馬尾藻功能低聚糖的制備及酶解工藝優(yōu)化

陸星宇，劉登鴻，龐 聰，徐鴻濤，方 芳，萬 楚，高 潔

（廣西大學(xué) 輕工與食品工程學(xué)院，廣西 南寧 530000）

馬尾藻（Sargassum pallidum）屬褐藻門（Phaeophyta），墨角藻目（Fucalus），馬尾藻科（Sargassaceae），馬尾藻屬（Sargassum）[1]，是一種暖溫帶性藻類，盛產(chǎn)于我國渤海和黃海等沿海各地，分布廣泛，資源豐富[2]。馬尾藻營養(yǎng)豐富，含有膳食纖維、氨基酸、維生素、礦物元素（Ca、P、K等）和不飽和脂肪酸等多種營養(yǎng)成分[3-4]，具有良好的保健功能，如馬尾藻含有的膳食纖維對雌性激素的吸附作用大于紅藻類膳食纖維，且具有良好的通便作用[5]。馬尾藻多糖是從馬尾藻中提取出的高黏度水溶性物質(zhì)[6]，主要成分為巖藻聚糖硫酸酯（Fucoidan），其單糖組成主要是巖藻糖，并含有活性基團硫酸基，最早是由瑞典科學(xué)家Kylin在20世紀初提出來并命名的[7]，現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)該糖具有免疫調(diào)節(jié)[8]、降血脂[9]、降血糖[10]、抗腫瘤[11-12]、抗病毒[13]、抗氧化[14-15]、抗炎等多種生理活性，具有極大的藥用價值。

低聚糖（oligosaccharide）又稱寡糖，是一種具有特殊生理功能的不消化性糖，具有改善腸道菌群和提高機體免疫力等重要的生理作用。低聚糖的化學(xué)本質(zhì)是一些不能被消化的短鏈碳水化合物，一般由2～10個單糖單位通過糖苷鍵連接的直鏈或支鏈的小聚合體[16]，介于單體單糖與高度聚合的多糖之間。與多糖相比，低聚糖具有黏度低、聚合度低、分子質(zhì)量小、水溶性好、無抗原性、易吸收、生物利用性好以及在宿主體內(nèi)積累效應(yīng)較弱[13，17-18]等顯著優(yōu)勢。

馬尾藻低聚糖是由馬尾藻多糖水解后得到的一種低分子質(zhì)量的硫酸化海藻低聚糖[19]。海藻低聚糖的制備途徑一般有兩種：一是從天然原料中直接提取，缺點是得率低且純度難以保證；二是通過海藻多糖降解，即先從原料中提取多糖，再對多糖進行降解獲取海藻低聚糖。海藻多糖降解制備海藻低聚糖的方法主要有化學(xué)降解、物理降解和酶法降解，但是傳統(tǒng)的化學(xué)降解和物理降解存在反應(yīng)劇烈、設(shè)備維護成本高、環(huán)境污染嚴重、產(chǎn)量較低以及產(chǎn)物聚合度難以控制等問題，而與化學(xué)降解法和物理降解法相比，酶解法具有反應(yīng)條件溫和、提取效率高、工藝容易控制且對環(huán)境友好等特點，因此酶法制備海藻寡糖逐漸成為近年來研究的熱點。國內(nèi)外對酶降解制備低聚糖的研究已有報道，賀秋紅等[19]利用商業(yè)海藻膠裂解酶制備海藻寡糖，得到了平均聚合度為4.08的海藻寡糖；CHEN J等[20]用需鈉弧菌SK 42.001產(chǎn)生的海藻裂解酶降解海藻酸鈉獲得低聚糖，并對其結(jié)構(gòu)和活性進行了研究。本研究采用水提醇沉法獲得馬尾藻粗多糖，利用水解酶對馬尾藻粗多糖進行降解，并通過單因素試驗和響應(yīng)面試驗優(yōu)化制備馬尾藻功能性低聚糖的酶解工藝，對馬尾藻低聚糖的制備和生產(chǎn)起到一定指導(dǎo)作用，為馬尾藻低聚糖的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料和菌株

