lncRNA GAS5與JAK1/STAT3信號(hào)通路對(duì)大鼠心肌細(xì)胞缺氧損傷影響

李艷偉，崔巍，李玉強(qiáng)，王晶，李男

(錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，遼寧 錦州 121000)

缺氧在許多疾病的病理過程中貫穿始終，心肌組織對(duì)缺氧環(huán)境高度敏感，缺氧的主要特點(diǎn)是心肌供氧不足，導(dǎo)致需氧量和氧供應(yīng)不平衡，人類的許多心血管疾病，包括冠狀動(dòng)脈疾病、心力衰竭、心肌病等，均不同程度地與低氧相關(guān)[1]。到目前為止，針對(duì)心肌缺氧已經(jīng)進(jìn)行了很多研究，關(guān)注的重點(diǎn)是心肌細(xì)胞中的分子調(diào)節(jié)因子[2]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類擁有200個(gè)或更多核苷酸的轉(zhuǎn)錄本，不直接參與基因編碼和蛋白質(zhì)合成[3]。隨著后基因組時(shí)代的到來(lái)，越來(lái)越多的研究揭示了lncRNA在基因轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、染色體修飾、表觀遺傳學(xué)改變等方面發(fā)揮了生物學(xué)功能，且其調(diào)節(jié)作用可能參與心血管疾病發(fā)生、發(fā)展的各個(gè)病理生理過程[4]。近年來(lái)，lncRNA在缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中的關(guān)注度越來(lái)越高[5-6]。

GAS5是一種對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡有重要調(diào)控作用的lncRNA，在人類組織中廣泛表達(dá)。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)GAS5在心血管疾病、內(nèi)分泌代謝性疾病以及自身免疫性疾病等非腫瘤性疾病中也發(fā)揮重要作用[7]，但其是否能調(diào)節(jié)缺氧誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞的炎癥和細(xì)胞活力尚不清楚。JAK1/STAT3信號(hào)通路是細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要途徑，它廣泛參與了心肌細(xì)胞增殖、免疫、炎癥等多種過程[8]，但是該通路在缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中的研究甚少。本研究通過建立心肌細(xì)胞缺氧模型，深入探索lncRNA GAS5及JAK1/STAT3信號(hào)通路在缺氧H9C2細(xì)胞中的作用。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

胰蛋白酶Cat#：27250-018(GIBCOBRL，美國(guó))；DMEM培養(yǎng)基(GIBCOBRL，美國(guó))；T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶(OrangeScientific，比利時(shí))；CO2恒溫培養(yǎng)箱(ThermoForma，美國(guó))；超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司)；倒置顯微鏡(OLYMPUS，日本)；5415D型離心機(jī)(Eppendorf，德國(guó))；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(碧云天)；流式細(xì)胞儀(BD，美國(guó))；CCK8檢測(cè)試劑盒(碧云天)；IL-6/IL-8ELISA檢測(cè)試劑盒(惠佳生物)。

1.2 實(shí)驗(yàn)對(duì)象

H9C2細(xì)胞ATCC(rat，CL-0089，美國(guó)菌種保藏中心)

1.3 心肌細(xì)胞缺氧模型制備

第一步：將H9C2細(xì)胞解凍。第二步：用DMEM完全培養(yǎng)基(DMEM + 10%胎牛血清 + 1%青/鏈霉素)培養(yǎng)細(xì)胞，使用CO2培養(yǎng)箱孵育細(xì)胞(37 ℃，5% CO2)。第三步：將孵育好的細(xì)胞分為兩部分，一部分在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12、24 h(37 ℃，95% N2，5% CO2)，誘導(dǎo)缺氧損傷，作為缺氧組。另一部分細(xì)胞在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h(37 ℃，空氣，5% CO2)，作為對(duì)照組。使用倒置顯微鏡，在100倍和400倍鏡下觀察0 h、12 h、24 h的細(xì)胞形態(tài)。選擇缺氧組細(xì)胞和對(duì)照組的對(duì)數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和信號(hào)傳導(dǎo)抑制

