不同年齡段食蟹猴骨礦含量與骨密度測定分析

韋祝梅,申 果,李振明,曾 勇,季 風(fēng),楊繼紅

(1.廣西華仁醫(yī)學(xué)科技集團(tuán)有限公司,南寧 530000;2.廣西科學(xué)院醫(yī)學(xué)與健康研究院,南寧 530000;3.廣西瑋美生物科技有限公司,南寧 530021)

食蟹猴是獼猴屬動物之一，是人類的近屬動物，在形態(tài)、生殖、代謝等方面與人類非常相似。食蟹猴在遺傳物質(zhì)上與人有75.0%～98.5%的同源性［1］，并且它們經(jīng)常性保持直立體位，生物力學(xué)與人類最為相近。食蟹猴體內(nèi)器官系統(tǒng)包括消化系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)等，其飲食要求、組織器官、骨生物力學(xué)特性、雌性動物性周期與人類相似，骨代謝也與人類接近。因此作為非人靈長類動物的重要一員，食蟹猴是進(jìn)行生物醫(yī)學(xué)研究較為理想的實(shí)驗(yàn)動物［2］。目前，在骨質(zhì)疏松癥藥物治療評價中就有研究選擇食蟹猴作為實(shí)驗(yàn)?zāi)?型 動 物［3］，以 骨 礦 含 量（bone mineral content，BMC）和骨密度（bone mineral dendity，BMD）降低到一定的標(biāo)準(zhǔn)作為造模成功的依據(jù)。BMC是指骨骼中的礦物質(zhì)含量，以克（g）表示；BMD是指單位面積的骨礦含量，以克每平方厘米（g/cm2）表示［4］。BMD和BMC的測定值是骨鈣沉積狀況的一種定量指標(biāo)，能夠比較精確地反映骨骼的發(fā)育及成熟狀態(tài)，也是目前人類診斷骨質(zhì)疏松的重要手段［5-6］。然而不同動物的骨骼發(fā)育情況不同，不同動物在不同年齡不同部位的BMD和BMC值差異大。食蟹猴作為理想的實(shí)驗(yàn)動物，在骨骼發(fā)育和骨質(zhì)疏松的研究中具有巨大的價值，只有建立完整、準(zhǔn)確的骨骼數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)，掌握健康食蟹猴的正常BMD和BMC值，才能在評價食蟹猴骨質(zhì)疏松癥模型造模結(jié)果評價方面有更加確切的依據(jù)，這對于后續(xù)實(shí)驗(yàn)效果的評價也至關(guān)重要。

目前臨床和科研常用的BMD測量方法有雙能X線吸收檢測法（dualenergy X-ray absorptiometry，DXA）、定量計算機(jī)斷層攝影術(shù)（quantitative computed tomography，QCT）、外周QCT（peripheral quantitative computed tomography，pQCT）和定量超聲（quantitative ultrasound，QUS）等多種方法，其中基于DXA測量結(jié)果是骨質(zhì)疏松癥診斷金標(biāo)準(zhǔn)［7］。判斷人類及實(shí)驗(yàn)動物骨質(zhì)健康狀況均是基于DXA測量結(jié)果。因此，同性別、同品種健康食蟹猴骨峰值的準(zhǔn)確數(shù)據(jù)是骨質(zhì)疏松癥模型研究所必需的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)通過對健康雄性和雌性食蟹猴各個年齡階段283只的大樣本量DXA測量，獲得1～15歲及15歲以上全年齡段、不同性別的健康食蟹猴BMD和BMC的標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)和變化趨勢，為食蟹猴骨骼生長發(fā)育特點(diǎn)提供數(shù)據(jù)支持，為以食蟹猴為模式動物的骨科疾病的研究提供可供參考的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

