乳突骨膜下注射新霉素建立小型豬單側(cè)藥物性聾模型

張麗媛 張季蕾 靜媛媛 余力生

北京大學(xué)人民醫(yī)院耳鼻喉科（北京 100034）

近年來，梅尼埃病、突發(fā)性耳聾等內(nèi)耳疾病發(fā)病率逐漸升高，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，這些內(nèi)耳疾病多以單側(cè)起病為主[1,2]。既往此類內(nèi)耳疾病的相關(guān)基礎(chǔ)研究多以大鼠、小鼠等小型嚙齒類動(dòng)物為研究對(duì)象。最近，小型豬由于其內(nèi)耳各器官在遺傳背景、解剖和生理等方面與人類更相似而備受關(guān)注[3,4]，利用噪聲暴露建立的小型豬雙側(cè)聾模型已被廣泛應(yīng)用[5-8]，但模擬臨床常見內(nèi)耳疾病的小型豬單側(cè)聾模型卻鮮有報(bào)道。

耳后給藥是一種新的針對(duì)內(nèi)耳疾病的局部給藥方法，是將藥物直接注射至顳骨乳突區(qū)骨膜下或顳肌內(nèi)[9]。臨床發(fā)現(xiàn)耳后給藥可取得較好療效[9-11]，在豚鼠上的基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)乳突骨膜下給藥后注射側(cè)內(nèi)耳藥物濃度高于對(duì)照側(cè)[12,13]。新霉素是一類廣泛使用的氨基糖甙類抗生素，它可以損傷動(dòng)物耳蝸外毛細(xì)胞，造成聽功能損害，而對(duì)前庭毛細(xì)胞損傷相對(duì)較小[14]。

本研究擬通過連續(xù)7天單側(cè)乳突部骨膜下注射硫酸新霉素100mg/kg，建立巴馬小型豬單側(cè)藥物性聾模型，為內(nèi)耳疾病提供新的動(dòng)物模型。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取健康巴馬小型豬(北京實(shí)創(chuàng)世紀(jì)小型豬養(yǎng)殖基地)6只，雌雄各半，體重5-6kg。篩選標(biāo)準(zhǔn)：雙耳各頻率ABR閾值基本正常，左右耳同頻率閾值差異≤5dB。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備

Ellipse全自動(dòng)生化分析儀(0.1-0.9A，法國(guó)優(yōu)德公司)；TDT系統(tǒng)測(cè)聽設(shè)備(MCO-18A20，美國(guó))；激光共聚焦顯微鏡(Leica SP8，德國(guó))。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

硫酸新霉素：上海阿拉丁公司；4%多聚甲醛：北京化工廠；PBS緩沖液：北京中杉試劑公司；10%乙二胺四乙酸脫鈣液：廈門海標(biāo)科技公司；免洗DAPI液：中杉金橋；Phalloidin-iFluor 594 Reagent:Abcam。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 實(shí)驗(yàn)分組及設(shè)計(jì)

6只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均選擇左側(cè)耳為注射側(cè)(實(shí)驗(yàn)側(cè))，右側(cè)耳為對(duì)照側(cè)。入組后于籠中飼養(yǎng)觀察7天以適應(yīng)環(huán)境，期間自由取水取食，避免噪聲、捉取等不良刺激。入組后第9天開始連續(xù)7天予實(shí)驗(yàn)側(cè)乳突骨膜下注射新霉素100mg/kg，對(duì)照側(cè)不做處理。給藥前1天及給藥結(jié)束后第1天抽取靜脈血測(cè)定肌酐及尿素氮水平，給藥前1天及給藥結(jié)束后第7天進(jìn)行ABR測(cè)聽。

2.2 經(jīng)乳突骨膜下給藥方法

將硫酸新霉素溶解于0.9%NaCl注射液制成200mg/mL的溶液。按100mg/kg的劑量(該日齡、該體重下小型豬全身用藥時(shí)單次最大安全劑量的2倍[15])抽取藥液，于體表觸及小型豬乳突最為明顯處進(jìn)針，針尖觸及乳突部骨面后開始注射藥物(如圖1)，將藥物注射于骨膜下，注射過程中密切觀察小型豬是否發(fā)生呼吸麻痹。每天固定時(shí)間給藥1次，連續(xù)7天，每日稱量體重，按實(shí)際體重所對(duì)應(yīng)的劑量給藥。

