雪蓮SikCDPK1啟動(dòng)子的克隆和活性分析

史光珍 王兆曄 孫琦 朱新霞

（石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 綠洲城鎮(zhèn)與山盆系統(tǒng)生態(tài)兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石河子 832003）

新疆天山雪蓮（Sasussured involucrata Kar.et Kir）能夠在常年積雪不化、空氣稀薄、紫外線輻射強(qiáng)烈的高山、懸崖峭壁的石縫中生長(zhǎng)，是一種優(yōu)良的耐極端氣候植物［1］，研究與其相關(guān)的逆境基因，對(duì)提高植物抗逆性意義重大。

鈣依賴蛋白激酶（calcium-dependent protein kinases, CDPKs）是鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的主要感受器和效應(yīng)器，在環(huán)境刺激、植物生長(zhǎng)發(fā)育和激素信號(hào)傳遞等過(guò)程起重要作用［2］。啟動(dòng)子是一種具有調(diào)節(jié)基因功能的順式作用因子，位于結(jié)構(gòu)基因上游，能與RNA聚合酶特異性結(jié)合，有效地控制轉(zhuǎn)錄的起始、表達(dá)效率、表達(dá)時(shí)間和表達(dá)特異性［3］。分析研究啟動(dòng)子的核心區(qū)域序列、響應(yīng)元件類型、數(shù)量和響應(yīng)模式，有利于洞察目的基因的功能及其表達(dá)調(diào)控機(jī)制。

本課題組前期克隆了SikCDPK1基因，發(fā)現(xiàn)它在干旱、低溫脅迫下轉(zhuǎn)錄水平增加［4］。但SikCDPK1基因上游啟動(dòng)子的序列、結(jié)構(gòu)和其響應(yīng)機(jī)制仍未明確。因此本研究擬在此基礎(chǔ)上，對(duì)雪蓮SikCDPK1啟動(dòng)子進(jìn)行克隆，探究其序列特征和潛在的響應(yīng)元件，進(jìn)一步構(gòu)建含有報(bào)告基因GUS的植物表達(dá)載體P0∷GUS及5'端缺失的表達(dá)載體（P1∷GUS，P2∷GUS，P3∷GUS），通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)化煙草、低溫和干旱脅迫、GUS染色來(lái)研究SikCDPK1啟動(dòng)子的活性，為探明 SikCDPK1基因的上游調(diào)控序列和進(jìn)一步解析雪蓮SikCDPK1基因響應(yīng)脅迫的調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

雪蓮由本實(shí)驗(yàn)室組培培養(yǎng)，本氏煙草（Nicotiana benthamiana）種子、大腸桿菌（Eschrichia coli）感受態(tài)細(xì)胞DH5α、根癌農(nóng)桿菌GV3101、植物表達(dá)載體pCAMBIA1304均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 雪蓮SikCDPK1基因啟動(dòng)子的克隆和順式作用元件分析 根據(jù)本課題組前期克隆的SikCDPK1基因序列，分別設(shè)計(jì)了3條嵌套的特異性引物SP1、SP2和SP3，同時(shí)合成4條具有低Tm值的短的隨機(jī)簡(jiǎn)并引物AD1-AD4和一條特異性引物AD5（表1），以雪蓮基因組DNA為模板，根據(jù)引物的長(zhǎng)短和特異性的差異設(shè)計(jì)不對(duì)稱的溫度循環(huán)，通過(guò)TAIL-PCR技術(shù)分3次反應(yīng)來(lái)擴(kuò)增SikCDPK1的上游序列。第1輪PCR反應(yīng)體系為DNA模板1 μL、隨機(jī)簡(jiǎn)并引物AD1-AD4 各 0.5 μL，引物 SP1 0.5 μL，ddH2O 8 μL，2×Taq PCR mix 10 μL。在第2輪反應(yīng)中，將第1輪PCR產(chǎn)物稀釋100倍作為第2輪反應(yīng)的模板，SP1更換為SP2，其余條件不變；在第3輪反應(yīng)中，將第2輪反應(yīng)產(chǎn)物稀釋100倍作為模板，SP2更換為SP3，其余條件不變。PCR反應(yīng)程序參考Liu等［5］的方法。PCR反應(yīng)結(jié)束后，利用1%的瓊脂糖凝膠分別對(duì)3輪TAIL-PCR擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)，選取第3輪結(jié)果中符合大小的特異性條帶，使用DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收純化。然后進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌。利用pMD-19T載體的通用引物M13F/R進(jìn)行菌液PCR和測(cè)序。獲得啟動(dòng)子序列后，通過(guò)plantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）預(yù)測(cè)啟動(dòng)子順式作用元件。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

