水稻鹽敏感突變體ss2的鑒定與基因功能分析

陳光 李佳 杜瑞英 王旭

（1. 廣東省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與監(jiān)測技術研究所，廣州 510640；2. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測與評價重點實驗室，廣州 510640；3. 廣東省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風險評估重點實驗室，廣州 510640；4. 杭州師范大學生命與環(huán)境科學學院，杭州 311121）

鹽脅迫嚴重影響作物的產(chǎn)量，特別是對生長在灌溉條件下或容易受到海水侵蝕的沿海低地的作物［1］。目前，全球超過20%的耕地受到土壤鹽分的影響［2］。預測到2050年，由于全球氣候的迅速變化，幾乎一半的耕地將處于鹽漬化狀態(tài)［3］。在單子葉作物中，水稻對鹽脅迫較敏感，土壤鹽分積累帶來的影響包括滲透脅迫、離子毒害和營養(yǎng)缺乏，最終導致生長抑制和產(chǎn)量降低［4］。滲透調(diào)節(jié)是水稻適應鹽脅迫的一個重要機制，通過調(diào)控體內(nèi)無機離子（Na+、K+、Cl-）和有機溶質(zhì)（可溶性碳水化合物、氨基酸等）的積累，在高鹽逆境下維持水分吸收和細胞膨壓［5］。在分子水平上，調(diào)控參與不同代謝途徑的基因表達來控制鹽分的攝取、維持離子穩(wěn)態(tài)以及細胞的生長速率［2］。

碳水化合物（主要是蔗糖），在源器官中通過光合作用產(chǎn)生并經(jīng)維管組織在植物體內(nèi)轉(zhuǎn)運。作為營養(yǎng)物質(zhì)，糖分的合成、存儲和長距離轉(zhuǎn)運到庫器官（例如，根、花和種子），是維持植物生長和發(fā)育所必需的［6-7］。作為重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，糖分較多的積累在受脅迫的植株液泡中，產(chǎn)生較高的膨壓。在鹽脅迫下，高耐受性小麥中葡萄糖、果糖、蔗糖和果聚糖的含量遠高于敏感小麥［8］。胡楊對高鹽脅迫的響應是可溶性總糖在幼葉中增加，在成熟葉中減少［9］。在玉米中，接種叢枝菌根真菌的植株耐鹽性顯著高于未接種植株，原因在于其體內(nèi)可溶性糖含量更高［10］。鹽脅迫導致秈稻品種葉片、根系以及韌皮部汁液中蔗糖含量增加［11］。

盡管已有研究發(fā)現(xiàn)糖分代謝變化是植物對非生物脅迫響應的重要生理表征，但是糖分轉(zhuǎn)運和分配與水稻耐鹽性的關系研究鮮有報道，并且通過調(diào)控糖轉(zhuǎn)運來影響水稻對高鹽脅迫響應的關鍵功能基因和信號轉(zhuǎn)導通路尚不清楚。本研究篩選鑒定出一個水稻鹽脅迫超敏感突變體，圖位克隆到基因SS2，通過表型、生理、遺傳解析，明確其參與的糖分代謝與水稻耐鹽性之間的相互關系和作用機制，完善水稻響應高鹽脅迫的分子調(diào)控網(wǎng)絡，進而針對性開展以抗性為目標的分子設計育種，為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)可持續(xù)發(fā)展創(chuàng)造新的耐鹽穩(wěn)產(chǎn)種質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料

