Loop結(jié)構(gòu)引入半胱氨酸對木聚糖酶XynASP熱穩(wěn)定性的影響

陳康太，楊思文，刁夢月，王宵宵，郭 雙，李恩中，李同彪

（黃淮學院 生物與食品工程學院，河南 駐馬店 463000）

木聚糖是植物半纖維素的一種主要組成成分，是除纖維素外自然界含量最豐富的多糖，降解后可產(chǎn)生低聚木糖及其他小分子物質(zhì)應用于工業(yè)生產(chǎn)[1]。木聚糖結(jié)構(gòu)復雜，主鏈以β-1,4-D糖苷鍵連接木糖而成，側(cè)鏈主要由O-乙酰基、β-L-阿拉伯呋喃甲?；?、葡萄糖醛基、4-甲基葡糖醛基以及酚酸等構(gòu)成[2]。木聚糖的完全降解需要多種酶如木聚糖酶、α-L-阿拉伯糖苷酶以及α-D葡糖苷酸酶等酶系相互協(xié)同作用[3]。其中，木聚糖酶可作用于木聚糖β-1,4-糖苷鍵，將其水解為木糖、木二糖、木三糖等其他低聚木糖，對木聚糖的解聚起著主要作用[4]。木聚糖酶也是一種重要的工業(yè)酶制劑，在紙漿漂白、食品和飼料加工等工業(yè)領(lǐng)域有著廣闊的應用前景[5]。木聚糖酶往往需要在極端的環(huán)境下參與工業(yè)化生產(chǎn)進程，如高溫、強酸強堿、高鹽等環(huán)境，而大多數(shù)天然木聚糖酶在極端環(huán)境下穩(wěn)定性較差，從而限制了木聚糖酶的使用范圍[6]。熱穩(wěn)定性一直都是木聚糖酶工業(yè)化應用的一種限制性因素，如在飼料加工過程中，木聚糖酶作為飼料添加劑需要一個高溫處理的過程[7]。自然界大多數(shù)木聚糖酶屬于中溫木聚糖酶，熱穩(wěn)定性較差，難以滿足工業(yè)需求，為了解決這一問題，諸多研究者對木聚糖酶進行研究，以提高木聚糖酶熱穩(wěn)定性[8]。如劉回民等[9]對玉米半胱氨酸蛋白酶進行W308C突變，獲得突變體W308C，該突變體在70 ℃保溫120 min仍能保持15%左右的酶活性，而野生型在10%左右，催化活性也提高了86%。李同彪等[10]對來源于黑曲霉（Aspergillus niger）XZ-3S的木聚糖酶XynZF-2N-端進行定點突變，得到突變體XynZF-2V1C，該突變體最適溫度為50 ℃，比野生型提高了10 ℃，酶活性半衰期t1/245℃提高了10 min。蔡劉滕子等[11]對黑曲霉（Aspergillus niger）XZ-3S木聚糖酶XynZF-2進行定點突變，構(gòu)建突變體XynCDH（V1C/G116D/N171H），該突變體比野生型XynZF-2最適溫度提高了5 ℃，酶活性半衰期t1/240℃、t1/245℃分別提高了5 min和8 min。以上研究表明，定點突變引入半胱氨酸（Cysteine，Cys）對酶的酶學性質(zhì)改變有較大的影響。

本研究利用快速定點突變技術(shù)，在溶糖曲霉（Aspergillus saccharolyticus）JOP1030-1木聚糖酶XynASP的Loop結(jié)構(gòu)第95位點引入半胱氨酸（Cys），獲得突變基因xynN95C，構(gòu)建重組表達載體，在大腸桿菌（Escherichia coli）BL21（DE3）中異源表達，并進行酶學性質(zhì)分析，旨在獲得熱穩(wěn)定性有所改良的木聚糖酶突變體，探究Loop結(jié)構(gòu)引入半胱氨酸對木聚糖酶熱穩(wěn)定性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種與質(zhì)粒

大腸桿菌（Escherichia coli）BL21（DE3）和大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α：瑞士Novagen公司。

