羔羊被動免疫建立過程及檢測方法研究進(jìn)展

田星哲，田沛知，李金輝，楊彩虹，嚴(yán) 慧，張英杰，紀(jì)守坤，劉月琴

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，河北保定 071000）

羔羊出生時(shí)自身免疫系統(tǒng)發(fā)育不健全，難以產(chǎn)生自身抗體，需要從母畜獲得抗體建立被動免疫，因此初乳成為羔羊獲得抗體，建立生命早期免疫力的唯一途徑。哺乳期羔羊血清IgG 含量低，免疫力弱是羔羊患病和死亡的主要原因，羔羊受母羊生理狀況，初乳質(zhì)量、初乳攝入時(shí)間等因素影響存在被動免疫轉(zhuǎn)移失敗的風(fēng)險(xiǎn)。羔羊被動免疫水平會顯著影響哺乳期的患病率、死亡率和生長性能。圍繞被動免疫建立過程和檢測方法，前人在犢牛上已進(jìn)行了大量研究，但在羔羊上的研究較少。目前羔羊被動免疫的建立沒有成熟的理論體系支撐，無法有效幫助羔羊建立被動免疫，同時(shí)羊具有多羔特點(diǎn)，羊初乳產(chǎn)量和成分也與牛初乳存在顯著差異，因此本文對羔羊被動免疫建立過程和檢測方法進(jìn)行綜述，為通過提高羔羊被動免疫成功率保障羔羊哺乳期健康提供指導(dǎo)。

1 羔羊被動免疫建立過程

1.1 羊初乳中的營養(yǎng)素與免疫成分 初乳含有大量的營養(yǎng)素，包括蛋白質(zhì)、氨基酸、脂肪、維生素、礦物質(zhì)等，是羔羊早期生長發(fā)育的能量和物質(zhì)來源，羔羊吸收初乳中的營養(yǎng)素為自身被動免疫的建立奠定體質(zhì)基礎(chǔ)。初乳中的營養(yǎng)素含量高于常乳，楊曉宇在測定薩能奶山羊初乳中營養(yǎng)素后指出，初乳中總干物質(zhì)占比為10.24%，蛋白質(zhì)為21.32%，脂肪為7.73%，灰分為1.57%，其中維生素種類豐富，可滿足羔羊生長所需，Ca、Zn、Na、Al、Mg、Cu、Fe 等常量及微量元素也遠(yuǎn)高于常乳。

初乳中不僅含有豐富的營養(yǎng)素，還存在大量免疫成分，特別是在反芻幼畜出生早期發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能。前人研究表明，初乳中富含硫氰酸鹽、乳鐵蛋白、乳過氧化物酶、氫過氧化物酶、細(xì)胞因子、生長因子、免疫調(diào)節(jié)因子和免疫球蛋白（Ig）等免疫活性物質(zhì)，其中免疫球蛋白是新生幼畜建立被動免疫力的主要保障，在新生幼畜的培育中受到廣泛關(guān)注。初乳中的免疫球蛋白主要為免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白M（IgM）、免疫球蛋白A（IgA）3 種，IgG 可促進(jìn)巨噬細(xì)胞的吞噬作用，并具有激活補(bǔ)體、中和毒素、抗菌抗病毒等多種生物學(xué)活性，IgM 可促進(jìn)吞噬細(xì)胞的吞噬作用并且對細(xì)菌等顆粒抗原發(fā)揮免疫作用，IgA 可分布在腸道黏膜上直接發(fā)揮抗體作用，減少病原微生物的侵入。靈長類動物初乳中免疫球蛋白主要為IgA，例如人初乳中 IgA 占Ig 總量的89.8%，而IgG 僅占到Ig 總量的0.02%；而家畜動物初乳中免疫球蛋白以IgG 為主，豬初乳中IgG 濃度為58.7 mg/mL，占Ig 總量的80%以上；牛初乳中IgG 含量為50.5mg/mL，占Ig 總含量的86%以上；由于品種間差異，羊初乳中IgG 含量變異較大，山羊初乳中IgG 含量在28.2～72 mg/mL，綿羊初乳中IgG 含量在37～79 mg/mL，占初乳中Ig總量的85%以上。根據(jù)IgG 分子亞基和抗原特異性的不同，IgG 可分為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4 4 個(gè)亞類，IgG1 占IgG 總量的80%～90%，IgG2 占IgG 總量的10%～20%，其中IgG1 是機(jī)體再次免疫應(yīng)答時(shí)發(fā)揮免疫作用的主要成分。

