大腸埃希菌異質(zhì)性耐藥的研究進展

趙艷坤 劉慧敏 孟璐 王成 王加啟 鄭楠

（1. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室（烏魯木齊）新疆農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全實驗室，烏魯木齊 830091；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193）

大腸埃希菌（Escherichia coli）是一種在微生物界具有特殊地位的致病菌，可以引起人類和動物的嚴重感染。2020年的中國細菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)分析報告顯示，革蘭氏陰性菌是最常見的醫(yī)源性細菌，其檢出率高達71%［1］，其中E.coli位居首位，給臨床治療帶來了巨大的挑戰(zhàn)。近年來，隨著抗菌藥物在臨床和畜牧業(yè)的大量及不合理使用，E.coli耐藥性問題日趨嚴重，對現(xiàn)有可用抗菌藥物均存在耐藥性，尤其是多重耐藥（multi-drug resistance，MDR）及泛耐藥（pan-drug resistance，PDR）的出現(xiàn)，同時，E.coli也是耐藥基因的主要儲存庫，既是耐藥基因的供體，又是耐藥基因的受體，可導(dǎo)致動物-人類-環(huán)境之間耐藥的傳播，已經(jīng)成為全球性醫(yī)學(xué)與社會問題，嚴重威脅當(dāng)下的公共健康安全。

研究發(fā)現(xiàn)，E.coli還存在另一種耐藥情況，即細菌異質(zhì)性耐藥（heteroresistance，HR）［2］。通過特殊的檢測方法，從一些常規(guī)藥敏實驗中表現(xiàn)敏感而抗菌藥物治療不佳的臨床患者分離培養(yǎng)的細菌中檢測到耐藥甚至更高水平耐藥的亞群，正是這些耐藥亞群的存在將很可能導(dǎo)致患者反復(fù)感染和治療失?。?］。這一現(xiàn)象在包括E.coli在內(nèi)的多種細菌中已有較多報道。早在1994年已有E.coli對甲硝唑產(chǎn)生異質(zhì)性耐藥而導(dǎo)致治療失敗的報道［4］，近年來，E.coli對碳青霉烯類、多黏菌素、磷霉素、替加環(huán)素、頭孢噻呋、哌拉西林/他唑巴坦等抗菌藥物也出現(xiàn)了異質(zhì)性耐藥現(xiàn)象，但其異質(zhì)性耐藥機制尚未明晰。本文簡要綜述E.coli的異質(zhì)性耐藥流行狀況以及異質(zhì)性耐藥現(xiàn)象的機制，旨在積極響應(yīng)人-動物-環(huán)境“One Health”理念，為進一步加深對E.coli異質(zhì)性耐藥的認識和重視，為其評估治療方案和指導(dǎo)臨床抗菌藥物的合理使用提供參考。

1 異質(zhì)性耐藥的發(fā)現(xiàn)及特征

異質(zhì)性耐藥的定義是指某個單一分離菌株，在其培養(yǎng)的群體中存在著對某種藥物敏感性不同的亞群，即有些亞群對該藥物敏感，而另一些亞群則存在對該藥物耐藥的情況［2］。異質(zhì)性現(xiàn)象最早于1947年被描述［5］，在鏈霉素治療嗜血桿菌感染的流感病人期間，14人中3人治療失敗并且被證明是由于病人機體內(nèi)嗜血桿菌對鏈霉素的敏感性發(fā)生了變化，但一直未得到重視。直到1999年日本報告1例男性肺癌術(shù)后的痰標(biāo)本中分離到1株耐甲氧西林的葡萄球菌，其萬古霉素最小抑制濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）為3 mg/L，按照國際臨床實驗室的標(biāo)準(zhǔn)化委員會（NCCLS）規(guī)定屬于敏感菌，但用萬古霉素治療12 d無效，后用特殊的檢測方法確定為異質(zhì)性耐藥萬古霉素菌株［6］。逐步引起部分專家的關(guān)注，但研究大多致力于醫(yī)院金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、陰溝腸桿菌等表型異質(zhì)性耐藥研究，幾乎不涉及動物源病原菌異質(zhì)性耐藥。直到2015年，El-Halfawy和Valvano發(fā)表了題為“抗菌藥物異質(zhì)性：一個需要明確的新興領(lǐng)域”的重要評述［7］，引起全球各領(lǐng)域關(guān)注，開啟關(guān)于細菌異質(zhì)性耐藥的廣泛研究。