選擇缺氧組(24 h)細(xì)胞，通過轉(zhuǎn)染來(lái)調(diào)節(jié)GAS5的表達(dá)。第一步：將1.0×106的細(xì)胞在25 cm2培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，用8 mL DMEM培養(yǎng)基孵育過夜。在轉(zhuǎn)染過程開始前的0.5 h內(nèi)，用900 μL的無(wú)血清培養(yǎng)基替換培養(yǎng)物。第二步：混合物A按照每個(gè)培養(yǎng)瓶加入25 μL的siGAS5或SiNC來(lái)制備，用Opti-MEM稀釋，每組的最終體積為500 μL。混合物B用8 μL脂質(zhì)體2000試劑制備，用Opti-MEM稀釋至最終體積為500 μL。將混合物B孵育5 min后，加入混合物A中，輕輕混合，在室溫下孵育20 min后將該混合物以滴式的方式加入到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。5%二氧化碳在37 ℃下孵育6 h后，更換RPMI1640培養(yǎng)基。si-GAS5和siNC等序列分別在天津賽爾生物技術(shù)有限公司合成。序列如下si-GAS5(鼠)，正向?yàn)?′-UAUAAAGGUACCACAUGUTT-3′，反向?yàn)?′-ACAUGUGGUACCUUUAUACTT-3′；NC(鼠)，正向?yàn)?′-UUCUCCGAAC GUGUCACGUTT-3′；反向?yàn)?′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。轉(zhuǎn)染后，將缺氧細(xì)胞分為缺氧對(duì)照組、si-NC和si-GAS5等亞組。

1.5 酪氨酸激酶抑制劑處理

選擇缺氧組(24 h)細(xì)胞，用10 nM的JAK1/STAT3抑制劑酪氨酸激酶抑制劑處理1 h(HY-12000，MCE，上海，中國(guó))滅活JAK1/STAT3信號(hào)通路。因此，形成了兩個(gè)具有不同的JAK1/STAT3活性的亞組，這些細(xì)胞被準(zhǔn)備好以供進(jìn)一步使用。

1.6 RT-qPCR檢測(cè)不同組細(xì)胞的表達(dá)水平

在培養(yǎng)基中加入TRIzol試劑1 mL，溶解細(xì)胞和提取總RNA。操作步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行，將這些RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNAs，5 pmol/μL TCR引物(1 μL反向和1 μL正向)分別用2×SYBR Premix Ex Taq試劑盒和無(wú)菌雙蒸餾水與每個(gè)亞組的cDNAs混合。引物序列顯示如下：GAS5：正向?yàn)?′-CTTGCCTGGACCAGCTTAAT-3′，反向?yàn)?′-GAAGCCGACTCTCCATACCT-3′；JAK1：正向?yàn)?′-CATGGTGGAAGAGTTTGTGGAA-3′，反向?yàn)?′-CAGCTGTTT GGCAACTTTGAATT-3′；STAT3：正向?yàn)?′-ATTCTACTGGAGTGCCGTAAC-3′，反向?yàn)?5′-ACAGGATGCGTAGGTTCTTG-3′；β-actin：正向?yàn)?′-CATGTA CGTTGCTATCCAGG-3′，反向?yàn)?′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′。PCR步驟的參數(shù)如下：預(yù)變性時(shí)間為95 ℃ 4 min；變性時(shí)間為94 ℃ 30 s；退火時(shí)間為58 ℃ 30 s；延長(zhǎng)時(shí)間為72 ℃ 30 s和40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算RNAs的表達(dá)水平，所有的試驗(yàn)都進(jìn)行了3次。

1.7 CCK-8

正常組、缺氧組(24 h)、其他缺氧亞組如si-NC、si-GAS和AG490組均在96孔板中培養(yǎng)，每孔培養(yǎng)5×103個(gè)細(xì)胞。置于5%CO2恒溫37 ℃孵育24 h后，在每個(gè)培養(yǎng)皿中加入10 μL CCK-8溶液孵育1 h后，使用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)量細(xì)胞的光密度，各組均重復(fù)測(cè)量3次。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡情況

從所有組中選擇細(xì)胞，在6孔板中進(jìn)行接種，每孔的細(xì)胞數(shù)為2×105個(gè)。每組都有3個(gè)平行的復(fù)雜孔。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%時(shí)，收集細(xì)胞，以1200 rpm轉(zhuǎn)速離心5 min后，用PBS洗滌細(xì)胞，加入Annexinin V-FITC/PE凋亡檢測(cè)試劑盒。應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡的情況，所有各組的細(xì)胞凋亡率都測(cè)量3次。