1.2 初乳IgG 的吸收過程 IgG 分子由2 部分組成，分別為Fab 段和Fc 段，F(xiàn)ab 段可以和抗原進(jìn)行特異性結(jié)合，起到識別抗原的功能，F(xiàn)c 段無識別抗體能力但可與細(xì)胞上Fc 受體結(jié)合，起到引導(dǎo)、定位和跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)的作用。反芻幼畜對IgG 的吸收在小腸進(jìn)行，小腸上皮細(xì)胞刷狀緣存在新生兒Fc 受體（FcRn），作為IgG 在乳腺和腸道轉(zhuǎn)運(yùn)的唯一受體，F(xiàn)cRn 在新生兒小腸近端大量表達(dá)，并且FcRn 特異性結(jié)合IgG 的Fc 段，將IgG 吸附于小腸上皮細(xì)胞表面，經(jīng)過胞吞轉(zhuǎn)運(yùn)到小腸上皮細(xì)胞基底面，之后以胞吐的方式進(jìn)入血液循環(huán)。FcRn 介導(dǎo)的胞吞作用在羔羊出生后24 h 內(nèi)較活躍，隨后小腸上皮細(xì)胞快速發(fā)育成熟，喪失跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)IgG 的功能，形成腸閉合。

1.3 羔羊被動免疫成功建立的標(biāo)準(zhǔn) 新生羔羊免疫力低下，對環(huán)境的適應(yīng)能力較差，因此容易受到環(huán)境應(yīng)激影響和大腸桿菌等病原微生物的侵襲，從而發(fā)生感冒、腹瀉、痢疾、口腔炎、肺炎等一系列疾病，影響羔羊生存，被動免疫的建立有利于羔羊抵御微生物的侵襲，保障羔羊的正常生長。在生產(chǎn)上，常測定幼畜出生后12～72 h血清IgG 含量來評價(jià)被動免疫建立水平，這是因?yàn)榉雌c幼畜在采食初乳后6 h 達(dá)到IgG 吸收高峰期，12 h內(nèi)可完成對IgG 的吸收，隨后3 d 內(nèi)血清IgG 含量處于較穩(wěn)定的狀態(tài)。在犢牛上，Besser指出10 mg/mL的血清IgG 濃度是評判被動免疫建立的臨界值，但是Tyler 等和Selim 等分別提出血清中12、15 mg/mL的IgG 濃度可作為犢牛建立被動免疫的最佳臨界值，Chigerwe 等研究認(rèn)為20～25 mg/mL 是犢牛被動免疫建立的更好的判斷標(biāo)準(zhǔn)。不同研究者判斷犢牛成功建立被動免疫的血清IgG 值在逐年提高，原因可能是更高的血清IgG 水平可以更有效地保障新生犢牛的健康，隨著飼養(yǎng)管理技術(shù)的提高使用更高被動免疫評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)成為可能。目前對于羔羊被動免疫的研究仍較為匱乏，尚未形成統(tǒng)一的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。O'Brien 等在研究山羊羔羊血清IgG 含量與其斷奶存活率的關(guān)系后，推薦血清IgG 濃度12 mg/mL 作為羔羊建立被動免疫的臨界值。而Turquino 等研究高熱天氣對羔羊被動免疫轉(zhuǎn)移的影響，推薦綿羊被動免疫評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)為血清IgG 含量在15 mg/mL，與Alves 等的研究結(jié)果一致。羔羊被動免疫建立成功的標(biāo)準(zhǔn)尚待進(jìn)一步研究。