鹽敏感突變體ss2是武運粳7號經(jīng)甲基磺酸乙酯（EMS）誘變和NaCl脅迫篩選后獲得。以突變體ss2為母本，秈稻南京6號為父本雜交得到 F1，自交后生成的 F2分離群體用于遺傳分析和基因定位。上述材料種植于廣東省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與監(jiān)測技術研究所廣州大豐試驗基地和中國水稻研究所海南陵水試驗基地。鹽脅迫篩選和處理在人工氣候室進行，光照14 h（30℃），黑暗10 h（25℃），相對濕度保持在70%，每隔 2 d更換一次營養(yǎng)液，營養(yǎng)液配方詳見Chen等［12］。篩選鹽脅迫響應突變體和鑒定遺傳互補轉(zhuǎn)基因材料的耐鹽性，將長勢一致的10 d齡幼苗用終濃度為100 mmol/L NaCl的營養(yǎng)液處理4 d，分析表型和測定生理指標。為考察分蘗期ss2與野生型（WT）植株對鹽脅迫響應的差異，用正常營養(yǎng)液培養(yǎng)至6周苗齡，然后轉(zhuǎn)入終濃度為150 mmol/L NaCl的營養(yǎng)液中培養(yǎng)4 d，處理后檢測生理參數(shù)和基因表達模式。實驗重復3次，每次實驗每個處理單個種質(zhì)5株苗。

1.2 方法

1.2.1 Na+和K+濃度的測定 脅迫處理后收獲植株，在0.1 mmol/L CaSO4溶液中漂洗5 min，地上部和根系分開，105℃烘干30 min，70℃烘干至恒重，研磨成粉末后稱樣，消煮冷卻后用蒸餾水稀釋至50 mL。用Optima 2100DV ICP發(fā)射光譜儀（PerkinElmer公司，美國）測定消化液中Na+和K+濃度。

1.2.2 葉綠素含量的測定 參照Chen等［13］的測定方法，收獲植株葉片，稱重并用95%（V/V）的乙醇溶液提取，使用分光光度計（Shimadzu UV2400，日本）在波長663和645 nm處記錄提取液的吸光度（A）?？?cè)~綠素含量的計算公式為8.02A663+20.21A645。

1.2.3 凈光合速率（Pn）的測定 參照Chen等［13］的方法，利用Li-COR6400便攜式光合儀（Li-COR，美國）測定上午9：00-11：00水稻葉片的凈光合速率。

1.2.4 過氧化氫（H2O2）和丙二醛（MDA）含量測定 脅迫處理后收獲植株的地上部，液氮研磨成粉末，利用H2O2和MDA試劑盒（蘇州科銘生物技術有限公司）分別提取并參照Chen等［14］的方法進行測定。

1.2.5 蔗糖含量的測定 脅迫處理后收獲植株的葉片和根系，液氮研磨成粉末，利用蔗糖試劑盒（蘇州科銘生物技術有限公司）提取并參照Chen等［15］的方法進行測定。

1.2.6 蔗糖外運速率（SER）的測定 從源葉中收集韌皮部滲出液，葉片的切口端立即浸入20 mL 30 mmol/L EDTA溶液中（pH 7.0），黑暗中浸泡15 min。為了避免木質(zhì)部滲出液的影響，棄去第一次的EDTA溶液，然后將葉片洗凈，轉(zhuǎn)移至10 mL 30 mmol/L EDTA溶液中，整個采集過程中，葉片置于高相對濕度的密閉暗室。4 h后，利用蔗糖試劑盒測定收集液中的蔗糖濃度。

1.2.7 實時熒光定量PCR （RT-qPCR）分別提取正常和鹽脅迫條件下植株源葉的RNA。水稻UBQ5（LOC_Os01g22490）為內(nèi)參基因，參照Chen等［16］的算法確定相對表達豐度，實驗中使用的各種定量引物序列見表1。

表1 熒光定量PCR所用引物Table 1 Primer sequences used for RT-qPCR assays

1.2.8 基因定位與候選基因確定 用CTAB法提取親本及群體的DNA，用實驗室已有的分布于水稻12條染色體上的SSR標記引物，通過混池法初步確定連鎖位點，對初定位區(qū)間內(nèi)的粳稻日本晴與秈稻9311序列進行差異分析，利用 Primer Premier 5 軟件設計加密引物，進一步基因定位，相關引物序列見表2。根據(jù)GRAMENE網(wǎng)站（http：//ensembl.gramene.org/），分析定位區(qū)間內(nèi)所有的編碼框（ORF），設計引物對野生型武運粳7號和ss2分別進行測序，用DNAstar軟件序列比對，明確候選基因和突變位點，構(gòu)建遺傳圖譜。

