復(fù)合誘變選育耐高溫產(chǎn)乙醇酵母菌的研究

劉延波，宋艷潔，李海登，沈祥坤，張立新，孫西玉，韓素娜，潘春梅*

（1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院（酒業(yè)學(xué)院），河南 鄭州 450046；2.河南仰韶酒業(yè)有限公司 博士后科研工作站，河南 三門峽 472400；3.河南大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 開封 475004；4.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 河南省白酒風(fēng)格工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450046；5.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院鄭州市白酒釀造微生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450046；6.河南工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001；7.河南省食品工業(yè)科學(xué)研究所有限公司，河南 鄭州 450003）

酵母菌是雙性厭氧性微生物[1]，在白酒生產(chǎn)過程中，酵母菌以谷物等作為營養(yǎng)基[2]，生長到一定時(shí)期，會通過異化作用使發(fā)酵液中的糖類轉(zhuǎn)化為乙醇和其他代謝產(chǎn)物[3]，因此酵母菌對白酒的發(fā)酵起著至關(guān)重要的作用[4]。傳統(tǒng)的酵母最適的發(fā)酵溫度為28～33 ℃，一般不超過36 ℃[5]，由于呼吸作用會產(chǎn)出大量熱量，特別是炎熱的夏季，熱量積聚在發(fā)酵液中難以散去，常使得存在于酵母細(xì)胞內(nèi)的理化成分，如脂肪酸，麥角固醇等遭到破壞，影響細(xì)胞生命活動的正常進(jìn)行[6]，造成酵母早衰，白酒企業(yè)每年出現(xiàn)“夏季掉排”現(xiàn)象。導(dǎo)致只能選擇壓排度夏，給生產(chǎn)造成極大的不便并大大降低了設(shè)備和廠房等的利用率，增加了釀酒成本[7]。

ABDEL B M等[8]研究指出，一個(gè)產(chǎn)能為3×107L的乙醇發(fā)酵企業(yè)，若將發(fā)酵溫度提升5 ℃，僅冷卻成本即可節(jié)約3萬美元；關(guān)于在乙醇工業(yè)中選育耐高溫酵母有較多研究[9-12]。DHALIWAL S S等[13]篩選到一株在40 ℃條件下耐高溫的東方伊薩酵母，乙醇產(chǎn)量達(dá)到71.9 g/L；徐大鵬等[14]篩選到1株在41 ℃可以良好生長的耐高溫酵母菌，乙醇產(chǎn)量為44.0 g/L。同樣篩選獲取在高溫條件下具有良好的乙醇發(fā)酵性能的酵母菌株，對白酒生產(chǎn)具有重要意義。

紫外（ultra violet，UV）線作為物理誘變因子常應(yīng)用于工業(yè)微生物，使脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）分子形成嘧啶二聚體，阻礙堿基的配對，影響正常的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，從而引起菌株的突變或死亡[15-16]，此外還具有便捷、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)，是微生物菌株誘變選育的首選誘變因子[17]。硫酸二乙酯（diethyl sulfate，DES）是一種烷化劑，可使活躍的烷基轉(zhuǎn)移到電子密度較高的分子中，置換氫原子從而導(dǎo)致堿基改變，能夠在較短的時(shí)間內(nèi)提高突變率并獲得較優(yōu)異的突變類型[18]。復(fù)合誘變是將兩種或兩種以上誘變劑先后使用，具有協(xié)同效應(yīng)，相比于單一因子誘變有較大優(yōu)勢[19-20]。趙宇等[21]通過常壓室溫等離子體誘變和基因重組重排方式篩選出能在37 ℃較好生長的突變株，其乙醇發(fā)酵性能為16.2%（V/V）；RAJNI K等[22]通過甲烷磺酸乙酯、亞硝基胍、近紫外輻射和遠(yuǎn)紫外輻射對葡聚糖雜交種進(jìn)行連續(xù)誘變，突變株可在40 ℃條件下良好生長，乙醇產(chǎn)量為0.379 g/L，有效的提高了酵母的抗逆性。以上研究均表明，通過復(fù)合誘變可使出發(fā)菌種的優(yōu)異性狀得到較大提升。