1.9 蛋白質(zhì)印跡

所有組別的H9C2細(xì)胞分別用PBS沖洗3次，用RIPA緩沖液裂解提取總蛋白。用BCA法定量測(cè)定這些蛋白的濃度。第一步：通過SDS-PAGE將總蛋白進(jìn)行分離后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上；第二步：用5%脫脂奶粉在室溫下封閉PVDF膜3 h。在加入一抗之后，在4 ℃下的環(huán)境中孵育過夜。在缺氧亞組中，分別檢測(cè)siNC、siGAS和AG490、磷酸化-JAK1、總JAK1、磷酸化-STAT3和總STAT3的表達(dá)，獲得了一抗，如抗IL-6、抗IL-8、抗p-JAK1、抗JAK1、抗p-STAT3和抗STAT3，β-肌動(dòng)蛋白作為內(nèi)參。用快速塊阻斷緩沖液沖洗膜3次，用山羊抗兔IgG H&L(HRP)在室溫下孵育2 h后，用PBST沖洗膜3次。將Beyo ECL Star溶液灑在膜上均勻覆蓋。2 min后用膜夾固定膜，在暗室中保存1 min進(jìn)行顯影和固定。掃描了蛋白質(zhì)的灰色條帶。每一組分別進(jìn)行獨(dú)立評(píng)估3次。

1.10 印跡圖像的量化

使用Image J軟件，通過測(cè)定在蛋白質(zhì)印跡圖像中觀察到的特定條帶的強(qiáng)度，來(lái)定量印跡圖像的蛋白質(zhì)密度。將印跡圖像導(dǎo)入軟件，并進(jìn)行對(duì)比度調(diào)整，以獲得清晰度的蛋白印跡圖像。利用矩形選擇工具，選擇每個(gè)波段周圍的區(qū)域進(jìn)行分析。

1.11 ELISA方法

收集各組細(xì)胞懸液，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒的說明來(lái)檢測(cè)IL-6和IL-8細(xì)胞因子的濃度，每組分別檢測(cè)IL-6或IL-8均為3次。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用 GraphPadPrism 8.0軟件和SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，單向方差分析適用于兩個(gè)以上的組，采用Bonferroni校正法進(jìn)行分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞活力、細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)的改變

分別觀察H9C2細(xì)胞0、12和24 h暴露于缺氧環(huán)境后的細(xì)胞形態(tài)，并在不同放大倍數(shù)(100×和400×)缺氧處理的顯微鏡下成像，每次從6個(gè)不同角度拍攝圖像。結(jié)果表明缺氧處理可改變細(xì)胞形態(tài)，見圖1A。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，缺氧條件，細(xì)胞凋亡率顯著提高。此外，隨著缺氧暴露時(shí)長(zhǎng)的增加，細(xì)胞凋亡率也有所增加(**P<0.05)，見圖1B。CCK-8結(jié)果顯示，與正常組細(xì)胞相比，缺氧組細(xì)胞的細(xì)胞活力明顯減低，并且與缺氧12 h組相比，缺氧24 h組細(xì)胞的細(xì)胞活力明顯減低(**P<0.05；**&&P<0.05)，見圖1C?？紤]到24 h組與0 h組之間的差異可能較大，故選擇24 h缺氧組進(jìn)行進(jìn)一步的檢測(cè)。采用ELISA法評(píng)價(jià)炎癥細(xì)胞因子。結(jié)果推斷，與正常的H9C2細(xì)胞相比，缺氧誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞中IL-6和IL-8均顯著增加(**P<0.05)，見圖1D。

