 A 修飾與CFs活化的關(guān)系

用AngⅡ誘導(dǎo)CFs活化發(fā)現(xiàn),AngⅡ顯著抑制FTO和DKK2的表達(dá),過(guò)表達(dá)FTO 顯著逆轉(zhuǎn)AngⅡ抑制DKK2表達(dá)的作用;同時(shí)檢測(cè)DKK2的m6A 水平發(fā)現(xiàn),AngⅡ增加DKK2 的m6A 修飾,而過(guò)表達(dá)FTO 阻斷AngⅡ增強(qiáng)m6A 修飾的作用;細(xì)胞存活力檢測(cè)結(jié)果顯示,AngⅡ促進(jìn)CFs的存活,而過(guò)表達(dá)FTO 抑制AngⅡ的促存活作用;另外,AngⅡ促進(jìn)α-SMA、collagen Ⅰ和collagenⅢ的表達(dá),過(guò)表達(dá)FTO也同樣顯著減少AngⅡ的促表達(dá)作用;但當(dāng)共轉(zhuǎn)染FTO 過(guò)表達(dá)載體和DKK2 siRNA時(shí),DKK2 siRNA可拮抗FTO 過(guò)表達(dá)作用,從而恢復(fù)AngⅡ促進(jìn)CFs的存活和上調(diào)α-SMA、collagen Ⅰ和collagenⅢ表達(dá)的作用(圖1)。

圖1 AngⅡ活化心肌成纖維細(xì)胞的作用與FTO、DKK2的關(guān)系Fig.1 The relationship b etween AngⅡ-induced activation of cardiac fibroblasts and the expressions of FTO and DKK2

2.2 FTO 對(duì)AMI小鼠心功能的影響

構(gòu)建AMI小鼠模型后,評(píng)估FTO 對(duì)心功能的影響作用,結(jié)果顯示,AMI 小鼠的LVEDD 和LVESD 較正常對(duì)照組小鼠顯著增加(P＜0.05),而LVEF和LVFS明顯減少(P＜0.05);AMI小鼠的心臟質(zhì)量/體質(zhì)量的比率(HW/BW)也較正常對(duì)照組小鼠顯著增加(P＜0.05);在上調(diào)FTO 的表達(dá)后,AMI小鼠的LVEDD、LVESD和HW/BW 較AMI組顯著減少(P＜0.05),而LVEF 和LVFS 明顯增加(P＜0.05,圖2)。

圖2 FTO 與AMI小鼠心功能的關(guān)系Fig.2 The relationship between FTO and cardiac function in AMI mice

2.3 FTO 與AMI小鼠病理進(jìn)展的關(guān)系

HE 染色顯示,AMI小鼠心臟有明顯的成纖維細(xì)胞增殖、心肌肥厚和更多的纖維化;當(dāng)FTO 過(guò)表達(dá)時(shí),上述AMI的典型生理現(xiàn)象顯著被改善(纖維化減少),梗死面積減小;同時(shí),Masson 染色也顯示,AMI小鼠左心室前壁梗死區(qū)的心肌組織被膠原纖維替代,膠原纖維顯著增加;而FTO 過(guò)表達(dá)可顯著減少上述現(xiàn)象(圖3)。

圖3 FTO 與AMI小鼠病理進(jìn)展的關(guān)系Fig.3 The relationship between FTO and pathological progression in AMI mice

2.4 FTO 與AMI小鼠DKK2的m6 A 修飾、表達(dá)的關(guān)系

檢測(cè)FTO 和DKK2的表達(dá)發(fā)現(xiàn),FTO 和DKK2在AMI小鼠中的表達(dá)均顯著減少;過(guò)表達(dá)FTO時(shí),DKK2在AMI小鼠中的表達(dá)也顯著上升;檢測(cè)FTO和DKK2的蛋白水平也有類似的發(fā)現(xiàn),FTO 過(guò)表達(dá)能顯著恢復(fù)DKK2在AMI小鼠中的表達(dá);同時(shí)檢測(cè)DKK2 的m6A 水平發(fā)現(xiàn),DKK2 的m6A 修飾在AMI小鼠中顯著增加,而過(guò)表達(dá)FTO 顯著減少DKK2的m6A 水平(圖4)。

圖4 FTO 調(diào)控AMI小鼠中DKK2的m6 A修飾和表達(dá)水平Fig.4 FTO regulated m6 A modification and expression level of DKK2 in AMI mice

3 討 論

心肌纖維化是AMI后的重要病理變化。近年來(lái)有研究表明,m6A 也與心血管疾病等多種疾病密切相關(guān)[12]。但到目前為止,關(guān)于m6A 在心血管進(jìn)展中作用機(jī)制的相關(guān)研究很少。