重組質(zhì)粒pET-28a-xynASP：由Sangon公司合成，本實驗室保存。

1.1.2 試劑

T4脫氧核糖核酸連接酶（T4 deoxyribonucleic acid ligase，T4 DNA Ligase）、限制性內(nèi)切酶DpnⅠ、異丙基硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-thiogalactoside，IPTG）：日本TaKaRa公司；櫸木木聚糖：德國Sigma公司；DNA Marker、DNA質(zhì)粒提取試劑盒、Ni-NTA蛋白純化試劑盒（NO.C600332）、酵母提取物、蛋白胨、胰蛋白胨、瓊脂、甘油（均為生化試劑）：生工生物工程（上海）有限公司；DNA片段回收試劑盒：北京鼎國昌盛生物技術(shù)公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基：酵母提取物5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉10 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.4。

LB固體培養(yǎng)基：LB液體培養(yǎng)基中添加20 g/L瓊脂。TB培養(yǎng)基：胰蛋白胨14 g，酵母提取物27 g，甘油9 mL，蒸餾水1 000 mL。

以上培養(yǎng)基均于121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

T100梯度聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增儀：美國Bio-Rad公司；DYY-6C電泳儀：北京六一生物科技有限公司；XMTE-3102恒溫搖床：江蘇科析儀器有限公司；SIGMA 3-18K型冷凍高速離心機：北京金運創(chuàng)新科技發(fā)展有限公司；DSX-18L高壓蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠。

1.3 方法

1.3.1 重組木聚糖酶XynASP同源建模及模型優(yōu)化評估

將重組木聚糖酶的XynASP 氨基酸序列提交至SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/），進行同源建模，并利用Discovery Studio進行模型優(yōu)化。同時，利用Ramanchandran Plot評估二面角以及Profile-3D評估氨基酸匹配度。

1.3.2 定點突變

基于快速定點突變策略[12]設計定點突變引物（表1），以重組質(zhì)粒pET-28a-xynASP為模板，利用單點突變引物進行重疊延伸聚合酶鏈式反應（gene splicing by overlap extension polymerase chain reaction，SOE PCR）法擴增[13]，構(gòu)建重組突變質(zhì)粒pET-28a-xynN95C。再將重組質(zhì)粒用化學法轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，經(jīng)卡那霉素（kalamycin，Kan）抗性篩選后，挑選出陽性單克隆子[14]，送Sangon公司進行基因測序。

表1 引物序列Table 1 Sequences of primer

1.3.3 重組木聚糖酶誘導表達及純化

將測序正確的克隆子提取質(zhì)粒，化學法轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE3），構(gòu)建大腸桿菌基因工程菌[15]，挑取單克隆子接種于2mL的LB液體培養(yǎng)基（含Kan終質(zhì)量濃度為50μg/mL），37 ℃、180 r/min過夜培養(yǎng)[16]，轉(zhuǎn)接于TB培養(yǎng)基，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)3 h，加入IPTG（終濃度為2 mmol/L），30 ℃、180 r/min誘導2 h。誘導結(jié)束后，6 000 r/min離心10 min，收集菌體，加入10 mL磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液重懸后，進行細胞破碎（細胞破碎條件：5 s，間隙時間：5 s，工作總時間：7 min，頻率：10%），破碎后將細胞破碎液分裝于2 mL離心管中離心（11 000 r/min、4 ℃、20 min），取上清液用作粗酶[17]。

利用Ni-NTA蛋白純化試劑盒對重組木聚糖酶進行純化[18]，純化步驟參照試劑盒說明書。以10%分離膠和5%濃縮膠對純化后的重組木聚糖酶進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）檢測分析[19]。

1.3.4 重組木聚糖酶酶活性測定

采用3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）法進行木聚糖酶活性測定[20]，取1.5 mL 0.5%的櫸木木聚糖和1 mL適當稀釋的酶液在適當溫度下反應15 min，加入2.5 mL DNS終止反應，水浴煮沸反應7 min；冷卻后加5 mL雙蒸水（ddH2O），振蕩混勻，于波長540 nm處測定吸光度值。

