野葛總黃酮的提取工藝優(yōu)化及抗氧化活性研究

龔 頻，翟鵬濤，張夢璇，陳雪峰，2*，王小娟，陳福欣

（1.陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，陜西 西安 710021；2.陜西農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)研究院，陜西 西安 710021；3.西安科技大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院，陜西 西安 710054）

葛根（Pueraria lobata）屬于花豆科，形狀類似于蝶形，是葛屬植物的根，葛根屬共有26種，其中具有藥用價(jià)值的通稱為葛根，目前主要分布于亞洲、北美和南美[1]。它源于中國，其根在食品和制藥工業(yè)中有著悠久的應(yīng)用歷史。我國葛根種類繁多，且產(chǎn)量豐富，其中野葛的產(chǎn)量較多，使用范圍較廣。它盛產(chǎn)于廣東、廣西等地[2]，主要以栽培為主。葛根中富含淀粉、異黃酮類、黃酮類物質(zhì)[3]。葛根中葛根素和總黃酮的含量不到根莖的1/10[4]。葛根的生物學(xué)和藥理作用主要?dú)w功于葛根素及其衍生物[5]。根中含有豐富的葛根素，通常被用作營養(yǎng)補(bǔ)充品葛根的唯一來源，而不包括其他地上部分（如葉和莖）[6]。與地上部分相比[7]，葛根不僅富含次生代謝產(chǎn)物，還富含植物碳水化合物，包括淀粉、纖維素和水溶性碳水化合物。葛根最早在西漢的《三國志·神農(nóng)本草經(jīng)》中就有記述說明，葛根味甘且酸，且性涼，不僅可以有效地緩解人體內(nèi)的熱毒還可以促進(jìn)人體內(nèi)津液的分泌[8-9]?！侗静菥V目》中記述“大約稱取葛粉四兩，用浸泡了一夜米的水去溶解，煮制，并用米湯服用”有一定的緩解煩躁和止渴的作用。藥理學(xué)研究表明，葛根中大豆苷元、葛根素、蘆丁等多種有效成分與抗氧化、心臟保護(hù)、神經(jīng)保護(hù)、抗癌和抗炎活性等藥理作用相關(guān)[10]。其中的異黃酮類化合物對(duì)降血壓、血脂和血糖及心腦血管疾病有顯著的療效，還可以分解酒精和保護(hù)肝臟，抗糖尿病[11]，對(duì)骨質(zhì)疏松還有一定的預(yù)防作用[12-13]。

葛根中黃酮類物質(zhì)的提取方法較多，傳統(tǒng)方式主要有熬煮、浸提、水提、乙醇回流提取等，目前提取的新技術(shù)則有滲濾、超聲波提取、微波提取、超臨界提取等[14-17]。韓劍等[18]用正交試驗(yàn)法，優(yōu)化了葛根的提取條件；趙浩如等[19]通過對(duì)幾種提取方式的對(duì)比分析，最終確定滲濾法是適合葛根的提取方法；彭游等[20]對(duì)葛根中的黃酮類化合物用微波輔助法進(jìn)行提取，研究發(fā)現(xiàn)提取效果良好；張喜梅等[21]用超聲波輔助提取法對(duì)葛根中的總黃酮類物質(zhì)進(jìn)行提取，提取率為1.81%；邢秀芳等[22]對(duì)葛根先用纖維素酶進(jìn)行降解，再用乙醇和正丁醇提取從而得到總黃酮，提取率為1.84%；王星敏等[23]采用酶發(fā)酵技術(shù)，對(duì)葛根廢渣中的植物組織進(jìn)行分解，然后從這些分解的植物組織中提取黃酮類化合物，提取率為0.37%。本實(shí)驗(yàn)用乙醇回流法提取野葛中的黃酮類化合物，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化野葛總黃酮提取工藝，并采用紫外分光光度法分析野葛總黃酮對(duì)1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力、總還原能力和·OH清除能力，考察其抗氧化活性。以期為合理利用葛根資源以及開發(fā)黃酮類制品提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