FTO 是一種關(guān)鍵的m6A 去甲基化酶,在多種人體組織中廣泛表達(dá)。近年來(lái),有研究發(fā)現(xiàn),FTO 在多種心血管疾病中表達(dá)異常,可能具有重要的調(diào)控作用[13]。例如,MATHIYALAGAN 等[7]研究發(fā)現(xiàn),FTO 在心肌梗死小鼠模型中過(guò)表達(dá)能降低纖維化并增強(qiáng)血管生成。FTO 在缺氧/復(fù)氧(H/R)誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào),其表達(dá)上調(diào)能下調(diào)SERCA2a基因的m6A 水平,從而增加心肌細(xì)胞活力、線粒體膜電位和ATP含量,并減少細(xì)胞毒性、細(xì)胞凋亡、ROS含量和鈣濃度,因此認(rèn)為FTO 通過(guò)去甲基化降低SERCA2a m RNA 的m6A 水平,從而促進(jìn)SERCA2a表達(dá),維持鈣穩(wěn)態(tài),改善H/R 心肌細(xì)胞的能量代謝[14]。本研究進(jìn)一步的探討也表明,AngⅡ誘導(dǎo)心肌成纖維細(xì)胞活化的過(guò)程中,FTO 表達(dá)下調(diào);同時(shí),FTO 在AMI 小鼠中的表達(dá)也顯著下調(diào);過(guò)表達(dá)FTO 顯著抑制CFs的存活力,改善心肌功能和減少AMI小鼠的纖維化水平,這表明FTO 確實(shí)在心臟的正常功能發(fā)揮中具有關(guān)鍵的調(diào)控作用。針對(duì)糖尿病心肌病(DCM)小鼠的研究也發(fā)現(xiàn),m6A 總水平在DCM 中升高,且相關(guān)的基因與心肌纖維化、心肌肥厚和心肌能量代謝密切相關(guān);其中FTO 表達(dá)下調(diào),過(guò)表達(dá)FTO 可通過(guò)減少心肌纖維化和心肌細(xì)胞肥大而改善心功能[15]。因此,FTO 在心肌疾病中意義非凡,可能是診斷治療的一個(gè)重要靶點(diǎn)。

研究進(jìn)一步表明,在AngⅡ活化的CFs和AMI小鼠中,DKK2 的m6A 水平增加,而其表達(dá)水平下調(diào);FTO 能減少DKK2 的m6A 水平,從而增強(qiáng)DKK2的表達(dá)。DORN 等[16]檢測(cè)心肌細(xì)胞m RNA的m6A 甲基化水平發(fā)現(xiàn),肥大刺激會(huì)導(dǎo)致一系列基因的m6A 水平增加,表明m6A 甲基化可能在心肌細(xì)胞肥大中發(fā)揮作用。SUN 等[11]研究發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染DKK2 siRNA 可導(dǎo)致β-catenin、α-SMA、膠原Ⅰ和膠原Ⅲ的水平升高,同時(shí)增強(qiáng)CF 的增殖和遷移,并減少凋亡。Sept4 在肝星狀細(xì)胞中缺失會(huì)導(dǎo)致DKK2表達(dá)減少而激活經(jīng)典的Wnt通路,進(jìn)而促進(jìn)促纖維化基因的表達(dá)和抑制抗纖維化基因Smad7的表達(dá),從而導(dǎo)致肝星狀細(xì)胞發(fā)生促纖維化轉(zhuǎn)化[10]。HONG等[17]發(fā)現(xiàn),長(zhǎng)期暴露于納米TiO2所導(dǎo)致的腎纖維化與DKK2 的表達(dá)下調(diào)密切相關(guān)。上述研究表明,DKK2在多種纖維化過(guò)程中發(fā)揮作用。FTO 在心力衰竭小鼠中的表達(dá)下調(diào),其過(guò)表達(dá)導(dǎo)致H/R 處理的心肌細(xì)胞中Mhrt的上調(diào)和Mhrt的m6A 修飾減少,從而降低H/R 處理的心肌細(xì)胞凋亡[18]。因此,FTO可通過(guò)調(diào)控DKK2等關(guān)鍵基因的m6A 修飾水平而上調(diào)相對(duì)應(yīng)基因的表達(dá)水平,從而在心肌疾病中發(fā)揮作用。

綜上,FTO 可通過(guò)減少DKK2的m6A 修飾水平而促進(jìn)DKK2的表達(dá),進(jìn)而抑制心肌纖維化的進(jìn)展,表明FTO/DKK2通路是調(diào)控心肌纖維化的關(guān)鍵通路,可成為診斷治療心肌纖維化相關(guān)疾病的重要靶點(diǎn)。