本研究在前期篩選菌株的基礎(chǔ)上，通過選擇紫外-硫酸二乙酯復(fù)合誘變法，并在深入研究菌株的最適誘變條件后，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，結(jié)合Box-Behnken中心組合試驗(yàn)優(yōu)化菌株的發(fā)酵條件，以期更有效改善出發(fā)菌株的耐受溫度及乙醇產(chǎn)率，為開發(fā)利用白酒酵母資源提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

酵母菌（Saccharomyces）JZ：篩選于河南某白酒企業(yè)[23]，河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院河南省白酒風(fēng)格技術(shù)研究中心保藏。

1.1.2 試劑

葡萄糖、瓊脂：北京索萊寶科技有限公司；蛋白胨：廈門生物科技有限責(zé)任公司；酵母浸粉：深圳樂芙生物科技有限公司；硫酸二乙酯（DES）：濟(jì)南世紀(jì)通達(dá)化工有限公司；硫代硫酸鈉：無錫市正昌源化工有限公司；氯化鈉：天津市祥瑞鑫化工有限公司；Ezup柱式試劑盒：深圳子科生物科技有限公司；雙蒸水：上海生工生物工程股份有限公司。試驗(yàn)所用試劑均為分析純及生化試劑。

1.1.3 培養(yǎng)基

菌種的增菌培育采用酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）液體培養(yǎng)基：1%酵母浸粉，2%蛋白胨，2%葡萄糖。121 ℃滅菌15 min。

菌種的活化、分離純培養(yǎng)和菌種保存采用酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基：1%酵母浸粉，2%蛋白胨，2%葡萄糖，2%瓊脂粉。121 ℃滅菌15 min。

2,3,5-氯化三苯四氮唑（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）培養(yǎng)基：乳酸5 g/L，瓊脂15 g/L，pH6.0。121 ℃滅菌15 min后，待其冷卻至50 ℃后加入TTC 0.1 g/L（現(xiàn)配現(xiàn)用）。

乳酸培養(yǎng)基：乳酸40 g/L，硫酸銨5 g/L，磷酸二氫鉀1 g/L，氯化鈉0.1 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，氯化鈣0.1 g/L，酵母膏0.2 g/L，瓊脂15 g/L，pH6.0。121 ℃滅菌15 min。

目標(biāo)菌種發(fā)酵培養(yǎng)采用高粱發(fā)酵培養(yǎng)基∶高粱水=1∶4，90 ℃糊化90 min，先降溫冷卻至60 ℃，然后加入5%糖化酶糖化2～3 h，將糖度調(diào)至12°Bx。121 ℃滅菌15 min。

1.2 儀器與設(shè)備

DRP-9052恒溫振蕩培養(yǎng)箱：上海譜振生物科技有限公司；SW-CJ-2FD雙人單面凈化工作臺：上海篤特科學(xué)儀器有限公司；LDZX-50FBS高壓蒸汽滅菌鍋：紹興上虞艾科儀器設(shè)備公司；TGL-16LM高速冷凍離心機(jī)：北京華儀通泰環(huán)保科技有限公司；PICO-21式離心機(jī)：湖南恒諾儀器設(shè)備有限公司；DYCP-31DN瓊脂糖凝膠電泳儀：北京市六一儀器廠；JY04S-3C凝膠成像系統(tǒng)：濟(jì)南童鑫生物科技有限公司；V-T3紫外分光光度計(jì)：上海美譜達(dá)儀器有限公司；CX31生物顯微鏡：上海博湖生物科技有限公司；ABI VeritiPro聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：北京宏達(dá)恒業(yè)科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 酵母菌的分子生物學(xué)鑒定

采用Ezup柱式酵母基因組試劑盒提取分離，以基因組DNA為模板，采用通用引物（NL-1：5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'）和（NL-4：5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'）進(jìn)行擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增體系（50 μL）：SanTaqPCR Mix預(yù)混液25μL，引物各2μL，DNA模板2μL，雙蒸水（ddH2O）19 μL。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃、5 min，94 ℃、40 s，55 ℃、40 s，72 ℃、90 s，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min[24]。取3 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測分離，出現(xiàn)清晰條帶，將PCR產(chǎn)物送生工生物工程（上海）有限公司進(jìn)行測序，將獲得的基因序列在美國國家生物技術(shù)信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）上通過基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）程序進(jìn)行同源性比較與分析，并利用MEGAX 10.0.2軟件中的鄰接（neighbor joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[25]。