野葛：同仁堂；無水乙醇、甲醇（色譜純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；葛根素對(duì)照品、蘆丁對(duì)照品（純度＞98%）：上海源葉生物科技有限公司；DPPH：上海笛醫(yī)生物科技有限公司；無水硫酸鈉、硫酸亞鐵、過氧化氫、水楊酸、鐵氰化鉀、過硫酸鉀、三氯乙酸、三氯化鐵（均為分析純）：天津市天力化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

RE-2000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；98-Ⅱ-B電子控溫磁力攪拌電熱套：金壇市金祥龍電子有限公司；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式多用真空泵：金壇市金祥龍電子有限公司；KQ3200型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；HC-150T2高速多功能粉碎機(jī)：永康市綠可食品機(jī)械有限責(zé)任公司；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市江南儀器廠；BSA224S電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器；HGZF-101-2烘箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；UV-5100紫外分光光度計(jì)：上海元析儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 野葛總黃酮的提取

將野葛洗凈之后，切成薄片后晾干并進(jìn)行粉碎得到野葛粉末。在不同的水浴條件下進(jìn)行乙醇回流提取，過濾提取液，提取兩次，合并濾液，定容、備用。

1.3.2 野葛總黃酮提取工藝優(yōu)化

（1）單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

稱取每份5 g的藥材共5份。基礎(chǔ)單因素條件為：料液比1∶10（g∶mL），體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液，80 ℃，60 min，乙醇回流提取2次。分別在乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%、50%、60%、70%、80%；料液比為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（g∶mL）；提取時(shí)間為30 min、60 min、90 min、120 min、150 min；提取溫度為50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃條件下，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間及提取溫度對(duì)總黃酮提取率的影響。

（2）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，提取時(shí)間60 min，以總黃酮提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，選擇乙醇的體積分?jǐn)?shù)（A）、料液比（B）和提取溫度（C）為影響因素，進(jìn)行3因素3水平L9（33）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)野葛總黃酮的提取工藝進(jìn)行優(yōu)選。正交試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 提取工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for extraction process optimization

（3）總黃酮含量的測定

總黃酮含量的測定采用紫外分光光度法。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品5 mg，用2.5 mL的甲醇溶液超聲溶解，并加超純水定容在25 mL的標(biāo)準(zhǔn)容量瓶中，搖勻得到0.2 mg/mL的母液。依次吸取上述母液0、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL于25 mL的標(biāo)準(zhǔn)容量瓶中，首先加入6 mL的水溶液，然后加入1 mL 5%亞硝酸鈉水溶液搖勻后靜置5 min，再加1 mL 10%的硝酸鋁水溶液，搖勻后靜置5 min，最后再加10 mL 4%的氫氧化鈉水溶液，并加水稀釋至一定刻度，搖勻靜置15 min即可，過0.45 μm濾膜。再利用紫外分光光度法在波長500 nm處測定吸光度值。以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程y=0.014 2x-0.012 0，相關(guān)系數(shù)為R2=0.994 4。

1.3.3 供試溶液的制備

精密稱定濃縮得到的提取物0.1 g，用2.5 mL甲醇溶解在25 mL標(biāo)準(zhǔn)容量瓶中，加水定容至刻度，振蕩搖勻后吸取2 mL轉(zhuǎn)移至25 mL的標(biāo)準(zhǔn)容量瓶中，然后根據(jù)“制備標(biāo)準(zhǔn)曲線”的方法配制成0.32 mg/mL的樣品溶液，過0.45 μm濾膜，在波長500 nm處測定吸光度值，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算樣品中總黃酮含量。

1.3.4 野葛總黃酮提取率的計(jì)算

野葛提取液經(jīng)過紫外檢測后所得到的吸光度值，再通過標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算即可得出總黃酮的質(zhì)量濃度；總黃酮的提取率的計(jì)算公式如下：

式中：C為待測物的質(zhì)量濃度，mg/mL；V1為樣液體積，mL；k為稀釋倍數(shù)；m為藥材質(zhì)量，g；V2為測定用體積，mL。

1.3.5 野葛總黃酮體外抗氧化試驗(yàn)

（1）DPPH·清除能力的測定

配制質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.6 mg/mL、0.8 mg/mL和1.0 mg/mL的樣品溶液和質(zhì)量濃度為0.05 mg/mL DPPH·溶液。以VC作陽性對(duì)照。

