Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化壯藥三角泡中黃酮成分提取工藝及抗氧化作用研究

李 澄，黃文婧，廖 強(qiáng)，郭振旺

（1.廣西國(guó)際壯醫(yī)醫(yī)院，廣西 南寧 530000；2.廣西艾為科技有限公司，廣西 南寧 530000；3.南寧市食品藥品檢驗(yàn)所，廣西 南寧 530000；4.廣西中醫(yī)學(xué)校，廣西 南寧 530000）

三角泡為無患子科植物倒地鈴Cardiosperminum halicacabum Linn.的干燥全草，壯藥名為棵燈籠Godaengloengz。壯醫(yī)認(rèn)為三角泡具有清熱毒、除濕毒、通氣道的功效，主要用于治療貨煙媽（咽炎）等癥[1]?，F(xiàn)代研究[2]表明，三角泡中含有多種黃酮類成分，如槲皮素、木犀草素、芹菜素、金圣草黃素等。綜合文獻(xiàn)[3-4]分析，三角泡治療貨煙媽（咽炎）的功效，可能與其黃酮類成分通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激，從而抑制炎性介質(zhì)的產(chǎn)生有關(guān)。鑒于此，本研究以三角泡中槲皮素、木犀草素、芹菜素3種黃酮類成分的含量為考察指標(biāo)，采用Box-Behnken響應(yīng)面法，優(yōu)化提取工藝，并對(duì)獲得的提取物進(jìn)行抗氧化作用研究，以期為壯藥三角泡的開發(fā)應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器Waters e2695型高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司）；XS-205型電子天平（瑞士梅特勒公司）；Multiskan Go型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（美國(guó)賽默飛公司）。

1.2 試藥槲皮素（批號(hào)：100081-200904）、木犀草素（批號(hào)：111520-201605）、芹菜素（批號(hào)：111901-201603）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；三角泡采自廣西武鳴縣大明山，經(jīng)南寧市食品藥品檢驗(yàn)所廖強(qiáng)副主任中藥師鑒定為無患子科植物倒地鈴Cardiosperminum halicacabum Linn.的干燥全草；2，2-二苯基-1-苦肼基（DPPH）（批號(hào)：D807297）、2，2-聯(lián)氨-雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二氨鹽（ABTS）（批號(hào)：A800764）均購(gòu)自麥克林公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件色譜柱：Agilent Zorbox SB-C18柱（4.6 mm×250mm，5μm），線性梯度洗脫，洗脫程序見表1；流速為1mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為350 nm；柱溫為25℃；進(jìn)樣量為10 μL。相關(guān)色譜圖見圖1。

圖1 HPLC圖

表1 梯度洗脫條件

2.2混合對(duì)照品溶液的制備 取槲皮素43.3 mg、木犀草素27.4mg、芹菜素24.1mg，配置成質(zhì)量濃度分別為0.866 0、0.548 0、0.4820mg/mL的混合對(duì)照品貯備液。取混合對(duì)照品貯備液1.0 mL，稀釋，即得含槲皮素（86.60 μg/mL）、木犀草素（54.80 μg/mL）、芹菜素（48.20 μg/mL）的混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備取三角泡藥材粉末1.0 g，置25 mL容量瓶中，加甲醇超聲提取20 min，過濾，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察 取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00 mL，分別置于10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，測(cè)定，得回歸方程及線性范圍。（見表2）

表2 回歸方程及線性范圍

2.4.2 精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄各色譜峰峰面積，計(jì)算得槲皮素、芹菜素、木犀草素峰面積的RSD值分別為0.56%、0.68%、0.45%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于制備后0、2、4、8、12 h進(jìn)樣，記錄色譜峰，計(jì)算得槲皮素、芹菜素、木犀草素峰面積的RSD值分別為1.12%、0.98%、1.35%，表明供試品穩(wěn)定性良好。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 按“2.3”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液6份，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算得槲皮素、芹菜素、木犀草素含量分別為2.18、1.42、0.97 mg/g，RSD值分別為1.21%、1.02%、0.87%，表明本試驗(yàn)重復(fù)性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的三角泡樣品6份，每份0.5 g，置25 mL容量瓶中，加混合對(duì)照品貯備液1.5 mL，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見表3。