1.3.2 酵母JZ生長曲線的測定

吸取2%活化后的甘油凍懸液接種至YEPD液體培養(yǎng)基，置于搖床培養(yǎng)箱每2 h取一次樣，測其波長600 nm處的吸光度值（D600nm值），以空白培養(yǎng)基為對照組，繪制菌株JZ生長曲線。

1.3.3 菌懸液的制備

用接種環(huán)在斜面上挑取一環(huán)菌體，放入裝有無菌生理鹽水的試管中，10 000 r/min離心振蕩棄去上清液，加入無菌生理鹽水再次振蕩，使下層菌體懸浮形成均一的懸濁液[26]。

1.3.4 誘變方法

紫外誘變：將菌懸液放置已滅菌的，裝有玻璃珠的三角瓶中，振蕩5 min，以打散菌體。用無菌生理鹽水稀釋至1×108CFU/mL，備用[13]。紫外燈預(yù)熱30 min 后，取10 mL制備的菌懸液加到直徑9 cm平皿中，放入無菌磁力攪拌子，然后置于磁力攪拌器上、30 W的紫外線燈30 cm處，避免接觸白熾光，依次照射0、20 s、40 s、60 s、80 s、100 s和120 s[27]。

硫酸二乙酯（DES）誘變：取培養(yǎng)至對數(shù)生長期的菌懸液10 mL于三角瓶中，加入含量分別為0、5.0%、7.5%、10.0%、12.5%、15.0%的硫酸二乙酯各10 mL，于28 ℃、200 r/min條件下振蕩處理30 min后，立即加入1 mL 25%的硫代硫酸鈉溶液終止反應(yīng)。

將出發(fā)菌株酵母菌懸液經(jīng)紫外照射后立即加入硫酸二乙酯進(jìn)行復(fù)合誘變處理，取未照射的制備菌液和照射菌液各1 mL進(jìn)行稀釋分離，計(jì)數(shù)活菌細(xì)胞數(shù)[28]。致死率計(jì)算公式如下：

1.3.5 耐高溫酵母菌的篩選及形態(tài)學(xué)鑒定

挑取長勢良好的誘變菌種進(jìn)行劃線接種，分別在33 ℃、35 ℃、37 ℃、40 ℃、42 ℃、45 ℃、47 ℃、50 ℃的條件下靜置培養(yǎng)24 h，通過OD600nm值反映生長情況，并通過美藍(lán)染色記錄其基本形態(tài)特征。

1.3.6 遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)

將突變株的種子液按2.0%的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，靜置于40 ℃條件下進(jìn)行厭氧發(fā)酵6 d后，按照國標(biāo)GB 5009.225—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)酒中乙醇濃度的測定》蒸出餾出液，用酒精度計(jì)測餾出液的乙醇產(chǎn)量，進(jìn)行連續(xù)5次傳代培養(yǎng)，以確定突變株的遺傳穩(wěn)定性。

1.3.7 發(fā)酵條件優(yōu)化

（1）單因素試驗(yàn)

發(fā)酵溫度：按5%接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，分別在發(fā)酵溫度為28 ℃、31 ℃、35 ℃、37 ℃、40 ℃、43 ℃條件下靜置培養(yǎng)6 d，通過監(jiān)測CO2質(zhì)量損失反映發(fā)酵情況。

初始pH值：按5%的接種量分別接種于初始pH值為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0的發(fā)酵培養(yǎng)基中，靜置培養(yǎng)6 d，通過監(jiān)測CO2質(zhì)量損失反映發(fā)酵情況。

初始糖度：按5%的接種量分別接種于初始糖度為8.0°Bx、10.0°Bx、12.0°Bx、14.0°Bx、16.0°Bx、18.0°Bx的發(fā)酵培養(yǎng)基中，靜置培養(yǎng)6 d，通過監(jiān)測CO2質(zhì)量損失反映發(fā)酵情況。

接種量：分別吸取6.0%、8.0%、10.0%、12.0%、14.0%、16.0%的菌液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，靜置培養(yǎng)6 d，通過監(jiān)測CO2質(zhì)量損失反映發(fā)酵情況[29]。