圖1 乳突骨膜下注射Fig.1 Neomycin injection under mastoid periosteum

2.3 ABR檢測(cè)

本實(shí)驗(yàn)采用TDT系統(tǒng)測(cè)聽設(shè)備對(duì)小型豬進(jìn)行ABR檢測(cè)。麻醉滿意后(3%戊巴比妥注射液，1ml/kg，臀部肌肉注射)取俯臥位。將記錄電極、參考電極及接地電極分別置于小型豬顱頂中線處、測(cè)試耳耳垂處及鼻尖正中。將給聲管置于測(cè)試耳外耳道口并確認(rèn)無接觸，對(duì)側(cè)外耳道以海綿耳塞加以堵塞。刺激聲為短純音，測(cè)試頻率為4kHz、8kHz、16kHz、24kHz、32kHz，疊加1024 次，掃描時(shí)間10ms，聲強(qiáng)從90dB開始逐漸遞減，每次遞減10dB，接近閾值時(shí)遞減幅度減至5dB，以能分辨、可重復(fù)的ABR波形對(duì)應(yīng)的最低刺激聲強(qiáng)度為ABR閾值。因所能達(dá)到的最大聲強(qiáng)為90dB，故如90dB重復(fù)3次仍無法引出可重復(fù)的波形，閾值記錄為100dB。

2.4 耳蝸基底膜鋪片及顯微鏡觀察

小型豬深度麻醉后斷頭處死、取材，4%PFA進(jìn)行耳蝸灌流，并于4℃放置12小時(shí)以固定標(biāo)本。后將標(biāo)本移入10%EDTA內(nèi)脫鈣7天。于解剖顯微鏡下剝除蝸殼骨質(zhì)，去除蝸軸、螺旋韌帶、蓋膜和前庭膜，得到基底膜標(biāo)本。取雙側(cè)耳蝸頂轉(zhuǎn)和底轉(zhuǎn)相同位置的基底膜用于鋪片。將所得基底膜移入離心管中，加入 Phalloidin-iFluor 594 Reagent，37℃下避光放置1小時(shí)，PBS漂洗3次，每次15分鐘。在載玻片上滴加適量免洗DAPI液，將基底膜平整放入，蓋玻片封片。應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡對(duì)基底膜鋪片進(jìn)行觀察，選擇405nm、552nm波長(zhǎng)的激發(fā)光，對(duì)所選區(qū)域的毛細(xì)胞從上至下進(jìn)行層掃，并疊加獲得最后的圖像。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所得數(shù)據(jù)均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差()的形式表示，使用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。配對(duì)樣本首先以箱式圖檢查有無異常值、Shapiro-Wilk檢驗(yàn)是否服從正態(tài)，然后行配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05為標(biāo)準(zhǔn)判斷存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 一般情況

連續(xù)給藥7天后，全部6只巴馬小型豬均存活，給藥過程中均未發(fā)生呼吸麻痹，未見明顯少尿、拒食。注射點(diǎn)皮膚未見明顯紅腫、破潰，皮膚及皮下組織未觸及硬結(jié)，皮膚彈性良好。給藥前后小型豬血肌酐及尿素氮水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(如表1，P＞0.05，t檢驗(yàn))。

表1 給藥前后血清肌酐、尿素氮濃度(umol/L)（±s）Table 1 The concentration of creatinine and urea nitrogen in serum before and after drug administration(umol/L)（±s）

表1 給藥前后血清肌酐、尿素氮濃度(umol/L)（±s）Table 1 The concentration of creatinine and urea nitrogen in serum before and after drug administration(umol/L)（±s）

Notes:n=6,*P＜0.05,**P＜0.01.

Group Before administration After administration P Creatinine 77.4±6.1 76.0±4.3 0.608 Urea nitrogen 3.1±0.6 3.0±0.4 0.822

3.2 給藥前小型豬ABR結(jié)果

巴馬小型豬正常狀態(tài)下經(jīng)短純音刺激所引出的ABR波形見圖2，Ⅱ波及Ⅴ波最為明顯，可作為閾值判讀標(biāo)準(zhǔn)，而Ⅲ、Ⅳ波融合呈M形。雙耳各個(gè)頻率聽閾如表2所示，隨著頻率升高，小型豬雙耳ABR聽閾逐漸升高；給藥前，小型豬雙耳ABR閾值在各頻率均無顯著差異(P＞0.05，t檢驗(yàn))。

表2 給藥前兩組ABR閾值比較(dB)（±s）Table 2 Comparison of ABR thresholds between the two groups before administration(dB)（±s）

表2 給藥前兩組ABR閾值比較(dB)（±s）Table 2 Comparison of ABR thresholds between the two groups before administration(dB)（±s）

Notes:n=6,*P＜0.05,**P＜0.01.