283只普通級食蟹猴，年齡1～19歲，其中雄性187只，雌性96只。分為雄性和雌性不同年齡段：1歲≤年齡＜3歲（1～2）組（雄性10只，雌性10只）、3歲≤年齡＜5歲（3～4）組（雄性20只，雌性14只）、5歲≤年齡＜7歲（5～6）組（雄性10只，雌性10只）、7歲≤年齡＜9歲（7～8）（雄性16只，雌性11只）組、9歲≤年齡＜11歲（9～10）（雄性28只，雌性12只）組、11歲≤年齡＜13歲（11～12）組（雄性10只，雌性12只）、13歲≤年齡＜15歲（13～14）組（雄性21只，雌性0只）、年齡≥15歲（≥15）組（雄性72只，雌性27只）。動物由廣西瑋美生物科技有限公司提供［SCXK（桂）2012-0004］。動物均飼養(yǎng)于普通級動物房內(nèi)，檢測血液學(xué)、血生化等指標(biāo)未見異常，無運(yùn)動障礙。環(huán)境溫度：16～28℃，相對濕度：40%～80%，自然光照，大欄飼養(yǎng)，每天飼喂食蟹猴專用顆粒料2次，分別在7:30和17:00投喂專用飼料，自由飲水，每天14:00點(diǎn)投喂蘋果約半個/只。項(xiàng)目在廣西瑋美生物科技有限公司實(shí)驗(yàn)部完成［SYXK（桂）2013-0008］，本實(shí)驗(yàn)中動物飼養(yǎng)、麻醉及檢測等操作均符合中華人民共和國《實(shí)驗(yàn)動物管理?xiàng)l例》和《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動物指導(dǎo)性意見》的要求。

1.2 實(shí)驗(yàn)器材

TC30K電子天平（常熟市雙杰測試儀器廠，中國）；雙能X線骨密度儀（DEXA）（Discovery Wi，美國）。

1.3 食蟹猴骨密度與骨礦含量的測量

（1）DEXA測量儀器：采用美國HOLOGIC生產(chǎn)的雙能X線骨密度儀（DEXA）測量骨密度與骨礦含量。

（2）DEXA測量方法：動物于測量前一天晚17:00后禁食，自由飲水，次日早餐禁食。稱量動物的體質(zhì)量，測體溫，查看糞便和精神狀況，確保動物健康。使用麻醉藥物前15 min核對確認(rèn)動物ID牌，肌內(nèi)注射硫酸阿托品劑量為0.01 mg/kg。肌內(nèi)注射麻醉藥舒泰50劑量為2.5 mg/kg。動物麻醉后根據(jù)儀器SOP進(jìn)行掃描，見圖1。結(jié)束確認(rèn)動物的心跳、血壓、體溫生命體征恢復(fù)正常后放回原籠。

圖1 雙能X線骨密度儀測量食蟹猴的骨密度和骨礦含量Figure 1 Bone mineral density（BMD）and bone mineral content（BMC）of cynomolgus monkeys were measured by dual-energy X-ray absorptiometry

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析

2 結(jié)果

2.1 食蟹猴BMC和BMD不同年齡段測量結(jié)果和變化

通過骨密度儀對283只動物進(jìn)行全身掃描，得出不同年齡段雄性和雌性食蟹猴全身總和的BMC和BMD，如表1所示。

雄性食蟹猴在1～12歲時，BMC值隨著年齡的增長而顯著升高。BMC由1～2歲的67.38 g增長到12歲的399.15 g，增長了5.92倍，平均年增長30.16 g；其中增長幅度最大的年齡是3～6歲，平均增長率為45.15 g/年。13歲以后的老年雄性食蟹猴BMC值呈下降趨勢，但下降不明顯；13～14歲的BMC值為368.37 g，≥15歲時維持在（367.51±7.17）g。1～8歲BMD逐年增長，從0.32 g/m2增加到0.57 g/m2；8～15歲的BMD相對穩(wěn)定，維持在（0.57±0.05）～（0.56±0.06）g/m2。

雌性食蟹猴在1～10歲時，BMC值隨著年齡的增長而顯著升高。BMC由1～2歲的58.84 g增長到10歲的233.29 g，增長了3.96倍，平均增長率為19.38 g/年；10歲后BMC值呈下降趨勢，且下降顯著。11～12歲BMC值為208.05 g，13～14歲缺乏數(shù)據(jù)（從表1判斷，13～14歲BMC值大約為180 g左右），15歲后降到166.63 g，平均下降率為13.33 g/年，15歲后較10歲時的BMC下降了28.6%，平均每年下降5.72%。1～10歲BMD逐年增加，從0.31 g/m2增加到0.47 g/m2；10～15歲的BMD相對穩(wěn)定，維持在（0.47±0.03）～（0.46±0.00）g/m2。