表2 基因定位所用的標記引物Table 2 Marked primer used for gene mapping

1.2.9 互補轉(zhuǎn)基因材料構(gòu)建 以野生型武運粳7號基因組DNA為模板，擴增包含SS2編碼區(qū)及上下游序列的6 174 bp片段，純化后用GBclonart無縫克隆試劑盒（蘇州神洲基因有限公司）連接到pCAMBIA1300載體上，電擊法將測序正確的質(zhì)粒導入農(nóng)桿菌EHA105，侵染ss2突變體的成熟胚愈傷，水稻遺傳轉(zhuǎn)化方法詳見Chen等［17］。

1.2.10 統(tǒng)計學分析 用SPSS10軟件的Tukey法比較分析不同樣品和處理間的差異顯著性，不同的字母表示在P＜0.05水平下具有顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 高鹽脅迫篩選獲得ss2突變體

在100 mmol/L NaCl處理條件下，篩選EMS誘導的粳稻武運粳7號突變體庫，鑒定出一個高鹽脅迫超敏感突變材料ss2（salinity sensitive 2）。如圖1-A所示，在正常培養(yǎng)條件下，幼苗期ss2和野生型（WT）的長勢基本一致。鹽脅迫對水稻苗的生長均有抑制，但抑制程度明顯不同，ss2植株嚴重萎蔫，葉片褪綠，而WT僅表現(xiàn)輕微萎蔫和葉尖枯萎（圖1-A）。此外，脅迫處理導致WT和ss2的地上部生長受到抑制，受鹽脅迫的ss2幼苗株高和鮮重的下降幅度顯著高于WT（圖1-B，C）。在100 mmol/L NaCl處理下，ss2突變體的地上部鮮重只有WT的50%（圖1-C）。與此同時，在正常培養(yǎng)環(huán)境中的ss2地上部Na+濃度和鈉鉀濃度比與WT無顯著差異，鹽脅迫下卻分別高于野生型40%和45%（圖1-D，E）。

圖1 正常和鹽脅迫條件下SS2突變對幼苗期水稻生長的影響Fig.1 Effects of SS2 mutation on the growth performance of seedlings under normal and salinity stress

2.2 SS2突變降低分蘗期水稻對鹽脅迫的耐受性

為進一步揭示SS2在水稻鹽脅迫響應中的作用，將6周齡的ss2突變體和野生型（WT）在正常和含150 mmol/L NaCl的營養(yǎng)液中水培4 d，比較正常條件下生長的ss2和WT植株葉片，發(fā)現(xiàn)前者的總?cè)~綠素含量低于后者，在NaCl處理的植株中，ss2葉綠素含量顯著降低，而WT保持相對穩(wěn)定（圖2-A）。對非脅迫植株葉片Pn的測定也揭示了突變體與WT之間存在顯著差異，在鹽脅迫植株中，ss2與野生型Pn的差異被放大（圖2-B）。這些結(jié)果表明，SS2突變降低分蘗期水稻植株的耐鹽性。

圖2 分蘗期WT和ss2對鹽脅迫的生理響應Fig. 2 Physiological responses of WT and ss2 to salinity stress during tillering stage

2.3 SS2突變對水稻體內(nèi)糖分轉(zhuǎn)運的影響

鑒于總?cè)~綠素含量和Pn與植物體內(nèi)光合同化物的生成密切相關，推測SS2通過調(diào)控糖代謝改變水稻對鹽脅迫的敏感性。為了驗證該假說，首先測定了源器官葉片中的蔗糖含量，發(fā)現(xiàn)在正常條件下，ss2的蔗糖含量比WT高15%，而在NaCl處理的植株葉片中，該值增加到24%（圖3-A）。與之相反，SS2突變導致非脅迫條件下庫器官根中的蔗糖含量顯著降低，NaCl處理對WT根的影響相對較弱，導致受脅迫的ss2根中的蔗糖含量比WT低約16%（圖3-B）。與根中蔗糖含量的趨勢一致，在正常條件下，ss2植株源葉的蔗糖外運速率低于WT 23%，在鹽脅迫下，該值增加到44%（圖3-C），表明SS2突變顯著抑制源器官中蔗糖向韌皮部的裝載。