Group The injected group The control group P Frequency(kHz)4.0 22.67±4.08 22.67±4.08 1.000 8.0 34.17±2.04 33.33±2.58 0.363 16.0 37.50±2.74 39.17±2.04 0.175 24.0 55.00±3.16 55.83±2.04 0.363 32.0 70.83±3.76 70.00±3.16 0.695

圖2 正常狀態(tài)下巴馬小型豬經(jīng)短純音刺激所引出的ABR波形Fig.2 ABR wave induced by short pure tone sound in Bama miniature pigs under normal conditions

3.3 給藥后小型豬ABR結(jié)果

連續(xù)7天耳后注射新霉素后，多數(shù)小型豬雙側(cè)耳經(jīng)4kHz、8kHz、16kHz短純音刺激所引出的波形變化不明顯。但在24kHz，注射側(cè)耳的ABR閾值明顯升高(圖3)。在32kHz處，多數(shù)小型豬注射側(cè)耳以90dB的聲強(qiáng)仍無法引出可重復(fù)的波形；其對(duì)照側(cè)所引出的波形較給藥前亦相對(duì)畸形，部分波峰不清晰(圖 4)。

圖3 24kHz短純音引出的小型豬ABR波形圖(A給藥前;B注射組給藥后;C對(duì)照組給藥后)Fig.3 ABR wave induced by 24kHz short pure tone sound in Bama miniature pigs(A:Before administration;B:Injected group after administration;C:Control group after administration)

圖4 32kHz短純音引出的小型豬ABR波形圖(A給藥前;B注射組給藥后;C對(duì)照組給藥后)Fig.4 ABR wave induced by 32kHz short pure tone sound in Bama miniature pigs(A:Before administration;B:Injected group after administration;C:Control group after administration)

小型豬雙耳給藥前后的ABR閾值變化見表3，給藥后小型豬注射側(cè)和對(duì)照側(cè)耳在24kHz、32kHz處ABR閾值均較給藥前顯著升高(P＜0.01，t檢驗(yàn))，在16kHz處注射側(cè)ABR閾值較給藥前有顯著差異(P＜0.01，t檢驗(yàn))。計(jì)算每只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雙耳各頻率給藥前后ABR閾值的變化，即為該耳該頻率ABR閾移。給藥前后，注射側(cè)耳的ABR閾移均值均高于或等于對(duì)側(cè)耳，且在16kHz、24kHz、32kHz處存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(如表4，P＜0.01，t檢驗(yàn))；隨著頻率的增高，雙側(cè)耳的ABR閾移均逐漸增大。給藥后，小型豬注射側(cè)和對(duì)照側(cè)ABR閾值在16kHz、24kHz、32kHz處顯著高于對(duì)側(cè)(如表5，P＜0.01，t檢驗(yàn))。

表3 兩組給藥前后ABR閾值比較(dB)（±s）Table 3 Comparison of ABR thresholds before and after administration at each frequency in both groups(dB)（±s）

表3 兩組給藥前后ABR閾值比較(dB)（±s）Table 3 Comparison of ABR thresholds before and after administration at each frequency in both groups(dB)（±s）

Notes:n=6,*P＜0.05,**P＜0.01.

Group Frequency(kHz)The injected group The control group Before administration After administration P Before administration After administration P 4.0 22.67±4.08 27.50±5.24 0.363 22.67±4.08 26.67±4.08 1.000 8.0 34.17±2.04 35.00±0.00 0.363 33.33±2.58 34.17±3.76 0.363 16.0 37.50±2.74 44.17±2.04 0.001 39.17±2.04 40.00±0.00 0.363 24.0 55.00±3.16 72.50±2.74 0.000 55.83±2.04 63.33±2.58 0.001**32.0 70.83±3.76 98.33±4.08 0.000 70.00±3.16 82.50±2.74 0.000**

表4 兩組ABR閾移比較(dB)（±s）Table 4 Comparison of ABR threshold shifts between the two groups(dB)（±s）

表4 兩組ABR閾移比較(dB)（±s）Table 4 Comparison of ABR threshold shifts between the two groups(dB)（±s）

Notes:n=6,*P＜0.05,**P＜0.01.