木聚糖酶的活力單位定義：在上述測定活性條件下，每分鐘水解木聚糖生成1 μmol木糖所需要的酶量，U。

1.3.5 酶學性質(zhì)測定

重組木聚糖酶最適溫度及熱穩(wěn)定性測定：采用DNS法，在35～60 ℃條件下測定野生型XynASP和突變體XynN95C酶活性，以最高酶活性為100%，計算各溫度條件下酶的相對酶活性。將野生型XynASP和突變體XynN95C分別在35 ℃和40 ℃保溫1 h，每隔10 min取樣，在各自最適溫度下測定殘余酶活性，以未保溫酶的酶活性為100%，計算不同保溫時間下酶的殘余酶活性。

重組木聚糖酶最適pH及pH穩(wěn)定性測定：采用DNS法，在最適反應溫度下，分別測定pH 3.0～8.0條件下野生型XynASP和突變體XynN95C酶活性，以最高酶活性為100%，計算各pH值條件下酶的相對酶活性。酶在不同pH條件下，35 ℃保溫1 h后測定殘余酶活性，以未保溫酶的酶活性為100%，計算不同pH條件下酶的殘余酶活性。

重組木聚糖酶金屬離子及有機溶劑耐受性測定：野生型XynASP和突變體XynN95C金屬離子及有機溶劑耐受性測定方法參照文獻[21]。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組木聚糖酶XynASP三維結(jié)構(gòu)建立及突變位點確定

利用SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/）對重組木聚糖酶XynASP進行同源建模。將建模結(jié)構(gòu)提交至Discovery Studio進行優(yōu)化，優(yōu)化后模型見圖1。

圖1 木聚糖酶XynASP三維結(jié)構(gòu)模型Fig.1 Three-dimensional structure model of xylanase XynASP

由圖1可知，XynASP空間結(jié)構(gòu)主要由一個α-螺旋和兩個反向平行的β-折疊片層構(gòu)成，呈右手半握狀結(jié)構(gòu)，催化殘基由谷氨酸（glutamic acid，Glu）110和谷氨酸（Glu）201組成，屬于GH11家族木聚糖酶。XynASP的結(jié)構(gòu)模型經(jīng)Ramanchandran Plot評估得出該模型中95%氨基酸的二面角在允許的區(qū)域內(nèi)，且有90%的氨基酸在最適區(qū)域內(nèi)，經(jīng)Profile-3D評估發(fā)現(xiàn)模型與自身氨基酸序列匹配度較高，匹配度得分為110.43，遠高于期望值（87.06），并且發(fā)現(xiàn)模型中氨基酸相容性得分（verify score）均在“0線”以上，表明構(gòu)建的XynASP模型的氨基酸空間構(gòu)象合理（圖2）。以上評估結(jié)果說明該建模結(jié)構(gòu)的可信度高，可用于XynASP熱穩(wěn)定性分子理性設計的可靠結(jié)構(gòu)。

圖2 基于Ramanchandran Plot（a）、Profile-3D（b）XynASP模型評估結(jié)果Fig.2 Evaluation results of XynASP model based on Ramanchandran Plot (a) and profile-3D (b)

利用DNAMAN6.0以及DS Client 2016對木聚糖酶XynASP氨基酸序列以及結(jié)構(gòu)分析。同時，利用氨基酸結(jié)構(gòu)相似性，將第95位點的天冬酰胺（asparagine，Asn）替換為半胱氨酸（Cys），構(gòu)建突變體XynN95C。

2.2 快速定點突變和重組木聚糖酶表達及純化

以重組質(zhì)粒pET-28a-xynASP為模板，利用引物N95C-F和N95C-R進行PCR擴增突變質(zhì)粒pET-28a-xynN95C，經(jīng)限制性內(nèi)切酶DpnI消化模板，化學法轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，經(jīng)Kan抗性篩選后，挑取陽性單克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司進行基因測序，測序結(jié)果見圖3。

由圖3可知，經(jīng)過測序發(fā)現(xiàn)，原來第95位點的天冬酰胺密碼子AAC突變成半胱氨酸密碼子TGT，因此基因突變成功。將重組大腸桿菌工程菌BL21/pET-28a-xynASP和BL21/pET-28a-xynN95C分別進行蛋白誘導表達，經(jīng)超聲波破碎細胞獲得粗酶液，并利用Ni-NTA蛋白純化試劑盒獲得純化的重組木聚糖酶，對重組木聚糖酶粗酶液和純化后的酶液進行SDS-PAGE電泳，結(jié)果見圖4。