對(duì)照品：2 mL DPPH·溶液+2 mL無水乙醇，記為A對(duì)；樣品：2 mL DPPH·溶液+2 mL樣品溶液，記為A樣；空白：2 mL樣品溶液+2 mL無水乙醇，記為A空。

常溫下放置30 min后，在波長510 nm處測定吸光度值。DPPH·清除率計(jì)算公式如下：

式中：A空為空白吸光度值；A樣為樣品吸光度值；A對(duì)為對(duì)照品吸光度值。

（2）總還原能力的測定

取1 mL不同質(zhì)量濃度的樣液，先加2.5 mL 0.2 mol/L磷酸緩沖液和2.5 mL 1%鐵氰化鉀水溶液混勻，在50 ℃保溫20 min，隨即添加2.5 mL 10%的三氯乙酸水溶液、5 mL蒸餾水和1 mL 0.1%三氯化鐵水溶液，攪拌均勻后，靜置10 min為宜，再以無水乙醇代替樣液按上述處理作為空白，在波長700 nm處測吸光度值（OD700nm值），以VC作陽性對(duì)照[24-26]。

當(dāng)溶液中加入具有還原性物質(zhì)，會(huì)發(fā)生一系列的反應(yīng)。鐵氰化鉀會(huì)還原成亞鐵氰化鉀，在酸性條件下，亞鐵氰化鉀會(huì)與三氯化鐵進(jìn)行結(jié)合，生成普魯士藍(lán)。普魯士藍(lán)在700 nm波長條件下有最強(qiáng)吸收，因此可以通過在對(duì)應(yīng)的波長下測定吸光度來檢驗(yàn)還原性物質(zhì)的總還原能力。吸光度值越大，表示樣品的還原能力越強(qiáng)。

（3）·OH清除能力的測定

分別取不同濃度的樣品溶液2 mL，然后加2 mL 9 mmol/L的FeSO4水溶液和8.8 mmol/L的H2O2水溶液，振蕩均勻后靜置10 min，加9 mmol/L的水楊酸溶液2 mL，搖勻后靜放30 min。檢測在波長510 nm處的吸光度值，記為A；不加野葛黃酮的水溶液，其他操作方法同上，所測吸光度值記為A空；用蒸餾水替代水楊酸，所測吸光度值記為A對(duì)；以相同質(zhì)量濃度的VC溶液作為陽性對(duì)照?！H清除率計(jì)算公式如下：

式中：A空為空白吸光度值；A為樣品吸光度值；A對(duì)為對(duì)照吸光度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響

從圖1可以看出，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)在40%～80%范圍內(nèi)的增大，提取率呈現(xiàn)先增后減的趨勢。在乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%～50%時(shí)，提取率隨之增加；在乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%時(shí)，提取率達(dá)到最高；在乙醇體積分?jǐn)?shù)＞50%之后，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，提取率逐漸下降。因此，最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.1 Effect of ethanol volume fraction on the extraction rate of total flavonoids

2.1.2 料液比的影響

從圖2可以看出，隨著溶劑用量的增大，總黃酮提取率呈先增后減的趨勢。當(dāng)料液比為1∶5～1∶20（g∶mL）時(shí)，提取率隨之升高；當(dāng)料液比為1∶20（g∶mL）時(shí)，提取率達(dá)到最高；當(dāng)料液比為1∶20～1∶25（g∶mL），提取率隨之降低。因此，最佳料液比為1∶20（g∶mL）。

圖2 料液比對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of solid and liquid ratio on the extraction rate of total flavonoids

2.1.3 提取溫度的影響

從圖3可以看出，隨著提取溫度在50～90 ℃范圍內(nèi)的升高，提取率呈現(xiàn)先增后減的趨勢。當(dāng)提取溫度為50～70 ℃時(shí)，提取率隨之增高；當(dāng)提取溫度為70 ℃時(shí)，提取率達(dá)到最高；當(dāng)提取溫度高于70 ℃之后，提取率反而越來越低。因此，最佳提取溫度為70 ℃。

圖3 提取溫度對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on the extraction rate of total flavonoids