Group Frequency(kHz)The injected group The control group P 4.0 0.83±2.04 0.00±.16 0.611 8.0 0.83±2.04 0.83±2.04 1.000 16.0 6.67±2.58 0.83±2.04 0.001**24.0 17.50±2.74 7.50±2.74 0.001**32.0 27.50±5.24 12.50±2.74 0.000**

表5 給藥后兩組ABR閾值比較(dB)（±s）Table 5 Comparison of ABR thresholds between the two groups after administration(dB)（±s）

表5 給藥后兩組ABR閾值比較(dB)（±s）Table 5 Comparison of ABR thresholds between the two groups after administration(dB)（±s）

Notes:n=6,*P＜0.05,**P＜0.01.

Group The injected group The control group P Frequency(kHz)4.0 27.50±5.24 26.67±4.08 0.611 8.0 35.00±0.00 34.17±3.76 0.004**16.0 44.17±2.04 40.00±0.00 0.004**24.0 72.50±2.74 63.33±2.58 0.002**32.0 98.33±4.08 82.50±2.74 0.001**

3.4 毛細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

DAPI染色下，給藥后注射側(cè)外毛細(xì)胞三層結(jié)構(gòu)基本存在，外毛細(xì)胞核絕大部分存在，結(jié)構(gòu)尚清晰，較對(duì)側(cè)排列略顯紊亂(圖5A，B)。Phalloidin染色下，給藥后注射側(cè)耳蝸可見個(gè)別外毛細(xì)胞缺失，且存留的外毛細(xì)胞其纖毛結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)紊亂、融合成團(tuán)等特點(diǎn)，排列不規(guī)則，尤其以底轉(zhuǎn)為明顯，部分外毛細(xì)胞的纖毛結(jié)構(gòu)幾不可辨；而對(duì)側(cè)耳蝸頂轉(zhuǎn)外毛細(xì)胞纖毛結(jié)構(gòu)清晰，排列整齊，僅底轉(zhuǎn)部分外毛細(xì)胞的纖毛結(jié)構(gòu)稍模糊(圖5C-F)。

圖5 給藥后小型豬外毛細(xì)胞形態(tài)(A注射側(cè);B對(duì)側(cè);C注射側(cè)，耳蝸底轉(zhuǎn);D對(duì)側(cè)，耳蝸底轉(zhuǎn);E注射側(cè)，耳蝸頂轉(zhuǎn);F對(duì)側(cè)，耳蝸頂轉(zhuǎn)。藍(lán)色：DAPI；紅色：phalloidin)Fig.5 The morphology of the outer hair cell of miniature pigs after administration(A:Injected group;B:Controlled group;C:Injected group,the base turn of the cochlear;D:Controlled group,the base turn of the cochlear;E:Injected group,the apical turn of the cochlear;F:Controlled group,the apical turn of the cochlear.Blue:DAPI;red:phalloidin)

4 討論

突發(fā)性聾、梅尼埃病等內(nèi)耳疾病是導(dǎo)致聽力下降的重要原因，其發(fā)病率逐年升高，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，造成巨大醫(yī)療負(fù)擔(dān)[1,2]。研究表明，這些內(nèi)耳疾病多以單耳起?。?5.1-99.6%的突發(fā)性聾患者表現(xiàn)為單側(cè)聾[16]；大多數(shù)梅尼埃病患者在最初被診斷時(shí)僅累及單側(cè)耳，45-47%的患者最終會(huì)發(fā)展成雙側(cè)梅尼埃病[1,17,18]。但現(xiàn)有聽力損傷動(dòng)物模型多為雙側(cè)聾[19]，與突發(fā)性聾、梅尼埃病等內(nèi)耳疾病的發(fā)病特點(diǎn)有一定差異。本實(shí)驗(yàn)以巴馬小型豬為研究對(duì)象，通過乳突骨膜下注射新霉素，成功建立單側(cè)聾模型，為進(jìn)一步探索單側(cè)聽力下降的發(fā)病機(jī)制及治療手段提供研究工具。

本研究選擇巴馬小型豬作為建立單側(cè)藥物性聾模型的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。小型豬體型較普通豬小，且在解剖結(jié)構(gòu)、病理生理和遺傳等方面與人類頗為相似，因此被廣泛應(yīng)用于多個(gè)生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域[20]。近年來，研究表明，小型豬中耳及內(nèi)耳形態(tài)結(jié)構(gòu)與人類極其類似，且聽力學(xué)資料穩(wěn)定[3,4]，是耳科學(xué)基礎(chǔ)研究的理想實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。與之相比，小型嚙齒類動(dòng)物雖有繁殖周期短、易于操控等優(yōu)點(diǎn)，但其顱骨較小，且中耳、內(nèi)耳器官形態(tài)及遺傳背景均與人類有較大差異，對(duì)人類疾病代表性有限[19]。尹海金、郭維維等人研究表明，小型豬存在乳突氣房系統(tǒng)，其氣化程度相當(dāng)于人類板障型乳突氣房[21]；而豚鼠和大鼠顳骨乳突部?jī)H為骨壁，缺乏與人類似的乳突氣房結(jié)構(gòu)[22,23]。因此前者更可能模擬出人體進(jìn)行耳后給藥后的藥物濃度分布情況及毛細(xì)胞受損程度，在耳后給藥及單側(cè)聾研究領(lǐng)域具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。