表3 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

續(xù)表3：

2.5 響應(yīng)面法優(yōu)化三角泡提取工藝

2.5.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與試驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的初步結(jié)果，以乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間及提取溫度為主要考察因素，分別用X1、X2、X3、X4來表示，并以1、0、-1分別表示自變量的高低水平，分別以槲皮素、芹菜素、木犀草素的總提取值為響應(yīng)值。設(shè)計(jì)的試驗(yàn)因素和水平取值見表4。

2.5.2 模型建立與顯著性檢驗(yàn) 利用Design expert 10.0.4軟件對(duì)四因素三水平共27個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)進(jìn)行編碼，見表5。

表5 BBD實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

續(xù)表5：

根據(jù)表5的結(jié)果，進(jìn)行多元二次回歸分析，二次模型中回歸系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)見表6。方差的結(jié)果分析，模型的顯著性值P＜0.000 1，表示二次多項(xiàng)模型高度顯著，可充分代表響應(yīng)值（總提取值）與4個(gè)變量X1、X2、X3、X4的關(guān)系。根據(jù)ANOVA的分析表明總提取值的決定系數(shù)R2為93.43%，模型F值為12.20，表明模型擬合度良好。從表6可以看出，X1、X2、X3、X4均為極顯著水平（P＜0.01），根據(jù)比較F值，表明各因素對(duì)三角泡提取的影響程度依次為X2＞X4＞X3＞X1，交互項(xiàng)對(duì)提取值的影響依次為X2X4、X1X2、X1X3、X1X4、X3X4、X2X3。各試驗(yàn)因子對(duì)響應(yīng)值的影響呈顯著的線性關(guān)系，回歸方程分別為：

表6 變量與響應(yīng)值方差分析

2.5.3 響應(yīng)面分析與優(yōu)化 為說明交互項(xiàng)中乙醇濃度與料液比（X1X2）、乙醇濃度與提取時(shí)間（X1X3）、乙醇濃度與提取溫度（X1X4）、料液比與提取時(shí)間（X2X3）、料液比與提取溫度（X2X4）、提取時(shí)間與提取溫度（X3X4）的交互作用對(duì)三角泡中3種黃酮類成分的總提取值的影響，繪制響應(yīng)面圖和等高線圖，響應(yīng)曲面越陡說明各因素之間的相互作用越顯著，對(duì)提取值的影響依次為X2X4＞X1X2＞X1X3＞X1X4=X3X4＞X2X3。（見圖2）

圖2 X1、X2、X3、X4交互影響對(duì)三角泡總提取值的響應(yīng)曲面圖和等高線圖

2.5.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 軟件預(yù)測(cè)最佳因素條件為乙醇濃度80.00%，料液比1∶37.49，提取時(shí)間41.18 min，提取溫度68.36℃，在此條件下三角泡中槲皮素、木犀草素和芹菜素的總提取值為4.315 mg/g。為方便進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，修正為乙醇濃度80%，料液比1∶37，提取時(shí)間40 min，提取溫度68℃。平行提取3份藥材，總提取值分別為4.324、4.316、4.278 mg/g，平均值為4.306 mg/g，偏差為0.21%，表明實(shí)測(cè)值和預(yù)測(cè)值擬合較好。

2.6 抗氧化試驗(yàn)與結(jié)果

2.6.1 三角泡提取物制備 三角泡藥材粉碎，過20目篩樣品粉末10 g，按照“2.5.4”項(xiàng)下條件提取，減壓抽濾，蒸干，備用。

2.6.2 DPPH清除自由基能力 取DPPH 25.4 mg，無水乙醇溶解至100 mL，備用，使用時(shí)再稀釋10倍；樣品濃度設(shè)置為5個(gè)梯度（20、40、60、80、100 mg/mL），將每種供試品溶液分別取20 μL加樣到96孔板中，再在每個(gè)孔中平行加入180 μL DPPH溶液。同時(shí)設(shè)立對(duì)照組、空白組。避光反應(yīng)30 min。在波長(zhǎng)515 nm處測(cè)定。

2.6.3 ABTS+自由基清除能力 配制3 mL的7 mmol/L ABTS和3 mL的2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液混合，避光過夜，得到ABTS+自由基儲(chǔ)備液。使用前加70%乙醇調(diào)至吸光度為0.700±0.005，在96孔板中每孔加入40 μL的樣品，樣品設(shè)置5個(gè)濃度（20、40、60、80、100 mg/mL），再加入160 μL ABTS+自由基工作液，以200 μL 70%乙醇為空白，混合10 s，避光靜置6 min，734 nm波長(zhǎng)測(cè)定。