圖3 鹽脅迫下WT和ss2的蔗糖轉(zhuǎn)運差異分析Fig. 3 Comparison of sucrose transportation between WT and ss2 in response to salinity stress

我們對WT和ss2源葉中參與糖轉(zhuǎn)運的基因進行表達差異分析，在正常條件下，4個被檢測的基因均下調(diào)表達（圖4-A-D）。此外，鹽脅迫抑制OsSUT4（Os02g0827200）、OsSWEET11（Os08g0535200）、Os-SWEET14（Os11g0508600）和 OsMT（Os04g0602400）在WT和ss2中的表達，但ss2的降幅大于WT，導致差異更加顯著（圖4-A-D），表明糖轉(zhuǎn)運相關基因的表達量顯著降低，是SS2突變抑制蔗糖從源到庫轉(zhuǎn)運的重要原因。

圖4 SS2突變對WT和ss2源葉中糖轉(zhuǎn)運相關基因表達的影響Fig.4 Effects of SS2 mutation on the expressions of genes related to sugar transport in WT and ss2 leaves

2.4 SS2基因的精細定位和互補驗證

利用秈稻品種南京6號與ss2組配的F2分離群體，將目的基因初定位在第10號染色體的標記SS11和SS32之間（圖5-A）。根據(jù)日本晴和9311序列差異設計InDel標記，最終將目的基因精細定位到BAC克隆OSJNBa0057L21上標記SS23和SS24之間的55 kb范圍內(nèi)（圖5-B），在該區(qū)間內(nèi)共有11個預測基因，通過測序發(fā)現(xiàn)ss2中 LOC_Os10g41780的第2外顯子（基因編碼區(qū)第259位堿基）發(fā)生了單堿基替換（C突變?yōu)門），使編碼蛋白序列第87位的谷氨酰胺（Gln）突變成終止密碼，從而導致翻譯提前終止（圖5-C）。

圖5 SS2的圖位克隆Fig.5 Map-based cloning of SS2

構(gòu)建互補轉(zhuǎn)基因材料（COM）用以驗證ss2鹽敏感性狀的產(chǎn)生是否由候選基因的突變所引起，如圖6所示，在鹽脅迫條件下，轉(zhuǎn)基因株系的表型、地上部和根系干重、H2O2和 MDA 含量與野生型相比均沒有差異，植株的耐鹽性恢復正常。

圖6 鹽脅迫下WT和互補轉(zhuǎn)基因株系的生長差異分析Fig.6 Difference analysis in the growth performance of complementary transgenic plant compared with WT in response to salinity stress

3 討論

通過EMS誘變、T-DNA插入等方式創(chuàng)制水稻突變體庫，利用各種處理模擬脅迫環(huán)境對其進行篩選，獲得相應敏感或抗性突變體，進而構(gòu)建定位群體圖位克隆到功能基因，是挖掘脅迫響應關鍵新基因的重要途徑，研究團隊已經(jīng)通過該方法，成功克隆到分別參與氧化、高鹽逆境響應的基因RLS1和FLN2［15-16］。本研究通過 100 mmol/L NaCl篩選 EMS誘變的武運粳7號突變體庫，圖位克隆到基因SS2（LOC_Os10g41780），并通過遺傳互補驗證其準確性，分析發(fā)現(xiàn)該基因與Lee等［18］報道的OsCAO1和Yang等［19］報道的PGL基因等位，前人研究發(fā)現(xiàn)其編碼葉綠素a加氧酶，催化葉綠素b的合成，突變后葉呈淡綠色，葉綠素含量和光合速率降低，這與本研究中處于分蘗期的ss2一致但新發(fā)現(xiàn)SS2影響水稻的耐鹽性。