表1 雄性和雌性食蟹猴不同年齡的骨密度和骨礦含量Table 1 Bone mineral density(BMD)and bone mineral content(BMC)of male and female cynomolgus monkeys at different ages（±s）

表1 雄性和雌性食蟹猴不同年齡的骨密度和骨礦含量Table 1 Bone mineral density(BMD)and bone mineral content(BMC)of male and female cynomolgus monkeys at different ages（±s）

注：同性別與前一年齡段比較，★P＜0.05，★★P＜0.01；同年齡段不同性別之間的比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。Note：Comparisons between same sex at different ages，★P＜0.05，★★P＜0.01.Comparisons between different sexes of the same age group，△P＜0.05，△△P＜0.01.BMC：Bone mineral content；BMD：Bone mineral density.

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雄性食蟹猴和雌性食蟹猴的BMC在每個年齡段都有顯著差異，在3歲后的每個年齡段都有極顯著差異。雌性食蟹猴進(jìn)入中青年期后BMC比雄性的低，在骨量峰期（9～10歲）時雄性食蟹猴的全身BMC總和是雌性食蟹猴BMC總和的1.93倍，10歲以后，雌性食蟹猴的BMC下降速度比雄性食蟹猴快，15歲后老年雄性食蟹猴的BMC是雌性的2.25倍。1～4歲雄性食蟹猴和雌性食蟹猴的BMD無明顯差異，5歲后雄性食蟹猴每個年齡段的BMD都顯著高于雌性食蟹猴。

2.2 不同年齡食蟹猴各部位BMD隨年齡變化

2.2.1 雄性食蟹猴不同年齡不同部位BMD變化

雄性食蟹猴不同年齡不同部位BMD變化如表2所示。對不同年齡段各組雄性食蟹猴不同部位的BMD結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，1～2歲組與3～4歲組間，3～4歲和5～6歲組間各部位BMD差異顯著（P＜0.01），即在1～6歲雄性食蟹猴全身各部位BMD均隨年齡增長而顯著增加，之后BMD變化不明顯。從不同部位的數(shù)據(jù)比較來看，BMD最高的是頭部，最低的是手臂：頭部＞脊柱＞骨盆＞手臂≈雙腿。

2.2.2 雌性食蟹猴不同年齡不同部位BMD變化

對不同年齡段各組雌性食蟹猴不同部位的BMD結(jié)果（暫缺13～14歲數(shù)據(jù)）進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，1～2歲組與3～4歲組間各部位BMD差異顯著（P＜0.01），即在1～4歲雄性食蟹猴全身各部位BMD均隨年齡增長而顯著增加，之后BMD變化不明顯。從不同部位的數(shù)據(jù)比較來看，BMD最高的也是頭部，最低的也是手臂，頭部＞脊柱＞骨盆＞手臂≈雙腿。雌性食蟹猴不同年齡不同部位BMD變化詳見表2。

2.2.3 雄性和雌性食蟹猴不同部位BMD變化比較

在脊柱BMD方面，雄性和雌性食蟹猴脊柱BMD在5歲之前差異不顯著，在1～2歲的測量值都在0.39 g/cm2左右，在3～4歲的測量值都在0.52 g/cm2左右，從5歲開始，脊柱BMD在雄性和雌性之間開始有顯著差異，5～6歲雄性值在0.71 g/cm2左右，雌性值在0.55 g/cm2左右，雄性BMD顯著大于雌性，并在之后一直保持著顯著性差異（P＜0.01），詳見表2。

骨盆BMD的變化規(guī)律和脊柱BMD一致，雄性和雌性食蟹猴骨盆BMD在5歲之前差異不顯著，在1～2歲的測量值都在0.35 g/cm2左右，在3～4歲的測量值都在0.44 g/cm2左右，從5歲開始，骨盆BMD在雄性和雌性之間開始有顯著差異，5～6歲雄性值在0.53 g/cm2左右，雌性值在0.46 g/cm2左右，雄性BMD顯著大于雌性，并在之后一直保持著顯著性差異（P＜0.01），詳見表2。

表2 雄性和雌性食蟹猴不同年齡不同部位的骨密度變化Table 2 Changes in bone mineral density of different body parts in male and female cynomolgus monkeys at different ages（±s）

表2 雄性和雌性食蟹猴不同年齡不同部位的骨密度變化Table 2 Changes in bone mineral density of different body parts in male and female cynomolgus monkeys at different ages（±s）

注：同性別與前一年齡段比較，★P＜0.05，★★P＜0.01；同年齡段不同性別之間的比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。Note：Comparisons between same sex at different ages，★P＜0.05，★★P＜0.01.Comparisons between different sexes of the same age group，△P＜0.05，△△P＜0.01.