（2）響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取對CO2質(zhì)量損失影響較大的發(fā)酵溫度（A）、初始pH值（B）、初始糖度（C）三個(gè)因素作為自變量，以發(fā)酵結(jié)束后的CO2質(zhì)量損失（Y）為響應(yīng)值，采用Design Expert 8.0.6軟件設(shè)計(jì)3因素3水平Box-Behnken試驗(yàn)，優(yōu)化發(fā)酵條件并進(jìn)行驗(yàn)證，Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平見表1。

表1 發(fā)酵條件優(yōu)化Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments design for fermentation conditions optimization

1.3.8 CO2質(zhì)量損失測定

挑取菌液接入錐形瓶中，并在發(fā)酵栓中注入約5 mL硫酸，封口，置感量為0.01 g的分析天平上稱取，記下質(zhì)量m1。置于所需溫度的培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)酵時(shí)間結(jié)束之后，取出發(fā)酵栓，輕輕搖動，使CO2逸出，稱量后記下質(zhì)量m2，計(jì)算兩者之間的質(zhì)量差。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌JZ的鑒定

采用NL-1基因和NL-4基因特異性引物對菌種JZ的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖見圖1。由圖1可知，引物濃度適中，擴(kuò)散效率較好；菌株JZ擴(kuò)增產(chǎn)物帶大小介于750 bp和500 bp，產(chǎn)物長度約為600 bp。

圖1 酵母JZ 28S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoretogram of 28S rDNA PCR amplification product of yeast JZ

將獲得的基因序列在NCBI上通過BLAST程序進(jìn)行同源性比較與分析，并利用MEGAX 10.0.2軟件中的鄰接（NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果見圖2。由圖2可知，酵母JZ位于獨(dú)立進(jìn)化分支內(nèi)，其遺傳進(jìn)化關(guān)系與庫德里阿茲威畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）的相似性為98%，因此，菌株JZ被鑒定為庫德里阿茲威畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）。

圖2 基于28S rDNA基因序列菌株JZ的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain JZ based on 28S rDNA gene sequence

2.2 菌株JZ生長曲線的測定

由圖3可知，0～4 h為延遲期，細(xì)胞經(jīng)過初步適應(yīng)后，代謝活動逐漸旺盛，但生長仍較緩慢，細(xì)胞數(shù)基本不增加；從第6小時(shí)開始細(xì)胞的生長進(jìn)入對數(shù)生長期，對理化因素較為敏感，該時(shí)期的細(xì)胞生長平衡，細(xì)胞形態(tài)、大小、生理特征比較一致，生長最為旺盛，菌體活力最好，初級代謝產(chǎn)物大量產(chǎn)生；在22～30 h之間，該時(shí)期的生長菌群總數(shù)處于平穩(wěn)階段，且細(xì)胞繁殖速度漸趨下降。為達(dá)到較高的菌體密度以及較好的繁殖速度，故本試驗(yàn)以對數(shù)生長后期16 h作為誘變時(shí)間。

圖3 菌株JZ的生長曲線Fig.3 Growth curve of strain JZ

2.3 菌株JZ的誘變

2.3.1 紫外誘變

由圖4可知，菌種的致死率與紫外照射時(shí)間呈正相關(guān)。在20 s以內(nèi)時(shí)，致死率較低，說明對菌種生長無較大影響。當(dāng)持續(xù)照射20 s后，菌種致死率快速上升，并在80 s時(shí)，菌種致死率快速增加到82.46%，符合最佳誘變的致死率范圍80%～90%。因此，選擇菌種的最佳誘變時(shí)間為80 s。

圖4 紫外照射時(shí)間對菌體致死率的影響Fig.4 Effect of UV irradiation time on the lethality of bacteria

2.3.2 硫酸二乙酯誘變

由圖5可知，硫酸二乙酯的添加量與菌種致死率呈正相關(guān)。當(dāng)誘變劑添加量為5.0%時(shí)，致死率達(dá)到81.75%，隨著誘變劑濃度的提高，曲線趨于平緩。因此，選擇誘變劑硫酸二乙酯添加量為5.0%。

圖5 硫酸二乙酯添加量對菌體致死率的影響Fig.5 Effect of diethyl sulfate addition on the lethality of bacteria