干燥馬尾藻：廣西北海市云南路水產(chǎn)市場；副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracei）TYM201：本實驗室保存。

1.1.2 化學(xué)試劑

果膠酶（50 000 U/mL）、纖維素酶（700 U/mL）、植物水解酶（5 086 U/mL）：諾維信（中國）生物技術(shù)有限公司；3,5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）（分析純）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

MRS液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，牛肉膏5 g/L，酵母粉4 g/L，葡萄糖10 g/L，乙酸鈉5 g/L，磷酸二氫鉀2 g/L，檸檬酸三銨2 g/L，硫酸鎂0.2 g/L，硫酸錳0.05 g/L，吐溫80 1 g/L。調(diào)pH值至5.7±0.2。121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；TF-FD-1真空冷凍干燥機：上海田楓實業(yè)有限公司；XW-80A多用途混勻儀：海門市其林貝爾儀器制造有限公司；HJ-3恒溫磁力攪拌器：常州國華電器有限公司；3-18R離心機：湖南恒諾儀器設(shè)備有限公司；Infinite M200PRO酶標儀：奧地利Tecan Austria GmbH有限公司；XT-A400多功能粉碎機：永康市紅太陽機電有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 馬尾藻粗多糖制備

采用水提醇沉法[21]提取馬尾藻粗多糖：稱取250.00 g干燥馬尾藻，用打粉機打成粉末，加入5.00 L蒸餾水，80 ℃熱水提取5 h，用紗布濾去殘渣，將濾液在8 000 r/min的條件下離心15 min后，取出上清液并濃縮至原來體積的1/5，冷卻至室溫，向濃縮液中加入5倍體積分數(shù)為95%的乙醇，靜置于4 ℃醇沉24 h，紗布過濾并收集沉淀，在-18 ℃的條件下冷凍干燥36 h得馬尾藻粗多糖。

1.3.2 分析檢測

低聚糖得率與還原糖增量呈正相關(guān)，以還原糖增量為評價指標，采用DNS比色法[22-23]測定。

葡萄糖標準曲線繪制：以葡萄糖含量為橫坐標（X），以O(shè)D540nm值為縱坐標（Y），繪制葡萄糖標準曲線得葡萄糖溶液的標準曲線回歸方程為Y=0.569 1X-0.021 2，相關(guān)系數(shù)R2=0.998 3。

樣品的制備：準確稱取10mg馬尾藻粗多糖，溶解于10mL pH為4.5的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）中，其他試驗條件設(shè)置為：酶解溫度50 ℃、酶解時間240 min、酶底比5∶1 000，酶解結(jié)束后沸水加熱5 min滅酶，冷卻。

取馬尾藻多糖酶解液和酶解前馬尾藻多糖溶液各1 mL于試管中，加入2 mL DNS試劑，混勻，沸水浴2 min，流水冷卻，補水至15 mL，混勻，取200 μL于96孔板，測OD540nm值。代入葡萄糖標準曲線回歸方程，求得酶解前后的還原糖含量[22，24]，其增量計算公式如下：

式中：m1為多糖酶解后的還原糖含量，mg/mL；m0為多糖酶解前的還原糖含量，mg/mL；m為馬尾藻多糖初始含量，mg/mL。

1.3.3 酶篩選試驗

本試驗選用比較常用的幾種分解酶：果膠酶（A）、纖維素酶（B）、植物水解酶（C），以還原糖增量及低聚糖對副干酪乳桿菌TYM201的益生作用為評價指標。3種酶以下列組合形式：A、B、C、AB（1∶1）、AC（1∶1）、BC（1∶1）、ABC（1∶1∶1）分別酶解馬尾藻多糖，篩選出最佳的酶組合。酶解條件為：酶解溫度50 ℃、酶解pH 4.5、酶解時間240 min、酶底比5∶1 000。