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手臂BMD在5歲之前性別差異不顯著，在1～2歲的測量值都在0.2 g/cm2左右，在3～4歲的測量值都在0.3 g/cm2左右，5歲以后，雄性食蟹猴各年齡段手臂BMD都比雌性食蟹猴大（除雌性食蟹猴13～14歲數(shù)據(jù)缺乏外），差異顯著（P＜0.01），詳見表2。

雙腿BMD在5歲之前性別差異不顯著，在1～2歲的測量值都在0.26 g/cm2左右，在3～4歲的測量值都在0.34 g/cm2左右，5歲以后，雄性食蟹猴各年齡段雙腿BMD都比雌性食蟹猴大，差異顯著（P＜0.01），詳見表2。

頭骨BMD在7歲之前性別差異不顯著，在1～2歲的測量值都在0.61 g/cm2左右，在3～4歲的測量值都在0.97 g/cm2左右，在5～6歲的測量值都在1.15 g/cm2左右。6歲以后，雄性食蟹猴的各年齡段頭骨BMD都比雌性食蟹猴大，差異顯著（P＜0.01），詳見表2。

全身骨BMD變化和脊柱BMD、盆骨BMD值變化規(guī)律一致。雄性和雌性食蟹猴全身平均BMD在5歲之前差異不顯著，在1～2歲的平均值都在0.32 g/cm2左右，在3～4歲的測量值都在0.42 g/cm2左右，從5歲開始，骨盆BMD在雄性和雌性之間開始有顯著差異，5～6歲雄性值在0.53 g/cm2左右，雌性值在0.44 g/cm2左右，雄性BMD顯著大于雌性，并在之后一直保持著顯著性差異（P＜0.01），詳見表2。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)主要研究健康食蟹猴不同年齡段、不同性別骨骼發(fā)育特點(diǎn)。食蟹猴的壽命約30歲，4歲性成熟，絕經(jīng)期一般在15歲后。根據(jù)食蟹猴的生理發(fā)育情況，為觀察未成年、成年后以及老年食蟹猴BMC和BMD的變化，本研究將不同性別的食蟹猴按不同年齡分組。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，雄性食蟹猴1～12歲是骨骼發(fā)育期，雌性食蟹猴1～10歲是骨骼發(fā)育期，其中1～6歲時的骨骼發(fā)育是以快速生長為主，這個時期是食蟹猴的成長期。之后骨骼繼續(xù)發(fā)育成熟，雄性食蟹猴BMC和BMD峰值出現(xiàn)在11～12歲，12～15歲骨吸收大于骨形成，骨量逐漸丟失。而雌性食蟹猴BMC和BMD峰值出現(xiàn)在9～10歲，10歲后BMC開始顯著下降。此結(jié)論與蔡敏的研究結(jié)果相似：小于10歲的雌性食蟹猴BMC和BMD與年齡呈正相關(guān)，大于10歲則呈負(fù)相關(guān)［8］。雌性食蟹猴的BMC峰值比雄性低很多，僅相當(dāng)于雄性食蟹猴的58%，BMD峰值相當(dāng)于雄性食蟹猴BMD峰值的80%，這與人類男性BMD高于女性BMD的現(xiàn)象一致。雌性食蟹猴BMC丟失要開始得更早，從10歲起雌性食蟹猴BMC開始顯著下降，之后每個年齡段BMC都顯著下降，這可能是因?yàn)檫M(jìn)入衰老期的雌性食蟹猴BMC受雌激素降低的影響較大［9-10］。對比人體骨骼發(fā)育，有研究［11］表明人類BMC和BMD值在30歲以前呈增加趨勢，30～40歲的BMC和BMD達(dá)到一生的峰值期，此后隨年齡增加，骨量逐漸丟失，BMC和BMD呈現(xiàn)下降趨勢。BMD峰值期過后，破骨細(xì)胞相對活躍，開始出現(xiàn)生理性的骨量減少，骨質(zhì)總量以每年0.2%～0.5%的速度遞減。和人類相比，食蟹猴的10歲骨骼狀態(tài)相當(dāng)于人類的30歲骨骼狀態(tài)，10歲之后食蟹猴每年骨量丟失的速度約為人骨量丟失速度的10倍。