2.1.4 提取時(shí)間的影響

從圖4可以看出，隨著提取時(shí)間在30～150 min范圍內(nèi)增加，提取率呈現(xiàn)先增后減的趨勢。在提取時(shí)間為30～120 min時(shí)，提取率隨之增高；在提取時(shí)間為120 min時(shí)，提取率達(dá)到最高；在提取時(shí)間＞120min之后，提取率有所降低低。因此，最佳提取時(shí)間為120 min。

圖4 提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of extraction time on the extraction rate of total flavonoids

2.2 提取工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，固定提取時(shí)間為60 min，以總黃酮提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，選擇乙醇的體積分?jǐn)?shù)（A）、料液比（B）和提取溫度（C）為影響因素，進(jìn)行3因素3水平L9（33）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，正交試驗(yàn)結(jié)果與分析見表2。

表2 提取工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal tests for extraction process optimization

續(xù)表

由表2可知，對(duì)結(jié)果影響的因素由大到小依次為溫度（C）＞乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）＞料液比（B），最佳提取工藝組合為A1B2C3，即料液比1∶20（g∶mL），乙醇體積分?jǐn)?shù)40%，80 ℃水浴條件下提取2 h，提取2次，總黃酮的提取率達(dá)到3.01%。在此最佳條件下進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，提取率分別為3.18%、3.00%、2.99%，平均提取率為3.06%。

2.3 野葛總黃酮體外抗氧化試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 野葛總黃酮對(duì)DPPH·清除能力的測定

由圖5可知，當(dāng)VC質(zhì)量濃度在0.2～0.8 mg/mL時(shí)，隨著VC質(zhì)量濃度的增加，清除DPPH·的能力增加很快。野葛總黃酮對(duì)DPPH·的清除能力隨著野葛總黃酮質(zhì)量濃度的增加逐漸增強(qiáng)，并且DPPH·清除率與總黃酮質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。但野葛總黃酮對(duì)DPPH·的清除能力和VC相比較而言明顯偏低。野葛總黃酮對(duì)DPPH·的最大清除率為72.98%。

圖5 野葛總黃酮對(duì)DPPH·的清除能力的影響Fig.5 Effect of total flavonoids from Pueraria lobata on DPPH·scavenging ability

2.3.2 野葛總黃酮對(duì)·OH清除能力的測定

由圖6可知，當(dāng)野葛總黃酮質(zhì)量濃度在0.2～0.4 mg/mL時(shí)，清除·OH的能力逐漸增加，當(dāng)其質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL，清除能力最強(qiáng)；在0.4 mg/mL以后，野葛清除·OH的能力基本趨于平衡。野葛清除·OH的能力和VC相比較而言明顯偏低。野葛總黃酮對(duì)·OH的最大清除率為65.38%。

圖6 野葛總黃酮對(duì)·OH的清除能力的影響Fig.6 Effect of total flavonoids from Pueraria lobata on OH·scavenging ability

2.3.3 野葛總黃酮總還原能力的測定

物質(zhì)的抗氧化能力和還原能力呈正比。由圖7可知，質(zhì)量濃度在0.2～0.8 mg/mL的時(shí)候，野葛和VC的還原能力隨著其相對(duì)應(yīng)濃度的增加而逐漸變大，但野葛的還原活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于VC。野葛總黃酮的最大還原能力為0.16。

圖7 野葛總黃酮總還原能力Fig.7 Total reducing ability of total flavones from Pueraria lobata

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用乙醇回流法從野葛中提取總黃酮，經(jīng)過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定其最佳的提取工藝為體積分?jǐn)?shù)為40%乙醇，料液比1∶20（g∶mL），80 ℃水浴提取2 h，共2次，合并濾液。在此優(yōu)化條件下，總黃酮的提取率是3.06%?？寡趸囼?yàn)結(jié)果表明，野葛總黃酮質(zhì)量濃度分別為0.8 mg/mL、0.4 mg/mL、0.8 mg/mL時(shí)，對(duì)DPPH自由基清除能力、OH自由基清除能力、總還原能力最大值分別為72.98%、65.38%、0.16。在試驗(yàn)設(shè)計(jì)的一定濃度范圍內(nèi)，抗氧化能力隨著野葛總黃酮質(zhì)量濃度的增大而增強(qiáng)，由此說明野葛總黃酮是一種具有抗氧化能力的物質(zhì)，可用于抗衰老功能食品的開發(fā)和應(yīng)用。