圖4 重組木聚糖酶XynASP和XynN95C的SDS-PAGE分析結(jié)果Fig.4 SDS-PAGE analysis results of the recombinant xylanase XynASP and XynN95C

由圖4可知，野生型XynASP和突變體XynN95C的粗酶液和純酶液均在27 kDa處有明顯條帶，且純化后的蛋白樣品純度較高，達到了電泳純，可滿足酶學性質(zhì)分析要求。

2.3 酶學性質(zhì)比較與分析

2.3.1 溫度對野生型XynASP與突變體XynN95C酶活性的影響

由圖5可知，野生型XynASP最適溫度為45 ℃，突變體XynN95C最適溫度為50 ℃，相比野生型（45 ℃）提高了5 ℃。測定重組木聚糖酶熱穩(wěn)定性發(fā)現(xiàn)，在35 ℃保溫60 min后，野生型XynASP和突變體XynN95C均保留較高的穩(wěn)定性。突變體XynN95C的殘余酶活性為91.2%，相比于野生型（87.5%）略有提高；40 ℃保溫20 min后，野生型XynASP相對酶活性明顯下降，僅保留了50.6%的殘余酶活性，而突變體XynN95C殘余酶活性仍高達77.56%；40 ℃保溫40 min后，突變體XynN95C仍保留了54.6%的殘余酶活性，而野生型殘余酶活性下降到了41.0%。

圖5 野生型XynASP和突變體XynN95C最適溫度比較Fig.5 Comparison of optimum temperature between the wild-type XynASP and mutant XynN95C

由圖6可知，突變體XynN95C的半衰期t1/240℃為38 min，相比野生型提高了18 min。由此表明，突變體XynN95C熱穩(wěn)定性相比野生型XynASP明顯提高。

圖6 野生型XynASP和突變體XynN95C熱穩(wěn)定性比較Fig.6 Comparison of thermal stability between the wild-type XynASP and mutant XynN95C

2.3.2 突變體XynN95C與野生型XynASP最適pH及pH穩(wěn)定性比較

由圖7可知，在pH值為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0和8.0條件下，野生型XynASP的最適pH為6.0，突變體XynN95C的最適pH為5.0。相比野生型，突變體XynN95C的最適pH有所降低，更偏酸性。

圖7 突變體XynN95C與野生型XynASP最適pH比較Fig.7 Comparison of optimum pH between mutant XynN95C and wild-type XynASP

由圖8可知，在pH 3.0～8.0條件范圍內(nèi)，野生型XynASP與突變體XynN95C殘余酶活性均在40.0%～80.0%之間，突變體XynN95C對于酶的pH穩(wěn)定性沒有明顯改善。

圖8 突變體XynN95C與野生型XynASP pH穩(wěn)定性比較Fig.8 Comparison of pH stability between mutant XynN95C and wild type XynASP

2.3.3 突變體XynN95C與野生型XynASP金屬離子和有機溶劑穩(wěn)定性比較

由圖9可知，在40 ℃條件下，將金屬離子（K+、Na+、Fe2+、Cu2+、Ca2+、Zn2+、Mg2+、Fe3+）分別與野生型XynASP和突變體XynN95C保溫1 h，測定重組木聚糖酶酶活性，以不加金屬離子的重組木聚糖酶酶活性為100%，分析金屬離子對野生型XynASP和突變體XynN95C酶活性影響，結(jié)果見圖9。由圖9可知，K+、Na+和Mg2+對野生型XynASP的酶活性有明顯的激活作用，相對酶活性分別為112.1%、108.8%和120.9%，而Fe3+對野生型XynASP酶活性有明顯抑制作用。其他金屬離子對野生型XynASP的酶活性基本沒有影響。突變體XynN95C酶活性受Cu2+的影響較大，表現(xiàn)出較大的抑制作用，相對酶活性為52.2%。值得關(guān)注的是，F(xiàn)e3+處理后，突變體XynN95C相對酶活性高達93.9%，而野生型XynASP相對酶活性為65.9%。由此得出，突變體XynN95C對Fe3+有較高的耐受性。