（1）不同酶組合對酶解效果的影響

以滅活酶解液（沸水浴5 min）為試驗組，酶解前滅活多糖溶液為空白對照，以還原糖增量為評價指標，初步篩選出酶解效果最好的3種酶組合。還原糖增量測定方法參考1.3.2。

（2）不同酶組合對副干酪乳桿菌TYM201生長的影響

去除MRS液體培養(yǎng)基中的葡萄糖和水，加入初篩選出的3種酶組合對應(yīng)的酶解液，配制低聚糖培養(yǎng)基（記為OX，X為酶組合編號）；為排除酶以及多糖自身對試驗的影響，用等量同濃度多糖＋滅活酶溶液代替OX中的酶解液，配制多糖＋滅活酶培養(yǎng)基（記為PEX，X為酶組合編號）；去除MRS液體培養(yǎng)基中的葡萄糖，配制空白培養(yǎng)基（記為K）。向上述培養(yǎng)基中接種5%副干酪乳桿菌TYM201，在37 ℃下培養(yǎng)24 h，每隔3 h取100 μL菌液在波長600 nm下測定菌液的OD600nm值。以菌液的OD600nm值為縱坐標繪制生長曲線[25-26]，考察不同酶組合對副干酪乳桿菌TYM201生長的影響，從而篩選出綜合效果最好的酶組合。

1.3.4 酶解工藝優(yōu)化

（1）單因素試驗

以還原糖增量為指標，酶解工藝基本參數(shù)及還原糖增量測定方法參考1.3.2。在基本參數(shù)下采用單因素法依次考察酶底比（5∶1 000、6∶1 000、7∶1 000、8∶1 000、9∶1 000）、酶解溫度（40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃）、酶解時間（60 min、90 min、120 min、150 min、180 min）、酶解pH（4.0、4.5、5.0、5.5、6.0）對還原糖增量的影響。

（2）響應(yīng)面試驗

Plackett-Burman試驗設(shè)計：在單因素試驗基礎(chǔ)上，利用Plackett-Burman（PB）試驗設(shè)計（N=12），以還原糖增量為響應(yīng)值，對酶底比、酶解溫度、酶解時間及酶解pH 4個單因素進行評價，篩選出顯著性因素，運用Design-Expert 12.0.3軟件進行試驗設(shè)計，共12次試驗，設(shè)置每個因素的-1、1水平[27]，具體試驗設(shè)計見表1。

表1 Plackett-Burman試驗設(shè)計因素與水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman tests design

最陡爬坡試驗：根據(jù)PB試驗結(jié)果，去除影響不顯著的因素，對剩下因素的相互影響進行探究。采用最陡爬坡試驗確定顯著因素酶解溫度、酶底比與酶解pH的最佳區(qū)域。

Box-Behnken試驗設(shè)計：以最陡爬坡試驗得出的最高響應(yīng)值點作為中心點，設(shè)計3因素3水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗[28-30]。以酶解溫度（X1）、酶底比（X2）及酶解pH（X3）為自變量，以還原糖增量（Y）為響應(yīng)值，采用Design-Expert 12.0.3軟件設(shè)計Box-Behnken響應(yīng)面試驗方案并對數(shù)據(jù)進行分析。Box-Behnken試驗設(shè)計因素與水平見表2。

表2 Box-Behnken試驗設(shè)計因素與水平Table 2 Factors and levels of Box-Behnken tests design

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

所有試驗設(shè)計3個平行，試驗結(jié)果采用“平均值±標準差”表示。采用Origin 9.0對試驗數(shù)據(jù)進行作圖，響應(yīng)面試驗結(jié)果采用Design-Expert 12.0.3進行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶的種類及組合篩選

2.1.1 不同酶組合對酶解效果的影響

以滅活酶解液為試驗組，酶解前滅活多糖溶液為空白對照，測定得酶解前后吸光度值的差值，然后根據(jù)標準曲線回歸方程計算還原糖增量，結(jié)果見表3。

表3 不同酶組合對還原糖增量的影響Table 3 Effect of different enzyme combinations on reducing sugar increment