食蟹猴身體不同部位的BMD數(shù)值從大到小依次為頭部＞脊柱＞骨盆＞手臂≈雙腿，雄性和雌性規(guī)律一致，即頭部BMD最大，四肢最小，且雄性猴各部位的BMD均比雌性的高。Black等［12］研究發(fā)現(xiàn)不同年齡段雄性食蟹猴的BMD高于雌性。Cerroni等［13］對不同年齡段恒河猴的骨密度研究表明雄性的BMD高于雌性。本研究得到了相似的結(jié)果，即各年齡段的雄性食蟹猴的BMD高于雌性。本研究中年齡區(qū)間分得更小，對食蟹猴的BMD變化體現(xiàn)得更詳細(xì)。在不同部位的BMD中，頭骨的BMD隨著年齡的變化最明顯，這與王曉達(dá)等［14］的研究結(jié)果一致。其他部位的BMD在食蟹猴6歲后相對穩(wěn)定，10歲左右進(jìn)入衰老期后也未出現(xiàn)明顯下降，這和人類老年階段BMD自然減少的規(guī)律不一致，原因可能是頭骨面積比較穩(wěn)定，當(dāng)進(jìn)入衰老期時，BMD隨著骨量丟失而降低，而其他部位雖然骨量丟失，但是骨面積也變小，表現(xiàn)為衰老期猴的體長變小等，所以BMD變化不大；或者可能與頭骨松質(zhì)骨相對較多有關(guān)，因?yàn)樗少|(zhì)骨積累和丟失的速度均快于皮質(zhì)骨，具體原因需要改進(jìn)方案延長選用猴的年齡段，測量其骨密度，更加完整地監(jiān)測食蟹猴BMD的變化規(guī)律。

隨著年齡增長骨密度降低可能會導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生，食蟹猴BMC及BMD隨著年齡增長的變化和達(dá)到峰值骨量后的變化與人類的生理過程十分相似，因此食蟹猴是研究人類BMD、骨質(zhì)疏松和骨質(zhì)減少的良好模型。本研究測量的不同性別、不同年齡段的BMC和BMD變化，為以食蟹猴為模式動物的骨科疾病的研究提供了可供參考的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

[醫(yī)學(xué)倫理聲明Medical Ethics Statement]

所有實(shí)驗(yàn)操作均在廣西瑋美生物科技有限公司（擁有AAALAC完全認(rèn)證）實(shí)驗(yàn)部完成，實(shí)驗(yàn)過程遵照中國實(shí)驗(yàn)動物相關(guān)法律法規(guī)條例要求進(jìn)行，包括《實(shí)驗(yàn)動物管理?xiàng)l例》（2017年3月1日）和《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動物指導(dǎo)性意見》（2006年9月30日）。

All experimental operations were completed in the Experimental Department of Guangxi Weimei Bio-tech Co.,Ltd,which has been certified by AAALAC.All experimental procedures were performed in accordance with the requirements of laws and regulations in China related to experimental animals,includingAnimal Management Regulations(01/03/2017),Laboratory Animal:Guidance on the Treatment of Experimental Animals(30/09/2006),and so on.

[作者貢獻(xiàn)Author Contribution]

韋祝梅負(fù)責(zé)文章的材料收集和整理，并結(jié)合實(shí)踐進(jìn)行文章撰寫；申果負(fù)責(zé)文章摘要的翻譯以及材料整理；李振明、曾勇、季風(fēng)對全文的數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性進(jìn)行確認(rèn)，并提出修改建議；楊繼紅對全文內(nèi)容提供指導(dǎo)。

[利益聲明Declaration of Interest]

所有作者均聲明本文不存在利益沖突。