1.2.2 啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS植物表達(dá)載體的構(gòu)建 為了深入研究SikCDPK1啟動(dòng)子的功能，在全長(zhǎng)啟動(dòng)子P0的基礎(chǔ)上，根據(jù)順式調(diào)控元件設(shè)計(jì)了3個(gè)不同長(zhǎng)度的5'端序列缺失的上游引物（帶Hind III和Spe I酶切位點(diǎn)）（表1），并以此為模板，擴(kuò)增含有不同截短長(zhǎng)度的SikCDPK1啟動(dòng)子片段。同時(shí)，用Hind III和Spe I雙酶切植物雙元表達(dá)載體pCAMBIA1304，回收目的片段，經(jīng)同源重組重新連接。重組質(zhì)粒經(jīng)菌液PCR和測(cè)序驗(yàn)證后，獲得不同長(zhǎng)度的pSikCDPK1∷GUS表達(dá)載體，分別命名為P0∷GUS，P1∷GUS，P2∷GUS，P3∷GUS（圖 1）。

圖1 SikCDPK1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS表達(dá)載體Fig. 1 GUS expression vectors driven by SikCDPK1 promoters

1.2.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草瞬時(shí)轉(zhuǎn)化與GUS酶活測(cè)定 將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌GV3101中，用注射器將菌液注射至煙草葉片，在黑暗條件下保溫、保濕培養(yǎng)24 h之后，恢復(fù)正常光照培養(yǎng)24 h。對(duì)所有注射過(guò)的煙草分別進(jìn)行冷脅迫或PEG處理，處理時(shí)間為0、1、3、6、12和 24 h。在不同處理時(shí)間點(diǎn)分別用打孔器取樣，分別對(duì)樣品進(jìn)行GUS染色和 GUS酶活力測(cè)定。

2 結(jié)果

2.1 啟動(dòng)子的克隆

在已經(jīng)獲得的SikCDPK1基因序列基礎(chǔ)上，利用TAIL-PCR法擴(kuò)增雪蓮SikCDPK1的啟動(dòng)子序列。經(jīng)過(guò)3輪PCR，第一輪擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物均無(wú)特異條帶（圖2-A），第2輪PCR產(chǎn)物出現(xiàn)特異條帶（圖2-B），第3輪PCR 產(chǎn)物第2、3、4泳道出現(xiàn)單一的特異條帶（圖2-C），對(duì)該片段回收、測(cè)序后與SikCDPK1基因比對(duì)，確認(rèn)其為 SikCDPK1的5'側(cè)翼序列。該序列長(zhǎng)度1 042 bp，命名為pSikCDPK1。

圖2 SikCDPK1基因啟動(dòng)子的克隆Fig. 2 Cloning of SikCDPK1 promoter

2.2 啟動(dòng)子序列的功能預(yù)測(cè)

利用PlantCARE對(duì)克隆獲得的pSikCDPK1序列分析發(fā)現(xiàn)，序列中含有多個(gè)CAAT box 及TATA box保守元件，還有激素類響應(yīng)元件，如參與MeJA的CGTCA-motif、TGACG-motif 元件，ABA誘導(dǎo)響應(yīng)元件ABRE和DPBFCOREDCDC3，赤霉素響應(yīng)元件TATC-box等，此外參與冷、脫水、鹽誘導(dǎo)、光響應(yīng)的順式調(diào)控元件也在SikCDPK1啟動(dòng)子中存在。不同順式作用元件的序列、功能、核心序列及其在啟動(dòng)子區(qū)的分布情況見表2。

表2 啟動(dòng)子 pSikCDPK1序列中的順式作用元件及功能Table 2 Cis-elements and functions in the promoter pSikCDPK1 sequence

2.3 啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS表達(dá)載體構(gòu)建

將克隆的啟動(dòng)子片段 pSikCDPK1和3個(gè)5'端缺失啟動(dòng)子（P1、P2、P3）分別連接到植物表達(dá)載體pCAMBIA1304（有GUS，無(wú)啟動(dòng)子）上，對(duì)重組質(zhì)粒分別進(jìn)行PCR（圖3-A）、測(cè)序和酶切鑒定，獲得大小為1 042、821、480和181 bp的目標(biāo)基因片段和大于4 500 bp的載體片段（圖3-B，C），表明4個(gè)啟動(dòng)子表達(dá)載體構(gòu)建成功。

圖3 SikCDPK1啟動(dòng)子的PCR擴(kuò)增及表達(dá)載體雙酶切鑒定Fig. 3 PCR amplification of promoter SikCDPK1 and double restriction identification of expression vector