由表3可知，C、AC（1∶1）和ABC（1∶1∶1）3種酶組合的酶解效果最好，經(jīng)3種酶組合酶解后的還原糖增量分別為0.167 7 mg/mg、0.171 5 mg/mg、0.067 9 mg/mg，明顯高于其他組。因此，選擇C、AC（1∶1）和ABC（1∶1∶1）3種酶組合進行下一步試驗。

2.1.2 不同酶組合對副干酪乳桿菌TYM201生長的影響

由圖1a、圖1b可知，在培養(yǎng)過程中AC和ABC兩組中酶解液的OD600nm值均高于空白組的OD600nm值，即酶解液中副干酪乳桿菌TYM201的數(shù)量比空白組多，說明酶解液對副干酪乳桿菌TYM201生長具有一定的促進作用，同時多糖＋酶溶液的OD600nm值明顯高于酶解液組的OD600nm值，說明多糖+酶對副干酪乳桿菌TYM201有益，故不能證明酶解液中的低聚糖能夠促進副干酪乳桿菌TYM201的增殖。由圖1c可知，C酶（植物水解酶）酶解液的OD600nm值高于多糖＋酶溶液的OD600nm值，且24 h時的OD600nm值＞0.35，其余兩組中酶解液的OD600nm值均低于多糖＋酶溶液的OD600nm值，表明經(jīng)過植物水解酶水解產(chǎn)生的低聚糖對副干酪乳桿菌TYM201生長有促進作用。綜上，選擇植物水解酶作為本試驗用酶。

圖1 不同酶組合對副干酪乳桿菌TYM201生長的影響Fig.1 Effect of different enzyme combinations on Lactobacillus paracasei TYM201 growth

2.2 酶解工藝優(yōu)化單因素試驗

2.2.1 酶底比對酶解效果的影響

由圖2可知，隨著酶底比在5∶1 000～7∶1 000范圍內(nèi)的增高，還原糖增量也逐漸增大；在酶底比達到7∶1 000時，還原糖增量達到最大值，為（0.205 6±0.004 4）mg/mg；酶底比在7∶1 000～9∶1 000范圍內(nèi)繼續(xù)增加，還原糖增量呈現(xiàn)出下降的趨勢。一般而言，隨著酶濃度的增加，酶促反應(yīng)速度加快，即單位時間內(nèi)生成的產(chǎn)物量增大。但是當酶濃度足夠大時，沒有多余的底物與酶結(jié)合，過量的酶反而會抑制酶反應(yīng)的進行，從而導(dǎo)致還原糖增量下降[31]。因此，最適酶底比為7∶1 000。

圖2 不同酶底比對還原糖增量的影響Fig.2 Effect of different enzyme and substrate ratios on reducing sugar increment

2.2.2 酶解溫度對酶解效果的影響

由圖3可知，在酶解溫度為40～55 ℃時，還原糖增量隨酶解溫度升高而增加；在酶解溫度為55 ℃時，還原糖增量達到最大值，為（0.218 0±0.002 9）mg/mg；在酶解溫度高于55 ℃之后，還原糖增量有所下降。在一定范圍內(nèi)酶活性隨著溫度的升高而增強，但高于最適溫度后，酶活性隨著溫度的升高而降低甚至失活，造成酶催化活性的降低[17]。因此，最適酶解溫度為55 ℃。

圖3 不同酶解溫度對還原糖增量的影響Fig.3 Effect of different enzymolysis temperature on reducing sugar increment

2.2.3 酶解時間對酶解效果的影響

由圖4可知，當酶解時間為60～120 min時，還原糖增量隨酶解時間延長而增高；當酶解時間達到120 min時，還原糖增量達到最大值，為（0.196 7±0.001 5）mg/mg；當酶解時間＞120 min之后，還原糖增量有所下降。造成這種現(xiàn)象的原因是隨著酶解反應(yīng)進行，底物濃度降低，酶的活力下降，不利于酶促反應(yīng)繼續(xù)進行，從而造成還原糖增量下降[31-32]。因此，最適酶解時間為120 min。