異質(zhì)性耐藥主要有3種形式［8］。（1）整個細菌群體對抗菌藥物完全敏感，而亞群的MIC則不同，這種形式在臨床最不重要（除非反應(yīng)最差的亞群對抗菌藥物產(chǎn)生耐藥）；（2）細菌最經(jīng)典的異質(zhì)性耐藥，即大多數(shù)細菌種群對抗菌藥物敏感，有少數(shù)高度耐藥，以傳統(tǒng)藥物敏感性折點為指導(dǎo)的抗菌藥物治療會導(dǎo)致失?。唬?）整個細菌種群（包括抵抗力最低的亞群）都具有耐藥性或中等耐藥性，其中一組亞群顯示出對抗菌藥物耐藥性增加。

異質(zhì)性耐藥是一種現(xiàn)象，其主要特征包括：（1）異質(zhì)性耐藥的細菌仍能在抗菌藥物暴露下存活，部分細菌亞群的MIC值顯著增加（至少8倍）［2］；（2）異質(zhì)性耐藥的耐藥表型不穩(wěn)定，當(dāng)抗菌藥物壓力下降時，細菌會恢復(fù)到抗菌藥物敏感狀態(tài)［9］；（3）異質(zhì)性耐藥分離株中耐藥細菌的頻率非常低（＜1/10 000），耐藥細菌亞群在總?cè)后w中占少數(shù)［10］。目前，公認的MIC是細菌敏感或者耐藥的判斷標(biāo)準(zhǔn)，然而，由于異質(zhì)性耐藥典型的特征，為評估抗菌藥物對致病菌的治療效果帶來了極大困難，使MIC數(shù)據(jù)的可靠性降低，且異質(zhì)性耐藥常被錯誤分類為抗菌藥物敏感，從而導(dǎo)致抗菌藥物治療時不僅不能治療感染，反而將逐漸進化為耐藥，促進了耐藥突變株的產(chǎn)生，造成反復(fù)感染，病程延長，導(dǎo)致治療失敗。因此，及時檢測表型異質(zhì)性耐藥，精準(zhǔn)選擇抗菌藥物，才能達到成功的治療結(jié)果。

2 異質(zhì)性耐藥的檢測方法

迄今為止，尚無檢測異質(zhì)性耐藥的“金標(biāo)準(zhǔn)”，不同實驗室、不同菌株使用的檢測方法各不相同。目前，用于檢測異質(zhì)性耐藥的主要方法包括：E-test法、K-B紙片擴散法和群體譜分析法（population analysis profiling，PAP）。E-test法、K-B法 均 為 異質(zhì)性耐藥檢測的初篩方法，當(dāng)抑菌圈內(nèi)有散在菌落出現(xiàn)時即為疑似異質(zhì)性耐藥菌株，方法簡便、直觀，但假陰性、假陽性檢出率較高，并且無法對各亞群的耐藥程度及耐藥亞群數(shù)量進行定量。PAP法被認為是檢測異質(zhì)性耐藥菌株最可靠的方法，PAP通常使用標(biāo)準(zhǔn)MIC測定的格式，以2倍抗菌藥物增量，并通過使用擴散板技術(shù)進行CFU計數(shù)，當(dāng)異質(zhì)性耐藥亞群比主要群體的MIC高8倍，且異質(zhì)性耐藥的發(fā)生頻率≥1×10-7，則被判定為異質(zhì)性耐藥菌株［11］，但其成本高，耗時長，不能快速有效地對樣本進行檢測。隨后，對PAP進行了改良，出現(xiàn)了微量稀釋PAP法（microtitration population analysis profiling，MPAP），研究表明，MPAP比常規(guī)PAP檢測更快、成本更低，且能夠明確異質(zhì)性亞群的頻率和MIC，但細菌密度較高可能會增加假陽性的風(fēng)險［12］。此外，改良的群體譜分析曲線法（PAP assay comparing the area under the curve，PAPAUC）是檢測異質(zhì)性萬古霉素中介金黃色葡萄球菌（Heterogeneous vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus，hVISA）的“金標(biāo)準(zhǔn)”［13］，但該方法操作更為繁瑣且昂貴，且可能會錯誤分類具有高度不同抗菌藥物濃度依賴性亞群大小的分離株，不適宜作為其他異質(zhì)性耐藥菌株的檢測。不同異質(zhì)性耐藥的檢測方法優(yōu)缺點見表1。