2.3.3 誘變菌株JZ-2的形態(tài)學(xué)鑒定

通過平板分離培養(yǎng)基分離純化，從誘變菌株中篩選出10株酵母菌；用TTC培養(yǎng)基和乳酸培養(yǎng)基進(jìn)行初篩，篩選出3株能耐45 ℃以上的酵母菌，編號為JZ-1～JZ-3。其中JZ-2菌株在TTC培養(yǎng)基下顏色最深，JZ-1和JZ-3次之。通過YPD固體培養(yǎng)基劃線分離，以及47 ℃高溫培養(yǎng)，最終篩選出一株菌落形態(tài)較好的耐高溫酵母菌，編號為JZ-2，菌株JZ-2菌落及細(xì)胞形態(tài)觀察結(jié)果見圖6。由圖6a可知，在28 ℃培養(yǎng)條件下，菌株JZ-2菌落形態(tài)為圓形，較大較厚，呈乳白色，表層濕潤，粘稠，表面平坦，不反光。由圖6b可知，在47 ℃培養(yǎng)條件下，菌落形態(tài)為圓形，乳白色，菌落較小，直徑范圍約0.5～1.0 mm。28 ℃是常溫下培菌的溫度且比較適合菌株的生長，47 ℃是酵母菌的最高耐受溫度，兩者的菌落和鏡檢圖可做對比，由圖6c可知，在28 ℃下鏡檢，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞多為橢圓狀且細(xì)胞形態(tài)較大。由圖6d可知，47 ℃條件下，細(xì)胞多數(shù)呈圓柱形、檸檬形。

圖6 菌株JZ-2的菌落（a,b）及細(xì)胞（c,d）形態(tài)Fig.6 Colony (a,b) and cell (c,d) morphologies of strain JZ-2

2.3.4 誘變菌株JZ-2產(chǎn)乙醇測定

在40 ℃下用糖度為12°Bx的發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)菌種JZ-2，靜置培養(yǎng)6 d，測得CO2質(zhì)量損失為5.81 g，產(chǎn)乙醇為4.8%vol。

2.4 誘變菌株JZ-2遺傳穩(wěn)定性測定

在對突變菌種JZ-2經(jīng)過5次傳代，在47 ℃條件下仍能穩(wěn)定生長，且產(chǎn)乙醇能力趨于穩(wěn)定，為4.6%vol，表明誘變菌株JZ-2具有較好的遺傳穩(wěn)定性。

2.5 誘變菌株JZ-2的溫度耐受性

在不同溫度下對突變株JZ-2分別培養(yǎng)24 h，OD600nm值測定結(jié)果見圖7。由圖7可知，當(dāng)培養(yǎng)溫度為33～37 ℃時(shí)，菌種的OD600nm值呈上升態(tài)勢；溫度在37～50 ℃時(shí)，OD600nm值不斷減少；當(dāng)達(dá)到50 ℃時(shí)，OD600nm值達(dá)到最小值，生長趨近停止；在47 ℃時(shí)，菌株緩慢生長，生長受到抑制；表明該酵母菌的最適生長溫度為37 ℃，最高溫度耐受性為47 ℃。

圖7 溫度對菌株JZ-2生長的影響Fig.7 Effect of temperature on strain JZ-2 growth

2.6 誘變菌株JZ-2發(fā)酵條件優(yōu)化

2.6.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

由圖8a可知，在28～40 ℃條件下，CO2質(zhì)量損失呈上升態(tài)勢，在40～43 ℃下，CO2質(zhì)量損失不斷減少，表明發(fā)酵溫度為40 ℃時(shí)，突變株JZ-2的發(fā)酵性能最好。過高或過低pH環(huán)境中生長的酵母細(xì)胞，其細(xì)胞膜的帶電荷狀態(tài)以及酶促反應(yīng)均會受到影響。由圖8b可知，CO2質(zhì)量損失在發(fā)酵pH為4.0時(shí)達(dá)到最高為5.66 g，說明該pH狀態(tài)下，既保證了細(xì)胞膜的穩(wěn)定電荷，又使得酶促反應(yīng)正常進(jìn)行。由圖8c可知，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基的糖度在8～16°Bx范圍內(nèi)，CO2質(zhì)量損失不斷增加，16～18°Bx之間CO2質(zhì)量損失減少，表明菌株JZ-2的最適發(fā)酵糖度為16°Bx。由圖8d可知，當(dāng)接種量為12%時(shí)，CO2質(zhì)量損失達(dá)到最高為6.43 g，表明菌種JZ-2的最適接種量為12%。