隨著葉綠素含量和凈光合速率的下降，ss2源葉片中的蔗糖含量理論上應該低于野生型（WT），而本研究的結(jié)果卻相反。我們推測這種現(xiàn)象與韌皮部外運速率受到限制有關，原因有以下三方面：一是，在ss2源葉片中，以每單位鮮重葉片為單位的韌皮部蔗糖外運顯著減少；二是，與WT相比，ss2源葉中參與糖轉(zhuǎn)運的基因表達量均顯著下調(diào)；三是，ss2根系蔗糖含量明顯降低。SS2突變降低水稻的耐鹽性，與體內(nèi)糖分轉(zhuǎn)運受抑制密切相關。鹽脅迫下，ss2與WT在蔗糖從源到庫運輸方面與正常條件相比差異更為顯著，同時伴隨著ss2的鹽敏感表型。鹽害等環(huán)境脅迫通過誘導糖的生物合成和轉(zhuǎn)運基因的表達來提高糖分的積累，對增強耐鹽性至關重要［20］。許多蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白基因（SUTs）參與非生物脅迫的響應［21］。在擬南芥中，AtSUC4和AtSUC9通過調(diào)節(jié)蔗糖分配和代謝參與植株的抗逆性［22-23］。在蘋果中，過表達MdSUT2.2促進糖分積累，提高植株的耐鹽和抗旱性［24-25］。在水稻中，OsSUT1和OsSUT2參與鹽和干旱脅迫響應［26-27］。SS2突變顯著抑制源葉中OsSUT4的表達，尤其在鹽脅迫條件下，表明SS2可能通過調(diào)控OsSUT4介導的糖分配來影響水稻的耐鹽性。此外，非生物脅迫下SWEETs轉(zhuǎn)運蛋白對調(diào)控糖分的積累有重要作用［24］。DsSWEET12和DsSWEET17影響擬南芥體內(nèi)的糖代謝并賦予植株多重耐逆性［28-29］。 鹽 脅 迫 誘 導 OsSWEET13 和 OsSWEET15表達上調(diào)，導致韌皮部汁液中蔗糖含量升高，葉片以及根中的蔗糖分配發(fā)生改變［11］。本研究發(fā)現(xiàn)，OsSWEET11和OsSWEET14在受脅迫的ss2源葉中的表達量顯著低于WT。鑒于SS2編碼的是功能酶而非轉(zhuǎn)錄因子，OsSUTs和OsSWEETs等糖轉(zhuǎn)運基因的表達在ss2葉片中受抑制的直接原因可能與糖穩(wěn)態(tài)遭到破壞有關，這與Chen等［15］報道的osfln2敲除突變體對鹽脅迫的響應相似。綜上所述，SS2突變抑制鹽脅迫下糖分從源葉到庫根的分配，是導致ss2鹽敏感的主要原因之一。

植株的活力或生長速率在一定程度上可以影響地上部的Na+濃度，從而調(diào)控水稻的耐鹽性［30］。多項研究表明，鹽脅迫下的生長速率可以反映不同品種的耐鹽性，因為其通過稀釋作用降低了離子毒害［31-32］。在本研究中，鹽脅迫下苗期和分蘗期ss2地上部的生長速率均顯著低于WT，可能是作為營養(yǎng)物質(zhì)的糖分供應不足所致。因此，SS2突變通過減少蔗糖等碳水化合物的供應來抑制植株的生長，是降低ss2鹽脅迫適應性的另一個原因。

SS2的等位基因PGL定位在葉綠體上［19］，我們前期研究克隆的FLN2基因同樣定位在葉綠體并調(diào)控水稻糖分代謝［15］，兩個基因之間是否有相互作用？光合同化物的生成與長距離轉(zhuǎn)運之間的分子聯(lián)系和反饋機制如何？過表達SS2是否可以提高水稻的耐鹽性？這些問題是未來進一步研究的重點。

4 結(jié)論

NaCl篩選武運粳7號EMS突變體庫，獲得鹽敏感突變體ss2。SS2突變抑制蔗糖從源到庫的長距離運輸和植株的生長，進而降低水稻的耐鹽性。