表1 異質(zhì)性耐藥的檢測方法對比Table 1 Comparison of detection methods for heteroresistance

近年來，隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，開發(fā)了一些異質(zhì)性耐藥檢測的新型方法，通過比較多種抗菌藥物濃度下的單個細菌生長情況，準(zhǔn)確識別與耐藥相關(guān)的異質(zhì)性。數(shù)字PCR（Droplet Digital PCR，dd PCR）可以檢測與耐藥性相關(guān)的基因或點突變，即使它們只存在于細菌的一個亞群中［20］。越來越多的臨床試驗采用全基因組測序法（whole genome sequencing，WGS）檢測分離菌株中耐藥亞群，通過菌株中耐藥亞群基因型的變化，確定異質(zhì)性耐藥［21］，WGS的準(zhǔn)確度遠高于傳統(tǒng)的表型檢測，但該方法對于檢測頻率＜1%的亞群仍有局限性。此外，雖然表型耐藥和基因型之間有較好的相關(guān)性，但仍存在一些差異，可能導(dǎo)致基因分型結(jié)果分析復(fù)雜化，這些方法作為臨床異質(zhì)性耐藥檢測仍面臨很大困難。因此，未來急需開發(fā)較低成本、較高準(zhǔn)確率以及識別較低頻率的耐藥亞群（遠低于1%）的臨床實用性異質(zhì)性耐藥檢測技術(shù)。

3 大腸埃希菌異質(zhì)性耐藥的研究現(xiàn)狀

3.1 大腸埃希菌對碳青霉烯類抗菌藥物異質(zhì)性耐藥的研究現(xiàn)狀

E.coli的異質(zhì)性耐藥相關(guān)研究常見于碳青霉烯類抗菌藥物，E.coli對碳青霉烯類異質(zhì)性耐藥（carbapenem-heteroresistant E.coli，CHEC）表型已在全球多項研究中進行了報道，幾乎都在人類醫(yī)學(xué)方面，E.coli對于不同研究之間表現(xiàn)出異質(zhì)性耐藥分離株流行率存在很大差異，從0%-100%（表2）。

表2 大腸埃希菌對碳青霉烯類抗菌藥物異質(zhì)性耐藥的流行情況Table 2 Prevalence of heteroresistance of E. coli to carbapenems

Nicoloff等［11］通過 E-test初步判定和 PAP 法對來自瑞典的11株醫(yī)院臨床分離的E.coli進行了異質(zhì)性耐藥性篩查，以最小抑菌濃度（MIC）/非抑菌濃度（NIC）（MIC/NIC）≥8來確定，其中厄他培南（ertapenem，ETP）顯示出最高的異質(zhì)性耐藥率（27.3%），而未發(fā)現(xiàn)E.coli對亞胺培南（imipenem，IPM）和美羅培南（meropenem，MEM）的異質(zhì)性耐藥現(xiàn)象。另一個來自美國的試驗通過紙片擴散初篩和改良的PAP方法測定E.coli的異質(zhì)性耐藥，MIC/NIC≥8判定其異質(zhì)性耐藥，發(fā)現(xiàn)E.coli對ETP、IPM和MEM均表現(xiàn)出很高的異質(zhì)性耐藥率，分別為35%，25%和30%。不難發(fā)現(xiàn)，CHEC在不同研究之間差異很大，表明碳青霉烯類抗菌藥物的用藥背景決定E.coli對異質(zhì)性耐藥的流行率，在國外，E.coli對ETP表現(xiàn)異質(zhì)性耐藥比對IPM和MEM和具有異質(zhì)性耐藥更常見。

2015年，Sun等［20］首次報道了中國侵襲性E.coli感染中的碳青霉烯類抗菌藥物異質(zhì)性耐藥的情況，該實驗通過紙片擴散或E-test篩選了332株臨床E.coli分離株的異質(zhì)性耐藥，結(jié)果顯示，114株E.coli對碳青霉烯類藥物具有異質(zhì)性耐藥性，CHEC的流行率為34.3%，PAP結(jié)果顯示，在ETP濃度高達10%的情況下，耐藥亞群的增長分別為≥4 mg/L和128 mg/L，能夠在最高藥物濃度下生長的耐藥亞群比例為8.00×10-8。E.coli異質(zhì)性耐藥率最高的為IPM（25%），其次是ETP（17.2%），對MEM的異質(zhì)性耐藥性率相對較低，為3.9%。另外，還發(fā)現(xiàn)了對碳青霉烯類藥物的共異質(zhì)性耐藥（Co-heteroresistance，CHR）的現(xiàn)象，達17.54%。此外，超廣譜 β-內(nèi)酰胺酶（extended-spectrum β-lactamase，