圖9 突變體XynN95C與野生型XynASP金屬離子穩(wěn)定性比較Fig.9 Comparison of metal ions stability between mutant XynN95Cand wild-type XynASP

由圖10可知，通過分析不同濃度的有機溶劑（甲醇、乙醇和異丙醇）對野生型XynASP和突變體XynN95C酶活性影響發(fā)現(xiàn)，隨著甲醇、乙醇和異丙醇濃度的增加，野生型XynASP和突變體XynN95C對這三種有機溶劑的耐受性均有所下降，且突變體XynN95C下降的更為明顯。

圖10 突變體XynN95C與野生型XynASP有機溶劑穩(wěn)定性比較Fig.10 Comparison of organic solvent stability between mutant XynN95C and wild-type XynASP

2.3.4 重組木聚糖酶結(jié)構(gòu)分析

以野生型XynASP三維結(jié)構(gòu)為模板，對突變體XynN95C同源建模，并進行結(jié)構(gòu)比對分析，結(jié)果見圖11。

圖11 野生型XynASP和突變體XynN95C結(jié)構(gòu)比對Fig.11 Structure alignment of wild-type XynASP and mutant XynN95C

由圖11可知，突變體XynN95C由于第95位點天冬酰胺（Asn）突變成半胱氨酸（Cys），使得第95位點附近結(jié)構(gòu)向活性中心內(nèi)發(fā)生一定的偏移，且第95位點結(jié)構(gòu)由原來的Loop結(jié)構(gòu)進一步演變成β-折疊，相比柔性較大的Loop結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，因此，這就可能導致蛋白結(jié)構(gòu)更加的穩(wěn)定，從而改善了酶的熱穩(wěn)定性。

2.4 討論

由于GH11家族木聚糖酶對木聚糖有較高的特異性，催化效率較高，專一性強，可以更多地應用于食品、紡織、飼料和制漿等工業(yè)，獲得更多有價值的產(chǎn)品[22-23]。隨著木聚糖酶工業(yè)應用環(huán)境的不斷拓展，木聚糖酶性能的改善引起了研究者的重視，尤其是木聚糖酶熱穩(wěn)定性的改善。很多研究者通過定點突變技術(shù)對木聚糖酶進行熱穩(wěn)定性分子改造，獲得可喜的成就，并為后續(xù)木聚糖酶熱穩(wěn)定性分子改造提供了方向，如陳亞文等[24]在黑曲霉（Aspergillus niger）XZ-3S木聚糖酶XynZF-2N-端引入半胱氨酸，得到的突變體Xyn-E27C最適溫度相比野生型提高了5 ℃，且半衰期t1/245℃增加了17 min，酶的熱穩(wěn)定性得到了很大提高。由此可見，在木聚糖酶N-端引入半胱氨酸對木聚糖酶的熱穩(wěn)定性有一定的影響[25]。

3 結(jié)論

本研究以溶糖曲霉（Aspergillussaccharolyticus）JOP1030-1木聚糖酶XynASP為研究對象，在其Loop結(jié)構(gòu)中引入半胱氨酸（Cys），進行N95C定點突變，獲得突變體XynN95C，并在大腸桿菌BL21（DE3）中誘導表達，通過酶學性質(zhì)分析，突變體XynN95C最適溫度相比野生型XynASP提高5 ℃，半衰期t1/240℃為38 min，相比野生型提高了18 min，熱穩(wěn)定性大大提高，且最適pH從6.0降至5.0。突變體XynN95C結(jié)構(gòu)相比野生型發(fā)生一定的改變，第95位點結(jié)構(gòu)由原來的Loop結(jié)構(gòu)變成β-折疊，導致該部位更加的穩(wěn)定，進而改善了XynASP的熱穩(wěn)定性。由此得出，在Loop結(jié)構(gòu)引入半胱氨酸也可提高木聚糖酶的熱穩(wěn)定性，為GH11家族木聚糖酶的熱穩(wěn)定性改造提供又一思路。