2.4 啟動(dòng)子的GUS活性分析

將構(gòu)建好的4個(gè)啟動(dòng)子表達(dá)載體轉(zhuǎn)入到根癌農(nóng)桿菌GV3101中，瞬時(shí)轉(zhuǎn)化煙草，用GUS進(jìn)行染色，觀察煙草葉片的著色程度。如圖4所示，陰性對(duì)照（非轉(zhuǎn)基因型煙草）葉片中看不到任何著色情況（圖4-A）；由35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS陽(yáng)性對(duì)照，葉片著色深（圖4-B）；SikCDPK1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS的葉片著色表現(xiàn)為整個(gè)葉片都有藍(lán)色，著色程度相對(duì)35S弱（圖4-C），缺失片段P1（821 bp）著色較其他缺失體明顯，面積大，且顏色相對(duì)較深（圖4-D），P2（480 bp）著色程度相對(duì)較低（圖4-E），面積大，P3（181 bp）僅零星有藍(lán)色斑點(diǎn)（圖4-F），著色面積最小且著色程度最低。說(shuō)明啟動(dòng)子全長(zhǎng)P0與缺失體P1、P2、P3均能啟動(dòng)報(bào)告基因的表達(dá)，啟動(dòng)活性大小依次為 P0＞P1＞P2＞P3。

圖4 SikCDPK1啟動(dòng)子瞬時(shí)轉(zhuǎn)化煙草GUS染色分析Fig. 4 GUS staining analysis of transient transformed tobacco with SikCDPK1 promoter

2.5 pSikCDPK1啟動(dòng)子響應(yīng)低溫和模擬干旱處理的表達(dá)活性

利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法注射煙草葉片，以35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的植株作為陽(yáng)性對(duì)照，通過(guò)GUS染色來(lái)分析SikCDPK1啟動(dòng)子在逆境脅迫條件下對(duì)報(bào)告基因的誘導(dǎo)特性。結(jié)果（圖5-A）表明，低溫處理下陽(yáng)性對(duì)照組中煙草葉片著色都較深，pSikCDPK1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS葉片著色情況隨著低溫處理時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)出先加深再減弱的情況，它們的GUS酶活也是隨著低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，在3 h時(shí)達(dá)到了頂峰，此時(shí)GUS酶活為28.972 7 nmol 4-MU·min-1·mg-1。PEG處理?xiàng)l件下，pSikCDPK1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS葉片著色情況與在低溫脅迫條件下的情況基本相似，即隨著脅迫處理時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)出先加深再減弱的情況（圖5-B），它們的GUS酶活也是隨著低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，在3 h時(shí)達(dá)到了頂峰，GUS酶活為29.907 9 nmol 4-MU·min-1·mg-1。說(shuō)明pSikCDPK1在低溫、干旱下，都能驅(qū)動(dòng)GUS基因在煙草中的表達(dá)，pSikCDPK1活性和脅迫時(shí)間有關(guān)，下游報(bào)告基因表達(dá)強(qiáng)度和啟動(dòng)子活性有關(guān)。

圖5 脅迫處理下GUS染色分析及酶活力的測(cè)定Fig. 5 Gus staining analysis and enzyme activity determination under stress treatment

3 討論

CDPKs是植物對(duì)抗逆境脅迫的一種重要的蛋白，CDPKs能夠在感知Ca2+信號(hào)時(shí)直接激活和調(diào)節(jié)靶蛋白，從而使靶蛋白正常發(fā)揮功能，在植物面對(duì)非生物脅迫時(shí)起到重要作用［6］。CDPKs相關(guān)功能的研究在雪蓮中也有一定的進(jìn)展［4］，然而，目前對(duì)于這類基因功能的研究多是依據(jù)基因表達(dá)的時(shí)空模式或轉(zhuǎn)基因株系的表型分析，對(duì)基因的調(diào)控機(jī)制研究甚少。

啟動(dòng)子通常被稱為“轉(zhuǎn)錄網(wǎng)關(guān)”，在植物基因的表達(dá)調(diào)控中起關(guān)鍵作用，啟動(dòng)子的表達(dá)活性水平調(diào)控受到與啟動(dòng)子中各種響應(yīng)元件結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子以及其所形成的復(fù)合物來(lái)決定［7］。瞬時(shí)表達(dá)是檢驗(yàn)啟動(dòng)子是否具備啟動(dòng)下游結(jié)構(gòu)基因表達(dá)的活性功能的常用驗(yàn)證方法［8］。啟動(dòng)子的核心區(qū)域?qū)虻谋磉_(dá)調(diào)控起關(guān)鍵作用，5'端分段缺失是尋找啟動(dòng)子啟動(dòng)活性關(guān)鍵區(qū)域的有效方法。為了探究SikCDPK1 基因啟動(dòng)子的核心區(qū)域，本研究分別構(gòu)建了全長(zhǎng)啟動(dòng)子和3個(gè)5'端缺失啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS重組表達(dá)載體，通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)化煙草，利用GUS組織化學(xué)染色顏色深淺判斷不同長(zhǎng)度啟動(dòng)子的活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同長(zhǎng)度啟動(dòng)子的活性強(qiáng)弱不同，最小的缺失片段P3著色面積小且淺，說(shuō)明該區(qū)間啟動(dòng)活性較弱。缺失片段P2、P1著色依次加深，全長(zhǎng)P0著色最濃，初步推斷該啟動(dòng)子的核心啟動(dòng)子區(qū)域可能位于P0與P2（-1 042- -408 bp）之間。