ESBL）的產(chǎn)生與E.coli分離株CHEC表型顯著相關(guān)。研究表明，ESBL產(chǎn)生是導(dǎo)致E.coli對ETP和IPM產(chǎn)生異質(zhì)性耐藥的一個關(guān)鍵因素，并被認為可能參與了對兩種抗菌藥物的CHR，產(chǎn)ESBL的細菌更多地具有CHR特征［26］。研究顯示，在對碳青霉烯類不敏感的E.coli中ESBL的流行率很高（96.7%），尤其是 CTX-M 型 ESBL［27］。湯麗霞等［24］采用 E-test初篩和PAP（MIC/NIC≥8）確定的檢測方法，在200株E.coli中共檢出83株碳青霉烯異質(zhì)性耐藥，CHEC的流行率為41.5%，對ETP、IPM和MEM的異質(zhì)性耐藥率分別為10%、19%和0.5%，同樣發(fā)現(xiàn)存在CHR現(xiàn)象，其中對IPM、ETP和MEM均表現(xiàn)為異質(zhì)性耐藥的E.coli比例為7.23%，與Sun等研究結(jié)果一致。另外，張文萍等［25］采用K-B紙片法聯(lián)合E-test和PAP的方法研究CHEC的流行情況，得到了趨勢一致的結(jié)果。這與國外的研究結(jié)果不盡一致，除地域差異，很大程度上取決于異質(zhì)性耐藥的定義方式和檢測方法及判定不統(tǒng)一?？赡艿脑蛞皇荌PM的抗菌選擇壓力要強于ETP和MEM，二是IPM的優(yōu)先使用在碳青霉烯類異質(zhì)性耐藥的高流行中起了關(guān)鍵作用。此外，不合理使用碳青霉烯類抗菌藥物和無視管理舉措都促進了E.coli對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥性的演變?？傊?，適當(dāng)使用MEM并謹慎使用IPM和ETP是全球碳青霉烯類治療E.coli的明智之舉。

3.2 大腸埃希菌對黏菌素類抗菌藥物異質(zhì)性耐藥的研究現(xiàn)狀

目前，E.coli對黏菌素的異質(zhì)性耐藥的研究相對較少（表3），Juhász等［28］使用含有4 mg/L黏菌素的瓊脂平板法和MIC法評估耐碳青霉烯類的E.coli對黏菌素的異質(zhì)性耐藥情況發(fā)現(xiàn)，異質(zhì)性耐藥性率僅為3.4%，遠低于碳青霉烯類，對黏菌素異質(zhì)性耐藥亞群的發(fā)生頻率在1.25×10-8-1.10×10-5。Liao等［29］研究發(fā)現(xiàn)291株E.coli中對黏菌素的耐藥率為0.69%，對黏菌素敏感的E.coli菌株中1.37%具有異質(zhì)性耐藥，其耐藥亞群的MIC值比親本菌株高16-64倍，耐藥亞群的發(fā)生頻率為4.00×10-7-4.00×10-6，在無抗培養(yǎng)基中傳代1周后，黏菌素對耐藥亞群的MIC值沒有變化，表明耐藥亞群的穩(wěn)定性良好。異質(zhì)性耐藥可以是穩(wěn)定的，即亞群在沒有抗菌藥物壓力下不恢復(fù)耐藥性，然而，異質(zhì)性耐藥多表現(xiàn)為不穩(wěn)定，即亞群在無抗菌藥物暴露下耐藥性降低或恢復(fù)為敏感［9］。鄺啟紅等［30］首次在中國豬源分離的E.coli中發(fā)現(xiàn)對黏菌素異質(zhì)性耐藥，采用PAP（MIC/NIC≥4）確認了12株MDR的E.coli中有11株顯示出異質(zhì)性耐藥（91.67%），說明MDR E.coli也傾向于表現(xiàn)異質(zhì)性耐藥，每個異質(zhì)性耐藥菌株均包含1個以上耐藥亞群，共獲得 17個耐藥亞群，且多個亞群對黏菌素的敏感性存在明顯差異，耐藥亞群的發(fā)生頻率為6.61×10-7-2.57×10-6。耐藥亞群在無抗培養(yǎng)50代后，大部分可以完全恢復(fù)到親本分離株的易感水平，說明大多數(shù)亞群是不穩(wěn)定和短暫的，只有一個亞群保持對黏菌素的耐藥性（MIC為4 mg/L），這也揭示了黏菌素治療失敗的原因?？紤]到實驗室中的常規(guī)抗菌藥物敏感性試驗往往會錯誤地將異質(zhì)性耐藥分離株識別為“易感”，實際卻存在不同程度的異質(zhì)性耐藥亞群，因此應(yīng)高度關(guān)注耐藥亞群的存在，El-Halfawy等［31］認為耐藥亞群的頻率隨抗菌藥物濃度而變化，為了便于未來不同研究之間的比較，建議應(yīng)盡可能報告抗菌藥物濃度高于原耐藥水平8倍的亞群頻率（圖1）。