圖8 不同發(fā)酵溫度（a）、初始pH（b）、初始糖度（c）和接種量（d）對CO2質(zhì)量損失的影響Fig.8 Effects of different fermentation temperature (a),initial pH (b),initial sugar contents (c) and inoculum (d) on CO2 mass loss

2.6.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)了17個(gè)試驗(yàn)的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。采用Design Expert 8.0.6軟件對表4數(shù)據(jù)進(jìn)行多元二次回歸擬合，得到CO2質(zhì)量損失（Y）對發(fā)酵溫度（A）、初始pH值（B）、初始糖度（C）的多元回歸方程為：Y=7.51-0.24A+0.096B+0.42C+0.21AB+0.16BC-1.48A2-0.35B2-0.33C2。

表2 發(fā)酵條件優(yōu)化Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiments for fermentation conditions optimization

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

由表3可知，該模型的F=90.31，P＜0.000 1，表明該模型極顯著；失擬項(xiàng)F值=4.83，P＞0.05，表明失擬項(xiàng)不顯著，模型的決定系數(shù)R2=0.998 1，調(diào)整決定系數(shù)R2Adj=0.995 7，說明該模型合理可行。由P值可知，一次項(xiàng)A、C、二次項(xiàng)A2、B2、C2對Y值影響極顯著（P＜0.01），交互項(xiàng)AB、BC對Y值影響顯著（P＜0.05），其余項(xiàng)則不顯著。由F值可知，各因素對CO2質(zhì)量損失的影響顯著性大小順序依次為初始糖度（C）＞發(fā)酵溫度（A）＞初始pH值（B）。

2.6.3 各因素交互作用響應(yīng)曲面分析

三個(gè)顯著因素的響應(yīng)面曲線都呈現(xiàn)拋物線形態(tài)，且開口向下，表明存在有峰值。響應(yīng)面坡度越陡，各種因素間的交互作用就越顯著。各因素交互作用響應(yīng)面及等高線見圖9。由圖9可知，A和B、B和C交互作用顯著（P＜0.05），A和C交互作用不顯著（P＞0.05）。

2.6.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

由Design Expert8.0.6軟件優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)條件，結(jié)果表明：當(dāng)優(yōu)化條件分別為發(fā)酵溫度39.82 ℃，初始pH值4.28，初始糖度15.43°Bx時(shí)，CO2的質(zhì)量損失預(yù)測值為7.685 g。根據(jù)實(shí)際操作可行性，將發(fā)酵條件修正為發(fā)酵溫度40 ℃，初始pH值4，初始糖度16°Bx。在此最佳條件下進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，可得CO2質(zhì)量損失實(shí)際值為（7.63±0.17）g，與預(yù)測值基本吻合，說明所建模型擬合效果真實(shí)良好。并通過利用蒸餾-酒精計(jì)法測得優(yōu)化后的菌種JZ-2的產(chǎn)乙醇能力為5.6%vol。

3 結(jié)論

本研究對實(shí)驗(yàn)室保藏菌種JZ進(jìn)行UV-DES復(fù)合誘變，獲得了溫度耐受性以及乙醇產(chǎn)量顯著提高且遺傳性能穩(wěn)定的突變株JZ-2，并利用單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面分析法對其發(fā)酵培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。經(jīng)篩選得到的突變菌株JZ-2，在40 ℃下發(fā)酵6 d，產(chǎn)乙醇可達(dá)4.8%vol。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果顯示，突變菌種JZ-2的最佳發(fā)酵條件為培養(yǎng)溫度40 ℃、初始pH4、糖度為16°Bx、接種量12%，在此條件下，突變菌株JZ-2的產(chǎn)乙醇能力最高可達(dá)5.6%vol。發(fā)酵酒分仍偏低，可能原因?yàn)槭紫仍摼晔钱叧嘟湍?，產(chǎn)乙醇能力在一定程度上沒有釀酒酵母的產(chǎn)酒率高；其次溫度的影響，40 ℃的條件下雖不能完全抑酵母的生長，但對其存在一定的抑制。但相比于初始菌株產(chǎn)乙醇能力提高了17%，顯示其在高溫下發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的潛力巨大，為開發(fā)利用白酒釀造微生物資源和解決企業(yè)“夏季掉排”現(xiàn)象提供理論依據(jù)和應(yīng)用參考。