啟動(dòng)子是重要的調(diào)控元件，在一定程度上決定了基因的表達(dá)時(shí)間和空間次序，通過(guò)研究啟動(dòng)子的活性和功能，有助于深入研究基因的功能和表達(dá)調(diào)控機(jī)制。SikCDPK1基因可提高轉(zhuǎn)基因植物的耐干旱、低溫的能力。本研究發(fā)現(xiàn)，雪蓮SikCDPK1的啟動(dòng)子區(qū)域中含有1個(gè)W-box、1個(gè)GT1和2個(gè)LTRE等與非生物脅迫及激素誘導(dǎo)相關(guān)的順式作用元件。其中W-box是可和特定WRKY轉(zhuǎn)錄因子相結(jié)合，而WRKY轉(zhuǎn)錄因子的不同成員可參與包括病害、高溫、干旱、高鹽等，還與SA、JA、ET等信號(hào)通路相關(guān)［9-14］。LTRE元件是與低溫脅迫相關(guān)的元件［15-19］。GT1元件在大豆中存在，且是響應(yīng)鹽脅迫的主要順式作用元件［20］。為了解雪蓮SikCDPK1基因響應(yīng)逆境的表達(dá)調(diào)控特性，本研究通過(guò)TAIL-PCR技術(shù)克隆到SikCDPK1基因的啟動(dòng)子序列，啟動(dòng)子序列預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)該啟動(dòng)子區(qū)域除了含有啟動(dòng)子活性重要位點(diǎn)TATA-box和CAAT-box［21］外，還含有MYB-core、ACGTATERD1、LTRECOREATCOR15、CBFHV等和干旱、低溫相關(guān)的順式作用元件。在大豆和茶樹的相關(guān)研究中也有這些元件存在，發(fā)現(xiàn)它們?cè)诟珊岛偷蜏卣T導(dǎo)的基因表達(dá)中起作用［20，22］。

為探究這些元件是否在SikCDPK1基因的啟動(dòng)子中起作用，本研究分別對(duì)全長(zhǎng)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的煙草進(jìn)行了不同時(shí)間的冷脅迫和PEG處理，并進(jìn)行了GUS染色和酶活性測(cè)定，發(fā)現(xiàn)冷和PEG處理都可誘導(dǎo)GUS基因的表達(dá)，GUS基因的酶活性隨著冷和干旱處理時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在處理3 h時(shí)酶活性最高，這說(shuō)明低溫和干旱處理都可在短期內(nèi)快速增強(qiáng)pSikCDPK1的啟動(dòng)活性，pSikCDPK1活性和脅迫時(shí)間有關(guān)，pSikCDPK1的活性越高，下游報(bào)告基因表達(dá)的強(qiáng)度越強(qiáng)。推測(cè)SikCDPK1基因啟動(dòng)子可能也會(huì)通過(guò)MYB-core、ACGTATERD1、LTRECOREATCOR15、CBFHV 等干旱、低溫相關(guān)的順式作用元件，調(diào)控SikCDPK1基因?qū)Ω珊?、低溫的響?yīng)時(shí)間和響應(yīng)程度。

SikCDPK1基因啟動(dòng)子序列中還發(fā)現(xiàn)有參與茉莉酸甲酯響應(yīng)的CGTCA-motif、TGACG-motif，參與ABA誘導(dǎo)響應(yīng)的ABRE和DPBFCOREDCDC3，參與赤霉素響應(yīng)的TATC-box等激素響應(yīng)元件，這些響應(yīng)元件的具體功能以及調(diào)控方式也有待進(jìn)一步研究和探討。這些研究將為深入探討SikCDPK1基因的上游調(diào)控序列和解析SikCDPK1基因響應(yīng)逆境脅迫的調(diào)控機(jī)制提供了理論依據(jù)。

4 結(jié)論

成功克隆了雪蓮SikCDPK1基因的啟動(dòng)子，通過(guò)GUS 組織化學(xué)染色和GUS酶活性測(cè)定證實(shí)了SikCDPK1啟動(dòng)子具有啟動(dòng)活性，低溫和干旱脅迫可在短期內(nèi)快速增強(qiáng)SikCDPK1啟動(dòng)子的活性，SikCDPK1基因啟動(dòng)子可通過(guò)其相關(guān)順式作用元件調(diào)控下游基因的表達(dá)強(qiáng)度。