圖4 不同酶解時間對還原糖增量的影響Fig.4 Effects of different enzymolysis time on reducing sugar increment

2.2.4 酶解pH對酶解效果的影響

由圖5可知，當pH值4.0～5.5時，隨著pH值的升高，還原糖增量也隨之增加；當酶解pH值為5.5時，還原糖增量最大，為（0.204 7±0.004 9）mg/mg；當酶解pH值＞5.5之后，隨著pH值的升高，還原糖增量隨之減少。這可能與酶自身的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)有關(guān)，即酶在一定的pH值范圍內(nèi)會表現(xiàn)出最大活力，偏離最適pH值時會改變酶的活性中心構(gòu)像，甚至改變整個酶分子的結(jié)構(gòu)，使酶變性失活，而酶活力下降，影響了酶解反應(yīng)的進程，減弱了酶解速度，還原糖增量下降[33]。因此，最適酶解pH值為5.5。

圖5 不同酶解pH值對還原糖增量的影響Fig.5 Effect of different enzymolysis pH on reducing sugar increment

2.3 Plackett-Burman試驗結(jié)果與分析

對PB試驗結(jié)果（表4）進行回歸分析，結(jié)果見表5。由表5可知，酶底比表現(xiàn)為正效應(yīng)（即隨著影響因素值的增大，還原糖增量為升高趨勢），酶解溫度、酶解時間與酶解pH表現(xiàn)為負效應(yīng)（即隨著影響因素值的增大，還原糖增量為降低趨勢）。試驗因素酶解pH、酶底比對還原糖增量影響極顯著（P＜0.01），溫度對還原糖增量影響顯著（P＜0.05），而時間影響不顯著（P＞0.05），故選擇酶解溫度、酶底比和酶解pH三個顯著影響因素進行馬尾藻功能低聚糖制備工藝的響應(yīng)面優(yōu)化和設(shè)計。由于時間對還原糖增量影響不顯著且表現(xiàn)為負效應(yīng)，因此，在優(yōu)化提取過程中，考慮到提高效率及節(jié)約成本[34]，并結(jié)合單因素試驗結(jié)果，將酶解時間固定為120 min。

表4 Plackett-Burman試驗設(shè)計與結(jié)果Table 4 Design and results of Plackett-Burman tests

表5 各因素水平、效應(yīng)值及顯著性分析Table 5 Level,effect value and significance analysis of each factors

通過最陡爬坡試驗可以確定響應(yīng)面的分析中心。由表6可知，隨著酶解溫度、酶底比和酶解pH的改變，還原糖的增加量先增加后減少，當酶解溫度為55 ℃、酶底比為7∶1 000、酶解pH 5.5時馬尾藻還原糖增量最大，因此以第3組水平作為響應(yīng)面的分析中心，進行下一步優(yōu)化。

表6 最陡爬坡試驗設(shè)計與結(jié)果Table 6 Design and results of the steepest ascent tests

2.4 Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果

在最陡爬坡試驗結(jié)果基礎(chǔ)上，以酶解溫度（X1）、酶底比（X2）及酶解pH（X3）為自變量，還原糖增量為響應(yīng)值（Y）進行響應(yīng)面試驗，利用Design-Expert 12.0.3進行Box-Behnken試驗設(shè)計，Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果見表7，回歸模型方差分析見表8。

表7 Box-Behnken試驗設(shè)計結(jié)果及分析Table 7 Results and analysis of Box-Behnken tests design

表8 回歸模型方差分析Table 8 Variance analysis of regression model

利用Design-Expert 12.0.3對表7的試驗數(shù)據(jù)進行方程擬合分析，以酶解溫度（X1）、酶底比（X2）及酶解pH（X3）為自變量，以還原糖增量（Y）為響應(yīng)值，得到的三次回歸方程如下：