2.2 在缺氧H9C2細(xì)胞中下調(diào)GAS5可抑制細(xì)胞凋亡和炎癥細(xì)胞因子，促進(jìn)細(xì)胞活力

轉(zhuǎn)染后，從不同組中提取RNAs。RNA電泳圖像顯示，這些RNAs在不同組中得到了成功的調(diào)控，見圖2A-2B。RT-qPCR發(fā)現(xiàn)，與正常細(xì)胞組相比，缺氧可顯著增強(qiáng)GAS5的表達(dá)(**P<0.05)，見圖2C。此外，RT-qPCR檢測(cè)各組GAS5的表達(dá)，即對(duì)照組、siNC組和siGAS5組，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組、siNC組相比，siGAS5組中GAS5RNA的表達(dá)顯著降低(**P<0.05)，見圖2D。ELISA結(jié)果顯示與對(duì)照組、siNC組相比，在siGAS5組中IL-6和IL-8蛋白的表達(dá)明顯減少(**P<為0.05)，見圖2E，這表明在缺氧的H9C2細(xì)胞中，通過下調(diào)GAS5可以減輕炎癥反應(yīng)。CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力結(jié)果顯示，與對(duì)照組、siNC組相比，siGAS5組的細(xì)胞活力顯著增加(**P<0.05)，見圖2F。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率結(jié)果顯示，與對(duì)照組、siNC組相比，siGAS5組的細(xì)胞凋亡率顯著下降(**P<0.05)，見圖2F、2G、2H。以上所有檢測(cè)均重復(fù)進(jìn)行3次。

**P<0.05

2.3 GAS5通過JAK1/STAT3信號(hào)通路調(diào)控H9C2細(xì)胞的缺氧損傷

RT-qPCR結(jié)果顯示，與正常細(xì)胞相比，缺氧誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞中JAK1和STAT3的mRNA表達(dá)得到了顯著的促進(jìn)(**P<0.05)，見圖3A。Western blot技術(shù)發(fā)現(xiàn)，與siNC組相比較，siGAS5組的JAK1和STAT3通路的磷酸化受到抑制，p-JAK1/JAK1和p-STAT3/STAT3蛋白水平明顯減少(**P<0.05)，見圖3B、3C。為了研究JAK1和STAT3通路在H9C2細(xì)胞缺氧損傷中的作用，缺氧對(duì)照組細(xì)胞用10 nM 酪氨酸激酶抑制劑處理1 h。Westernblot條帶顯示，與缺氧對(duì)照組相比，酪氨酸激酶抑制劑抑制了JAK1和STAT3的磷酸化水平，酪氨酸激酶抑制劑組p-JAK1/JAK1和p-STAT3/STAT3蛋白水平明顯降低(**P<0.05)，見圖3D。采用RT-qPCR檢測(cè)酪氨酸激酶抑制劑使JAK1/STAT3信號(hào)通路的失活后對(duì)GAS5的影響發(fā)現(xiàn)，與缺氧對(duì)照組相比，酪氨酸激酶抑制劑組中GAS5的表達(dá)明顯減少(**P<0.05)，見圖3E。此外，與缺氧對(duì)照組相比，酪氨酸激酶抑制劑組的細(xì)胞活力有所增加(**P<0.05)，見圖3F。ELISA方法顯示，與缺氧對(duì)照組相比，酪氨酸激酶抑制劑組中IL-6和IL-8的表達(dá)明顯減少(**P<0.05)，見圖3G。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與缺氧對(duì)照組相比，酪氨酸激酶抑制劑組中的細(xì)胞凋亡率明顯下降(**P<0.05)，見圖3H、3I。

**P<0.05

3 討 論

缺氧會(huì)嚴(yán)重?fù)p傷心肌組織，并影響重要的細(xì)胞功能，如增殖和凋亡。缺氧也可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞中細(xì)胞因子的過表達(dá)，誘發(fā)炎癥反應(yīng)，促炎細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素IL-6和IL-8與心臟病特別是心衰、心梗、心肌病密切相關(guān)。

LncRNA能夠影響一系列蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄，這一過程是通過其自身轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平進(jìn)行調(diào)節(jié)的，它可以作為多種細(xì)胞機(jī)制的核心因子，來(lái)參與細(xì)胞周期、生長(zhǎng)和凋亡等多種生理過程，從而調(diào)控多種疾病的發(fā)生和發(fā)展。隨著近幾年全基因組分析等技術(shù)的快速發(fā)展，針對(duì)LncRNA GAS5的研究逐漸增多，它在生理功能和疾病發(fā)生發(fā)展過程中所起的作用也被揭示開來(lái)[9-10]。據(jù)報(bào)道，在心肌梗死誘導(dǎo)的大鼠和大鼠心肌細(xì)胞模型中，敲低GAS5可促進(jìn)細(xì)胞存活，抑制細(xì)胞凋亡[11]。早前有研究表明，對(duì)lncRNA GAS5的抑制作用可以通過靶向miR-222-3p[12]來(lái)保護(hù)大鼠心肌細(xì)胞H9C2免受缺氧損傷。