2 影響羔羊被動免疫的因素

初乳質(zhì)量、初乳飼喂量、初乳飼喂時(shí)間、幼畜的生理狀況等均可影響新生羔羊被動免疫建立，其中初乳質(zhì)量、初乳飼喂量和初乳飼喂時(shí)間是主要影響因素，生產(chǎn)上關(guān)注度較高。

2.1 初乳質(zhì)量 初乳質(zhì)量是影響羔羊被動免疫成功與否的重要因素，羔羊只有攝入優(yōu)質(zhì)初乳，才能最大程度保證羔羊自身被動免疫的建立。一般初乳質(zhì)量評估包括兩方面內(nèi)容，其一為初乳中IgG 含量，其二為初乳中微生物含量。

初乳中IgG 含量受母畜品種和生理狀況、胎次和產(chǎn)仔數(shù)等多種因素影響，不同研究中初乳IgG 含量變化較大。在牛初乳上，一般認(rèn)為優(yōu)質(zhì)初乳IgG 含量的臨界值為50 mg/mL。目前優(yōu)質(zhì)羊初乳研究較少，Zobel 等在研究折射儀與比重計(jì)測量羊初乳質(zhì)量后，推薦用20 mg/mL IgG 的初乳來飼喂羔羊；Alves 等在研究不同時(shí)期乳成分和抗體濃度時(shí)，以20mg/mL IgG作為優(yōu)質(zhì)初乳的臨界值；Castro 等在探究折射儀評估羊初乳中IgG 含量的可行性時(shí)，同樣認(rèn)為20 mg/mL IgG 含量為優(yōu)質(zhì)初乳的臨界值。因此，目前可將IgG 含量在20 mg/mL 以上的初乳作為優(yōu)質(zhì)初乳，用以飼喂羔羊，從而保障羔羊?qū)gG 的吸收。

初乳中存在大量微生物，Malmuthuge 等研究表明，乳酸菌、雙歧桿菌、大腸桿菌、葡萄球菌、大腸菌群和鏈球菌等多種微生物普遍存在于初乳中，優(yōu)質(zhì)初乳中微生物總含量應(yīng)低于10cfu/mL 或大腸桿菌數(shù)低于10cfu/mL。初乳中乳酸菌、雙歧桿菌被廣泛用做益生菌，但鏈球菌、葡萄球菌、大腸桿菌等病原微生物會對幼畜健康產(chǎn)生威脅，這種威脅主要體現(xiàn)在兩個(gè)方面：其一是病原菌直接導(dǎo)致動物患病，因此飼喂巴氏殺菌后的初乳有利于降低幼畜腹瀉等感染性疾??；其二初乳中病原微生物可與IgG 結(jié)合，降低初乳中可吸收IgG的有效含量，抑制羔羊?qū)gG 的吸收，因此經(jīng)過巴氏殺菌法滅殺初乳中的病原微生物，可以提高小腸對IgG 的吸收效率，有利于羔羊被動免疫的建立。

2.2 初乳飼喂量 初乳飼喂量是幼畜養(yǎng)殖過程中的關(guān)注重點(diǎn)，只有保證足夠的飼喂量才能更有效的幫助幼畜建立被動免疫。在犢牛上，一般推薦飼喂其初生重10%～12%的初乳，生產(chǎn)上常采用犢牛出生后2 h 內(nèi)飼喂3～4 L 初乳，12 h 后再次飼喂2 L 優(yōu)質(zhì)初乳，保障被動免疫建立的成功率。羊初乳產(chǎn)量低于牛初乳，并且存在一胎多羔現(xiàn)象，因此羔羊初乳飼喂量常得不到保證。Mellor 等研究表明，為保證羔羊建立被動免疫,應(yīng)在出生后18 h 內(nèi)按照羔羊初生重，每千克體重?cái)z入180～210 mL 初乳。而Alves 等認(rèn)為，羔羊需要在出生后24 h 內(nèi)攝入至少30 g IgG，保障被動免疫建立成功率。