本實(shí)驗(yàn)中，研究者首次在小型豬身上嘗試耳后給藥的方式，發(fā)現(xiàn)連續(xù)7天每天進(jìn)行單側(cè)顳骨乳突部骨膜下注射硫酸新霉素100mg/kg后，小型豬雙耳ABR聽閾均有升高，且注射側(cè)耳ABR閾值上升程度明顯高于對(duì)側(cè)耳(P＜0.01，t檢驗(yàn))，注射后雙側(cè)耳ABR閾值在16kHz、24kHz、32kHz處有顯著差異(P＜0.01，t檢驗(yàn))，耳蝸基底膜鋪片可觀察到注射側(cè)耳蝸外毛細(xì)胞的纖毛結(jié)構(gòu)受損重于對(duì)側(cè)，成功建立小型豬單側(cè)藥物性聾模型。耳后給藥是一種新型局部給藥方式，是指依據(jù)藥物水溶性或脂溶性將藥物直接注射至顳骨乳突區(qū)的骨膜下或顳肌內(nèi)[9]。既往研究表明，相比于腹腔注射或肌肉注射，耳后給藥可以在注射側(cè)內(nèi)耳達(dá)到更高的藥物濃度，且持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，在全身血液循環(huán)中濃度較低[13,24,25]。依據(jù)以往在小型嚙齒類動(dòng)物中的研究，我們推測(cè)新霉素可能通過局部直接滲透、乙狀竇-內(nèi)淋巴囊途徑、全身血液循環(huán)等途徑進(jìn)入內(nèi)耳[13,25-27]。本研究中耳后注射新霉素后小型豬雙耳均出現(xiàn)一定程度的聽力損失，且患側(cè)聽力損失大于對(duì)側(cè)聽力損失，注射側(cè)耳蝸外毛細(xì)胞的纖毛結(jié)構(gòu)受損重于對(duì)側(cè)，說明小型豬雙側(cè)內(nèi)耳均有新霉素分布，但患側(cè)內(nèi)耳局部藥物濃度可能高于對(duì)側(cè)內(nèi)耳。研究者曾嘗試對(duì)比新霉素耳后給藥與全身給藥對(duì)小型豬聽功能及毛細(xì)胞的損傷，但在進(jìn)行新霉素100mg/kg肌肉注射后，2只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均未存活。

耳毒性藥物的全身毒性反應(yīng)是建立藥物性聾動(dòng)物模型的挑戰(zhàn)，一旦高于藥物安全劑量，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡率高。本研究采用的新霉素是一類廣泛使用的氨基糖甙類抗生素，它可以造成動(dòng)物耳蝸外毛細(xì)胞損傷以及不可逆聽力損害[28]。但氨基糖苷類抗生素神經(jīng)毒性和腎毒性均明顯，單次大量給藥可造成呼吸麻痹而急性致死，且全身用藥時(shí)腎毒性一般早于耳毒性發(fā)生[15,29]，因此，為了保證動(dòng)物存活，局部給藥是必要的。本研究選擇的局部給藥劑量遠(yuǎn)高于全身給藥時(shí)的最大安全劑量，但所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均未觀察到呼吸麻痹、少尿等表現(xiàn)，且給藥前后靜脈血肌酐及尿素氮水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，證明本實(shí)驗(yàn)采用的造模方式較為安全。

本研究存在一些不足之處，由于樣本量較小，小型豬新霉素給藥劑量和給藥時(shí)間與對(duì)小型豬聽力影響的變化有待進(jìn)一步探究，后續(xù)研究中可以繼續(xù)增大藥物劑量或延長(zhǎng)給藥和觀察時(shí)間，觀察是否發(fā)生進(jìn)一步聽力下降。

5 結(jié)論

總之，單側(cè)顳骨乳突部骨膜下注射硫酸新霉素可以造成小型豬雙耳高頻聽力損傷，注射側(cè)聽閾顯著高于對(duì)側(cè)，是理想的單側(cè)藥物性聾動(dòng)物模型。