圖1 異質(zhì)性耐藥判定標(biāo)準(zhǔn)的推薦方案（改自文獻［31］）Fig. 1 Recommended scheme for determination of heteroresistance（Modified from reference［31］）

表3 大腸埃希菌對粘菌素類抗菌藥物異質(zhì)性耐藥的流行情況Table 3 Prevalence of heteroresistance of E. coli to colistin antibiotics

近年來，E.coli的異質(zhì)性耐藥研究逐漸增多，相繼有報道表明E.coli對磷霉素、頭孢噻呋、替加環(huán)素等抗菌藥物存在異質(zhì)性耐藥。目前，關(guān)于E.coli異質(zhì)性耐藥幾乎均在人類分離株中進行，動物源相關(guān)的研究少之甚少，E.coli異質(zhì)性耐藥的流行來自不同的醫(yī)院或養(yǎng)殖場，屬于不同的克隆組，表明E.coli異質(zhì)性耐藥或許與特定的克隆或醫(yī)院無關(guān)，可能是自發(fā)進化的。鑒于人類中大部分食源性E.coli感染可以追溯到動物，所以對動物中E.coli異質(zhì)性耐藥研究可以為將來人類感染的耐藥機制提供思路，同時對動物臨床合理用藥以達到理想的治療效果具有重大意義。

4 大腸埃希菌的異質(zhì)性耐藥機制

4.1 碳青霉烯類抗菌藥物的異質(zhì)性耐藥機制

盡管對E.coli異質(zhì)性耐藥的研究已在逐漸深入，但目前E.coli異質(zhì)性耐藥的機制仍未十分明確，主要異質(zhì)性耐藥機制如圖2。E.coli對碳青霉烯類抗菌藥物異質(zhì)性耐藥的分子機制主要是產(chǎn)碳青霉烯酶、突變引起細菌外膜通透性下降［24］、膜孔蛋白缺失及外排泵高表達等。ESBL產(chǎn)生、孔蛋白缺乏和β-內(nèi)酰胺酶表達升高會降低E.coli對ETP的敏感性［32］。張文萍等［25］研究結(jié)果表明，E.coli產(chǎn)ESBLs酶與碳青霉烯異質(zhì)性耐藥有關(guān)。由于異質(zhì)性耐藥是耐藥性進化的過渡階段，ESBL的產(chǎn)生也參與對頭孢吡肟的異耐藥機制。研究證實ESBL的產(chǎn)生與頭孢吡肟表型異質(zhì)性耐藥的E.coli分離株增加顯著相關(guān)［26］，原因是ESBL可以水解頭孢吡肟，水解酶基因的異質(zhì)性表達可導(dǎo)致對頭孢吡肟的表型異質(zhì)性耐藥［33］。此外，由于孔蛋白編碼基因oprD的表達減少［34］，穩(wěn)定的耐藥亞群顯示出外排相關(guān)基因的上調(diào)和碳青霉烯類藥物的膜通透性降低。blaTEM-1表達上調(diào)聯(lián)合膜孔蛋白表達下調(diào)與E.coli亞胺培南的異質(zhì)性耐藥有關(guān)［35］。代佳伶［36］研究報道IPM-HR耐藥菌株不表達blakpc、blaNDM-1、blaIMP、blaVIM等產(chǎn)碳青霉烯酶基因，檢出ESBLs基因blaCTM-M-3，并且膜孔蛋白OmpF缺失，因此膜孔蛋白OmpF缺失可能是E.coli IPM-HR現(xiàn)象產(chǎn)生的機制之一。

圖2 大腸埃希菌對碳青霉烯類抗菌藥物的異質(zhì)性耐藥機制（改自文獻［9］）Fig. 2 Heteroresistance mechanism of E.coli to carbapenems（Modified from reference［9］）