由表8可知，所選模型極顯著（P＜0.01），失擬項不顯著（P＞0.05），說明所得回歸方程擬合度較好，所選模型合適。由P值可知，三次項X12X2、X12X3，二次項X12、X22、X32，交互項X1X2、X1X3對還原糖增量影響極顯著（P＜0.01），說明各因素對響應(yīng)值的影響不是簡單的線性關(guān)系。由F值可知，在影響還原糖增量的3個關(guān)鍵因素中，強弱順序為X1＞X3＞X2（即酶解溫度＞酶解pH＞酶底比）。用Design-Expert 12.0.3分析模型的可信度，模型的決定系數(shù)R2=99.58%，調(diào)整決定系數(shù)R2Adj=98.66%，R2接近1，表明模型預(yù)測的響應(yīng)值準確，可用于試驗分析和預(yù)測。同時模型的變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）=5.99%＜15%（變異系數(shù)反映試驗的可重復(fù)性，其值越小表明試驗越精確），說明模型比較精確，可信度較高并可用于擬合試驗結(jié)果。綜上分析，該模型可用于分析預(yù)測植物水解酶酶解馬尾藻多糖制備馬尾藻功能低聚糖的工藝。

2.5 各因素交互作用響應(yīng)面分析

由Box-Behnken試驗結(jié)果，利用軟件Design-Expert 12.0.3建立3D響應(yīng)面及等高線見圖6。在利用響應(yīng)面分析因素對響應(yīng)值的影響時，如果坡面比較陡，表明因素變化對響應(yīng)值影響顯著，反之則表明因素變化對響應(yīng)值影響不大[35]。等高線則能夠直觀反映因素交互作用對響應(yīng)值的影響，橢圓形的等高線表示交互作用顯著[36]。由圖6可知，3D響應(yīng)面在X1、X3方向上的坡面較陡，X1X2、X1X3、X2X3的等高線均呈橢圓形，表明X1、X3以及X1X2、X1X3、X2X3的交互作用對還原糖增量的影響顯著（P＜0.05）。

圖6 各因素間交互作用對還原糖增量影響的響應(yīng)面及等高線Fig.6 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factors on reducing sugar increment

2.6 驗證試驗

通過Design-Expert 12.0.3軟件計算得到優(yōu)化后的酶解工藝參數(shù)為：酶解溫度54.460 ℃，酶底比7∶1000，酶解pH 5.460。在此條件下，馬尾藻多糖酶解后的還原糖增量預(yù)測值為0.206 4 mg/mg。為驗證此方法的合理性，根據(jù)優(yōu)化后的酶解工藝稍作改動后進行試驗，即酶解溫度54.5 ℃，酶底比7∶1 000，酶解pH 5.46。在此優(yōu)化條件下進行3次平行驗證試驗，得到還原糖增量實際值為0.214 4 mg/mg，與試驗?zāi)Ｐ偷念A(yù)測值0.206 4 mg/mg基本吻合，偏差較小。結(jié)果表明，響應(yīng)面試驗優(yōu)化的結(jié)果比較準確，所獲得的模型可以應(yīng)用于對馬尾藻功能性多糖酶解制備中還原糖增量的預(yù)測。

3 結(jié)論

本研究主要探究酶解法制備馬尾藻功能性低聚糖的最佳工藝，首先以低聚糖對副干酪乳桿菌TYM201的益生作用為功能指標，篩選出益生效果最好的植物水解酶作為后續(xù)試驗用酶。通過Plackett-Burman設(shè)計和Box-Behnken響應(yīng)面分析對制備工藝進行優(yōu)化。最終確定酶法制備馬尾藻功能低聚糖的最佳工藝參數(shù)：酶解溫度54.5 ℃，酶底比7∶1 000，酶解pH 5.46。在此條件下馬尾藻多糖經(jīng)酶解后的還原糖增量為0.214 4 mg/mg。因此，通過響應(yīng)面優(yōu)化馬尾藻功能低聚糖的制備提取工藝是可行的，本實驗可以為馬尾藻的進一步加工利用提供科學(xué)參考。