2.3 初乳飼喂時(shí)間 幼畜出生后小腸上皮細(xì)胞快速發(fā)育，對初乳中IgG 的吸收效率逐漸降低，在出生后24 h 后發(fā)生腸關(guān)閉，無法將初乳中完整形式的IgG 轉(zhuǎn)移到血液中。Stott 等研究表明，幼畜出生后6 h 內(nèi)小腸對IgG 的吸收效率約為50%，在20 h 后迅速下降到12%。Godden研究也證實(shí)了幼畜出生后6 h 內(nèi)腸道對初乳的吸收量最高，6～12 h 緩慢下降，24 h 時(shí)基本結(jié)束。而母羊在產(chǎn)后10～12 h 內(nèi)IgG 水平也會發(fā)生明顯下降。因此，生產(chǎn)上應(yīng)在羔羊出生后盡早喂服足量的優(yōu)質(zhì)初乳，保障羔羊?qū)gG 的吸收效率和被動免疫成功率。

3 羔羊被動免疫檢測方法

3.1 單向免疫擴(kuò)散法（RID） RID 是將一定量的抗IgG 抗體混于瓊脂凝膠中制成瓊脂板，使IgG 在瓊脂板中自由擴(kuò)散，IgG 與抗IgG 抗體發(fā)生沉淀反應(yīng)，最后在孔周圍形成放射性沉淀環(huán)，根據(jù)沉淀環(huán)直徑與IgG 濃度的關(guān)系確定初乳與血清中IgG 濃度。這種方法使用方便、成本低，檢測準(zhǔn)確度高，因此大量研究將其作為評估初乳和血清IgG 濃度的金標(biāo)準(zhǔn)。然而RID 法需要由有經(jīng)驗(yàn)的人員在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，耗時(shí)較長，制約了該方法在實(shí)際生產(chǎn)中的使用。

3.2 酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA） ELISA 方法一般分為間接法、雙抗體夾心法和競爭法，其中雙抗體夾心法由于其敏感性高而使用較廣泛，此種方法將酶分子與抗體分子共價(jià)結(jié)合，形成酶標(biāo)抗體，再與吸附在固相載體上的抗原發(fā)生特異性結(jié)合，滴加含酶的底物溶液后，底物可在酶作用下由無色的還原型變成有色的氧化型，出現(xiàn)顏色反應(yīng)，以此確定初乳或血清中IgG 或蛋白含量。ELISA 法已被廣泛應(yīng)用于初乳質(zhì)量的檢測以及羔羊被動免疫建立的評定，有研究認(rèn)為，基于ELISA 法時(shí)羔羊血清IgG 含量在15 mg/mL 以上或總蛋白含量高于45 mg/mL可以判定被動免疫建立成功。ELISA 法特異性強(qiáng)，敏感度高，但同時(shí)對設(shè)備、試驗(yàn)操作和環(huán)境要求高，檢測成本較高，常用于被動免疫的實(shí)驗(yàn)室測定。