2.6.4 羥基自由基清除能力[5-6]采用Fenton反應(yīng)，其機(jī)制為H2O2與Fe2+反應(yīng)產(chǎn)生·OH，在該體系中加入水楊酸捕捉·OH并產(chǎn)生有色物質(zhì)，抗氧化物清除·OH而使體系顏色變淺，可間接檢測(cè)·OH含量。取20、40、60、80、100 mg/mL樣品溶液各400 μL，依次加入9.0 mmol/L FeSO4溶液、9.0 mmol/L水楊酸-乙醇溶液、8.8 mmol/L H2O2溶液各200 μL，混勻后37℃靜置30 min，在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以蒸餾水作空白組。

2.6.5 抗氧化結(jié)果 清除率的計(jì)算公式：清除率=[1-(A給藥-A空白)/A對(duì)照]×100%。

結(jié)果表明，三角泡提取物清除DPPH及ABTS+自由基的能力均與濃度有劑量依賴性，濃度越高，清除能力越強(qiáng)，清除DPPH自由基、ABTS+自由基及羥基自由基的IC50值分別為46.99、45.72、44.21 mg/mL。（見圖3）

圖3 三角泡提取物對(duì)DPPH、ABTS+及羥基自由基的清除能力比較

3 討 論

若以單一成分作為提取工藝的檢測(cè)指標(biāo)，對(duì)藥物活性成分的檢測(cè)則較為片面，得到的提取物可能導(dǎo)致某些活性成分的缺失。以多個(gè)成分為檢測(cè)指標(biāo)，可以較為全面地將藥材中發(fā)揮藥效作用的物質(zhì)盡可能多的納入考察范圍內(nèi)，可提高提取物中活性成分的含量及精準(zhǔn)性[7-9]。本研究主要是圍繞壯藥三角泡中黃酮類成分的提取來制定提取工藝方法，除了選擇3個(gè)黃酮類成分作為考核指標(biāo)外，還增加了總提取值來進(jìn)行綜合考察，力求能單一成分及綜合成分兼顧，來提高評(píng)價(jià)指標(biāo)的客觀性。

中草藥中活性成分的提取工藝研究常用的方法有正交設(shè)計(jì)法、響應(yīng)面分析法，兩種方法都具有試驗(yàn)次數(shù)少、周期短的特點(diǎn)，但是相比之下，響應(yīng)面分析法能更好地研究各因素之間的交互作用。此外，響應(yīng)面分析法在對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析時(shí)，可通過做出響應(yīng)面圖及其等高線，得到兩個(gè)因素的交互影響作用及各因素的最佳范圍，利用線性關(guān)系回歸方程，確定在試驗(yàn)范圍內(nèi)的任何試驗(yàn)點(diǎn)的預(yù)測(cè)值[10-13]。本研究預(yù)測(cè)最佳因素條件為乙醇濃度80.00%，料液比1∶37.49，提取時(shí)間41.18 min，提取溫度68.36℃，在此條件下三角泡中槲皮素、木犀草素和芹菜素的總提取值為4.134 mg/g。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果總提取值分別為4.324、4.316、4.278 mg/g，平均值為4.306 mg/g，偏差為0.21%，證明該工藝穩(wěn)定，重現(xiàn)性好。

酚類化合物是常見的抗氧化劑，酚類化合物抗氧化的原理主要是通過酚羥基的抽氫反應(yīng)直接清除自由基[14-16]。黃酮類化合物是具有酚羥基結(jié)構(gòu)的一類化合物，其多種藥理活性均有可能是其酚羥基通過抗氧化活性而產(chǎn)生效應(yīng)[17-20]。為了驗(yàn)證三角泡中黃酮類成分的抗氧化活性，本研究對(duì)三角泡提取物的抗氧化活性進(jìn)行了研究。三角泡提取物清除DPPH及ABTS+自由基的能力均與濃度呈劑量依賴性，濃度越高，清除能力越強(qiáng)。其清除DPPH自由基、ABTS+自由基及羥基自由基的IC50值分別為46.99、45.72、44.21 mg/mL，結(jié)果表明三角泡提取物具有一定的抗氧化活性，其黃酮類化合物應(yīng)為其抗氧化活性成分之一。