由耐藥基因的自發(fā)不穩(wěn)定基因擴增引起的不穩(wěn)定耐藥是革蘭氏陰性菌異質(zhì)性耐藥的最常見機制［8］。在存在甲氧西林的情況下，E.coli中自發(fā)突變的頻率很高（約為10-5/代），并導(dǎo)致高頻率的耐甲氧西林菌株，因此產(chǎn)生異質(zhì)性耐藥，突變率高的原因是100多個基因的突變可以產(chǎn)生對甲氧西林的耐藥性，其中一些基因的耐藥性表型是由功能缺失突變引起的（例如，參與半胱氨酸生物合成的半胱氨酸激酶失活）［37］。E.coli中的哌拉西林-他唑巴坦異質(zhì)性耐藥也有類似的基因擴增機制［38］，其耐藥性的產(chǎn)生包括aadB基因在內(nèi)的一個區(qū)域的20-40倍擴增。在不穩(wěn)定的異質(zhì)性耐藥表型中，61%與串聯(lián)擴增有關(guān)，這些擴增通常是位于質(zhì)?；蛉旧w上的已知耐藥基因。報道顯示，所有革蘭氏陰性細菌-抗菌藥物組合中，約14.7%將表現(xiàn)出由不穩(wěn)定基因擴增引起的異質(zhì)性耐藥表型。擴增突變體的種群頻率（在不影響優(yōu)勢種群生長的最高濃度的8倍以上）為2.90×10-7-4.90×10-5［8］。

4.2 黏菌素類抗菌藥物的異質(zhì)性耐藥機制

現(xiàn)今己報道的黏菌素的異質(zhì)性耐藥機制主要包括PmrAB 和 PhoPQ 雙組份系統(tǒng)的激活［3，39］（圖 3）、MgrB 失活［40］、AcrAB-TolC 外排泵［41］和抗性基因串聯(lián)擴增［9］。雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)PhoPQ和PmrAB與E.coli黏菌素耐藥性的形成密切相關(guān)［29］。PmrB和PhoQ是組氨酸激酶，而PmrA和PhoP是下游反應(yīng)調(diào)節(jié)劑，而MgrB負調(diào)節(jié)PhoPQ系統(tǒng)［42］。鄺啟紅［30］在豬源E.coli黏菌素異質(zhì)性耐藥菌中發(fā)現(xiàn)，PmrB和PhoQ的氨基酸突變是黏菌素異質(zhì)性耐藥菌形成的主要原因，Kuang等［43］研究結(jié)果表明，CHR的E.coli分離株的形成主要與PmrB和/或PhoQ突變相關(guān)，而與PmrA、PhoP和MgrB無關(guān)，首次證明豬源E.coli中PmrB第93位的氨基酸變異（R93P）會導(dǎo)致HAMP結(jié)構(gòu)域β螺旋間構(gòu)象變化，加劇PmrAB、PmrC的表達量升高，是導(dǎo)致其對黏菌素產(chǎn)生異質(zhì)性耐藥的主要機制。Huang等［41］報道，由ecr編碼的小跨膜蛋白能夠通過PhoPQ介導(dǎo)異質(zhì)性耐藥。在PmrAB和PhoPQ的突變率方面，Sato等［44］證實在對黏菌素產(chǎn)生耐藥性或異質(zhì)性耐藥方面，PmrB比PmrA更容易發(fā)生突變。

圖3 革蘭氏陰性菌中PmrAB和PhoPQ雙組分系統(tǒng)調(diào)節(jié)的黏菌素異質(zhì)性耐藥性（改自文獻［2］）Fig. 3 Heteroresistance of colistin regulated by PmrAB and PhoPQ in Gram negative bacteria（Modified from reference［2］）

E.coli最常見的多黏菌素耐藥機制涉及質(zhì)粒攜帶的移動多黏菌素耐藥（mcr）基因，該基因于2016年新發(fā)現(xiàn)并命名為mcr-1［45］。隨后，報道了幾種氨基酸變體，例如 mcr-2［46］和 mcr-3［47］，這種可轉(zhuǎn)移的黏菌素質(zhì)粒產(chǎn)生的耐藥機制可能會加劇并促進耐藥性的傳播。Liao等［29］在兩株E.coli黏菌素耐藥菌株中均檢測到mcr-1基因，且在兩個異質(zhì)性耐藥菌株中檢測到PmrB中的突變。