3.3 Brix 折射儀法 折射儀（Brix）法是應(yīng)用光線在不同的透明介質(zhì)中的折光現(xiàn)象，利用初乳或新生反芻動物血清中蛋白含量與IgG 含量的正相關(guān)關(guān)系，通過間接測定初乳或血清中蛋白含量估測其中IgG 含量的方法。Morrill 等證明，Brix 折射儀讀數(shù)與初乳和血清中IgG 含量正相關(guān)，可用于初乳品質(zhì)的判定和犢牛被動免疫轉(zhuǎn)移的識別。Brix 讀數(shù)高于20.9%時(shí)表明初乳中IgG含量高于50 mg/mL，為優(yōu)質(zhì)初乳。Mcguirk 等研究認(rèn)為，健康犢牛血清總蛋白含量高于52 mg/mL，即Brix 值高于7.9%時(shí)，判定犢牛已成功建立被動免疫轉(zhuǎn)移。綿羊在產(chǎn)后12 h 內(nèi)，初乳乳蛋白濃度與初乳中免疫球蛋白有較強(qiáng)的正相關(guān)關(guān)系，因此，折射儀估算母羊初乳IgG 濃度是評估初乳質(zhì)量的一種有效方法，初乳中IgG 含量高于20 mg/mL，Brix 讀數(shù)高19%時(shí)，被認(rèn)為是優(yōu)質(zhì)初乳。目前折射儀在檢測羔羊被動免疫建立方面應(yīng)用較少，有待于進(jìn)一步研究。盡管Brix 折射儀方法準(zhǔn)確性低于RID 方法，但其操作簡單，對環(huán)境條件要求低，測定速度快，更適于在生產(chǎn)上應(yīng)用。

3.4 毛細(xì)管電泳法（CE） CE 是一種基于帶電粒子在電場作用下，在液體介質(zhì)中運(yùn)動的分析方法，利用不同粒子的遷移速度取決于它們的電荷、形狀和大小，以及溶液環(huán)境和電場強(qiáng)度，完成不同的粒子在遷移過程中的分離和鑒定。目前CE 成功應(yīng)用于母羊初乳品質(zhì)的檢測，Ceniti 等使用CE 儀器成功分離出母羊初乳清蛋白質(zhì)，并在電泳圖中鑒定出與總Ig 對應(yīng)的部分。CE 法也可應(yīng)用與羊奶制品中牛奶摻假的檢測，Morittu比較RID 和CE 2 種方法，結(jié)果顯示，CE 與RID 具有較強(qiáng)的相關(guān)性。CE 法較之RID 法具有分離效率高、運(yùn)行時(shí)間短、成本低等優(yōu)點(diǎn)，但對設(shè)備和試驗(yàn)操作技能要求較高，可以作為實(shí)驗(yàn)室檢測方法。

3.5 免疫傳感器法 免疫傳感器將羊特異性IgG 與選擇性抗體辣根過氧化物酶（HRP）特異結(jié)合并固定在磁性微珠（MBs）上，通過HO/ 對苯二酚（HQ）系統(tǒng)測量兩極電流，電流大小與IgG 濃度成正比關(guān)系，因此，可使用免疫傳感器法檢測初乳和血清中IgG 含量。研究表明，免疫傳感器法在牛IgG、綿羊IgG、山羊IgG 上的檢測下限為0.74、0.82、0.66 ng/mL。此方法檢測精度極高，不僅可以檢測羔羊血清IgG 含量，還可應(yīng)用于乳制品摻假的檢測。免疫傳感器法具有分析快速、靈敏度高、樣品需要量少的優(yōu)勢，但對設(shè)備和技術(shù)依賴度高，適合在規(guī)?；瘷z測公司和大牧場中使用。

4 小結(jié)

新生羔羊成功建立被動免疫是提高機(jī)體抵抗力、降低疾病發(fā)生率的有效措施。羔羊被動免疫的建立與初乳品質(zhì)、飼喂量和飼喂時(shí)間密切相關(guān)，保證羔羊盡早攝入充足的優(yōu)質(zhì)初乳是成功建立被動免疫的關(guān)鍵。被動免疫在犢牛上的研究較多，已形成行業(yè)共識，有效促進(jìn)了犢牛培育水平的提高，但綿羊和山羊泌乳量、初乳成分和產(chǎn)羔數(shù)均與奶牛存在明顯差異，羔羊被動免疫建立過程、被動免疫水平的評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)和檢測方法研究較少，產(chǎn)業(yè)上尚未形成統(tǒng)一認(rèn)識，是制約羔羊培育進(jìn)步的重要方面之一，對該問題的深入研究必能有效提高羔羊的培育水平，增加羔羊繁育的經(jīng)濟(jì)效益。