在哺乳動(dòng)物中，JAK家族由4個(gè)成員組成，它們分別是JAK1、JAK2、JAK3和Tyk2，除JAK3外，其余均在心肌中表達(dá)。STAT家族是一組潛在的細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)錄因子，其成員是JAK家族中依賴?yán)野彼崃姿峄南掠伟悬c(diǎn)。STAT1家族的所有成員，即STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B和STAT6，均在心臟組織中表達(dá)。研究表明，在受到缺血刺激的新生大鼠的研究中，STAT1/3會(huì)因受到缺血的刺激而被激活從而誘發(fā)心肌細(xì)胞凋亡[13]。酪氨酸激酶抑制劑是一種JAK抑制劑，主要阻斷JAK1和JAK2。這一作用主要抑制STAT3，以緩解缺血再灌注后的心肌梗死。JAK/STAT通路能夠?qū)⑿盘?hào)由細(xì)胞表面?zhèn)鬟f到細(xì)胞核內(nèi)，進(jìn)而調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，由此可以看出這是一種應(yīng)激反應(yīng)機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，心肌在缺血再灌注時(shí)JAK1/STAT3信號(hào)通路可以被快速激活，因此，JAK1/STAT3信號(hào)通路在心血管疾病中能夠發(fā)揮重要作用[14]。

本研究將H9C2細(xì)胞暴露于缺氧條件下誘導(dǎo)細(xì)胞缺氧損傷，以便進(jìn)行體外相關(guān)分析。為了證實(shí)缺氧H9C2模型的建立，在顯微鏡下觀察了暴露后0、12和24 h細(xì)胞形態(tài)的變化，越來(lái)越明顯的空泡化表明低氧誘導(dǎo)了H9C2細(xì)胞死亡。此外，功能分析也證實(shí)了缺氧組發(fā)生缺氧損傷。與正常組相比，缺氧組心肌細(xì)胞的細(xì)胞活力降低、炎癥細(xì)胞因子表達(dá)水平和凋亡率增加。本研究通過對(duì)si-GAS5轉(zhuǎn)染后H9C2細(xì)胞的細(xì)胞活力、凋亡和炎癥細(xì)胞因子等不同參數(shù)的觀察，證實(shí)了GAS5下調(diào)對(duì)缺氧損傷后的H9C2細(xì)胞的保護(hù)作用。研究結(jié)果與之前的研究結(jié)果[15]一致。本研究中與正常的H9C2相比，缺氧細(xì)胞中JAK1和STAT3的mRNA表達(dá)量較高。此外，JAK1和STAT3與GAS5呈正相關(guān)。AG490使用后，JAK1和STAT3得到有效抑制，GAS5的RNA表達(dá)。這一現(xiàn)象進(jìn)而表明，GAS5可以被JAK1/STAT3信號(hào)通路調(diào)控，同時(shí)，酪氨酸激酶抑制劑可促進(jìn)細(xì)胞活力，減輕細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)。這表明JAK1/STAT3信號(hào)通路的失活可改善H9C2細(xì)胞的缺氧損傷。

綜上所述，本研究中l(wèi)ncRNA GAS5在缺氧處理的心肌細(xì)胞中均有大量表達(dá)，下調(diào)GAS5可使心肌細(xì)胞免受缺氧損傷，JAK1/STAT3信號(hào)通路在缺氧細(xì)胞中被激活，并可通過抑制GAS5而失活。此外，應(yīng)用JAK1/STAT3通路抑制劑AG490可抑制細(xì)胞中的GAS5，從而減輕缺氧損傷。因此，lncRNA GAS5可以通過調(diào)控JAK1/STAT3通路減輕心肌H9C2細(xì)胞的缺氧損傷。然而，我們?cè)诒狙芯恐械陌l(fā)現(xiàn)僅基于體外實(shí)驗(yàn)的發(fā)現(xiàn)，這需要在動(dòng)物和臨床試驗(yàn)中進(jìn)行更深入的研究。