在當(dāng)前研究中，黏菌素異質(zhì)性耐藥機制多在肺炎克雷伯氏菌、鮑曼不動桿菌、陰溝腸桿菌、銅綠假單胞菌和沙門菌等革蘭氏陰性細菌的相關(guān)研究，僅有極少數(shù)文獻涉及E.coli，且多數(shù)為醫(yī)院感染分離菌，而導(dǎo)致E.coli對黏菌素異質(zhì)性耐藥的潛在機制仍未完全闡明，較為明確的是與PhoPQ雙組分系統(tǒng)的表達和活性有關(guān)，該系統(tǒng)調(diào)節(jié)編碼脂質(zhì)A修飾酶的基因的表達，以減少脂質(zhì)A的負電荷，從而增加黏菌素耐藥性增加［48］。主要是因為PmrD 作為一個輔助蛋白，將PhoQ-PhoP和PmrB-PmrA連接起來，磷酸化的PhoP誘導(dǎo)的PmrD 轉(zhuǎn)錄，PmrD結(jié)合到磷酸化的PmrA上，通過組氨酸激酶PmrB抑制去磷酸化，增加pmrCAB、pmrE和arnBCADTEF的轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)節(jié)黏菌素獲得異質(zhì)性耐藥。。

4.3 其他抗菌藥物的異質(zhì)性耐藥機制

近年來，研究人員相繼發(fā)現(xiàn)了哌拉西林-他唑巴坦、頭孢噻呋、頭孢吡肟等β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物異質(zhì)性耐藥的E.coli［49］，其形成原因與敏感菌具有明顯的競爭優(yōu)勢相關(guān)，而多重耐藥區(qū)的插入是導(dǎo)致穩(wěn)定耐藥亞群獲得耐藥的主要原因。研究表明，E.coli替加環(huán)素耐藥機制與RND家族AcrAB-TolC有關(guān)，AcrAB同時受外排泵調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中MarAB的調(diào)節(jié)；marA位點直接或間接增加了micF的表達，導(dǎo)致ompF的表達減少［50］。劉宇陽等［51］研究證實與原始菌株相比，耐碳青霉烯類E.coli對替加環(huán)素異質(zhì)性耐藥亞群的外排泵基因acrA、acrB表達上調(diào)1.79倍、5.01倍；其相關(guān)調(diào)控基因marA、marB分別表達上調(diào)5.38和2.18倍；膜孔蛋白基因ompC下調(diào)2.35倍，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，證實了RND外排泵上調(diào)與替加環(huán)素異質(zhì)性耐藥顯著相關(guān)。

在一組磷霉素異質(zhì)性耐藥菌株中，觀察到uhpT基因缺失，該基因編碼誘導(dǎo)磷霉素轉(zhuǎn)運蛋白介導(dǎo)磷霉素轉(zhuǎn)運入細菌體，導(dǎo)致對磷霉素耐藥的E.coli產(chǎn)生不易察覺的內(nèi)集落突變體，這些突變體具有很高的生物學(xué)成本（如SNP、插入和刪除），當(dāng)這種耐藥突變體在沒有抗菌藥物的情況下生長時，選擇了補償性突變（分別參與調(diào)節(jié)有氧呼吸、碳分解代謝和包膜應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)節(jié)基因arcA、crp和cpxR中）［52］，以提高適應(yīng)性和敏感性，在這些代償突變體中，一些突變體失去了其異質(zhì)性耐藥表型，其特征是失去了敏感性降低的細胞亞群，而另一些突變體仍表現(xiàn)出異質(zhì)性耐藥表型。Campos等［53］對巴西E.coli磷霉素進行異質(zhì)性耐藥研究，murA基因的過度表達及由轉(zhuǎn)運體和調(diào)節(jié)基因突變引起的磷霉素攝取系統(tǒng)存在缺陷是引起磷霉素異質(zhì)性耐藥機制的原因。E.coli對其他抗菌藥物的異質(zhì)性耐藥機制如表4。

表4 大腸埃希菌對其他抗菌藥物的異質(zhì)性耐藥機制Table 4 Heteroresistance mechanism of E.coli to other antibiotics

值得思考的是，生物被膜（biofilm）高度復(fù)雜的相互作用，如自發(fā)突變、外部刺激因素（如宿主免疫系統(tǒng)、抗菌治療）、內(nèi)部微環(huán)境（氧氣、營養(yǎng)和pH梯度）和種間相互作用［55-56］等過程能夠?qū)е律锉荒觾?nèi)形成廣泛不同的亞群，生物被膜生物量越高，這種相互作用越明顯，新興亞種群的數(shù)量將越大。生物量的增加不一定意味著耐藥性的增加，而是異質(zhì)性耐藥的增加［57］。在E.coli菌落中，活性生長細胞位于下層，而非生長饑餓細菌則棲息在上層，以應(yīng)對基于擴散的營養(yǎng)供應(yīng)［58］，由此推斷，生物被膜的形成也可能與E.coli的異質(zhì)性耐藥有關(guān)，但相關(guān)研究尚未見報道。到目前為止，只有一份肺炎克雷伯菌的異質(zhì)性耐藥研究涉及生物被膜［59］，其在肺炎克雷伯菌生物被膜中，發(fā)現(xiàn)了能夠在黏菌素濃度高達MIC四倍的情況下生長的異質(zhì)性耐藥亞群。耐藥亞群以穩(wěn)定的小菌落變體的形式表現(xiàn)出與剩余生物被膜群不同的菌落形態(tài)。這些最新發(fā)現(xiàn)是預(yù)測生物被膜內(nèi)異質(zhì)性耐藥發(fā)生的合理依據(jù)，生物被膜中通常存在的巨大異質(zhì)性生理學(xué)預(yù)測了此類疾病的發(fā)生表型。因此，生物被膜亞群及其內(nèi)在變異性對E.coli異質(zhì)性耐藥性出現(xiàn)的貢獻需要積極探索。

5 問題與展望

異質(zhì)性耐藥被認為是細菌逐漸進化為耐藥的一個階段，在長期抗菌藥物壓力環(huán)境下，能適應(yīng)較高抗菌藥物濃度的亞群不斷增加，如果不及時進行干預(yù)，這類菌株將對抗菌藥物完全耐藥，影響臨床用藥選擇及治療效果。因此，及時有效的對異質(zhì)性耐藥菌株進行檢測并防控尤為重要，統(tǒng)一異質(zhì)性耐藥的檢測和判定標(biāo)準(zhǔn)是先決條件，如簡化PAP測試，可通過在單個平板上生成由特定抗菌藥物濃度組成的梯度，每種濃度下生長菌落的自動計數(shù)將確定耐藥亞群的比例及其耐藥水平，然而，實際上檢測異質(zhì)性耐藥需要在數(shù)小時內(nèi)而不是數(shù)天內(nèi)提供臨床治療指導(dǎo)，未來對開發(fā)基于表型讀數(shù)的診斷工具提出了一個重要挑戰(zhàn)。

目前，揭示的E.coli異質(zhì)性耐藥機制較少，異質(zhì)性耐藥的相關(guān)耐藥機制的研究任重而道遠。一方面，ESBLs參與了E.coli從異質(zhì)性耐藥到碳青霉烯耐藥的演變，未來，呼吁對ESBLs進行常規(guī)檢測，并闡明其潛在機制將促進新型抗菌藥物的開發(fā)，減緩或阻止“不可避免”的進化；另一方面，生物被膜是一種重要的耐藥形式，但對生物被膜的異質(zhì)性耐藥研究十分有限，生物被膜對于E.coli異質(zhì)性耐藥的影響尚不清楚，異質(zhì)性耐藥在生物被膜中的發(fā)生率不容忽視，仍需開展更深入的研究。

此外，盡管諸多有關(guān)異質(zhì)性耐藥的報道表明了異質(zhì)性耐藥性確實是一個臨床問題，但仍然缺乏廣泛的研究（特別是前瞻性研究）來評估異質(zhì)性耐藥性對臨床上死亡率和發(fā)病率的臨床影響。且大多數(shù)關(guān)于異質(zhì)性耐藥的研究均采用體外試驗或動物模型，因此不能完全符合宿主生物體的復(fù)雜機制，例如病原體和宿主免疫反應(yīng)之間相互作用、不同異質(zhì)性耐藥亞群共存反應(yīng)等，包括難以檢測的持久細菌，活的但不可培養(yǎng)（VBNC）細菌。因此，后續(xù)進行臨床研究將是一個重要的目標(biāo)，通過使用相關(guān)的臨床結(jié)果參數(shù)來檢查異質(zhì)性耐藥性的影響，并適當(dāng)分析異質(zhì)性耐藥性表型，以揭示可能導(dǎo)致治療失敗的異質(zhì)性耐藥性的特征。

現(xiàn)階段，全球COIVD-19流行期間，E.coli等病原體的傳播受到一定限制。然而，消毒劑的廣泛使用和抗菌藥物的使用增加可能促進其耐藥性的產(chǎn)生和傳播，更應(yīng)重視異質(zhì)性耐藥的流行情況，以防止其多重耐藥性的傳播至關(guān)重要。