基于mTOR/HIF-1α/VEGF通路研究紅芪多糖防治放射性肺損傷的作用機(jī)制

王 強(qiáng)，王 藝，張 莉，尚 蕓，李亮亮，杜秈芹，李 爽，藺興遙, 2*

基于mTOR/HIF-1α/VEGF通路研究紅芪多糖防治放射性肺損傷的作用機(jī)制

王 強(qiáng)1，王 藝1，張 莉1，尚 蕓1，李亮亮1，杜秈芹1，李 爽1，藺興遙1, 2*

1. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000 2. 敦煌醫(yī)學(xué)與轉(zhuǎn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000

研究紅芪多糖對放射性肺損傷（radiation-induced lung injury，RILI）的防治作用及其機(jī)制。雌性C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為對照組、模型組、紅芪水煎液（5 g/kg）組及紅芪多糖低、中、高劑量（15、30、60 mg/kg）組和吡非尼酮（200 mg/kg）組，每組8只。對照組佯裝輻照，其余各組均采用單次16 Gy全肺X線輻照建立RILI模型。自造模前7 d，各給藥組ig相應(yīng)藥物，1次/d，連續(xù)5周。所有小鼠均在取材前1 d進(jìn)行肺功能檢測；分別在造模前1 d及肺功能檢測后進(jìn)行CT影像學(xué)檢測；采用蘇木素-伊紅（HE）染色觀察小鼠肺組織病理變化；采用ELISA檢測小鼠血清中腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）水平；采用Western blotting檢測小鼠肺組織中哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）、缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）及TNF-α蛋白表達(dá)。與對照組比較，模型組小鼠肺泡炎癥明顯，肺功能受損，肺部CT值升高（＜0.01），血清中TNF-α及IL-6水平升高（＜0.01），肺組織中mTOR、HIF-1α、VEGF及TNF-α蛋白表達(dá)上調(diào)（＜0.01）。與模型組比較，紅芪多糖組明顯減輕小鼠肺泡炎癥，改善肺功能，降低肺部CT值（＜0.01），抑制血清中TNF-α及IL-6水平（＜0.05、0.01），下調(diào)肺組織中mTOR、HIF-1α、VEGF及TNF-α蛋白表達(dá)（＜0.05、0.01）。紅芪多糖能夠減輕小鼠RILI前期炎癥的損傷，其機(jī)制可能與抑制mTOR/HIF-1α/VEGF信號通路有關(guān)。

紅芪多糖；放射性肺損傷；肺功能；炎癥；哺乳動物雷帕霉素靶蛋白/缺氧誘導(dǎo)因子-1α/血管內(nèi)皮生長因子信號通路

放射性肺損傷（radiation-induced lung injury，RILI）包括前期放射性肺炎及后期放射性肺纖維化，是胸部放療最常見的劑量限制性并發(fā)癥[1]。由于RILI有許多促成因素和診斷環(huán)境，其報(bào)告的發(fā)病率差異顯著，數(shù)據(jù)顯示，RILI發(fā)病率最高的是肺癌（5%～25%），其次是縱隔淋巴瘤（5%～10%）和乳腺癌（1%～5%）[2]。RILI的發(fā)生不僅限制了放療的最高劑量，降低了腫瘤的控制率，而且可導(dǎo)致呼吸困難等癥狀，影響患者生活質(zhì)量，甚至后期可進(jìn)展為呼吸衰竭，威脅患者生命。目前RILI的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，國內(nèi)外尚無針對RILI的特效藥[3]。吡非尼酮是美國胸科學(xué)會/歐洲呼吸學(xué)會/日本呼吸學(xué)會/拉丁美洲胸科學(xué)會（ATS/ERS/JRS/ALAT）2022年更新的臨床實(shí)踐指南中，推薦用于治療特發(fā)性肺纖維化的藥物之一，具有抗炎、抗氧化和抗纖維化等特性[4-6]，可用于治療RILI。然而，長期應(yīng)用吡非尼酮可能會使患者出現(xiàn)胃腸道癥狀、皮膚不良反應(yīng)以及肝功能損傷等不良反應(yīng)，在美國的一項(xiàng)III期臨床試驗(yàn)中，14.4%的患者因?yàn)槠洳涣挤磻?yīng)不得不停止用藥[7]。近年來，中醫(yī)藥在干預(yù)RILI的發(fā)生發(fā)展上取得了較好的療效[8-9]，因此，研究中醫(yī)藥防治RILI并探索其作用機(jī)制具有重要臨床意義。

紅芪多糖是甘肅省道地藥材紅芪Hand.-Mazz.中提取出的主要活性物質(zhì)，具有抗炎、抗氧化、機(jī)體保護(hù)、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用[10-14]。此外，文獻(xiàn)報(bào)道紅芪多糖對內(nèi)毒素誘導(dǎo)的急性肺損傷具有保護(hù)作用[15]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，紅芪多糖可以明顯改善博來霉素誘導(dǎo)的肺間質(zhì)纖維化[16-17]，而紅芪多糖是否可以改善RILI目前尚未見報(bào)道。基于此，本研究建立RILI小鼠模型，通過小鼠肺功能檢測、CT影像學(xué)檢測、組織病理學(xué)檢測等手段初步探討紅芪多糖對RILI的防治作用及機(jī)制。

1 材料

1.1 動物

SPF級雌性C57BL/6J小鼠56只，6～8周齡，體質(zhì)量（20±2）g，購自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量合格證號SCXK（京）2019-0010，實(shí)驗(yàn)動物設(shè)施使用證號SYXK（甘）2020-0009。動物飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，室溫（23±2）℃，相對濕度40%～52%，12 h光照/ 12 h黑暗交替，動物自由進(jìn)食飲水。動物實(shí)驗(yàn)經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號2021-241）。

1.2 藥材

紅芪飲片購自甘肅省隴南市安化鎮(zhèn)，經(jīng)甘肅省藥品檢驗(yàn)研究院馬瀟主任藥師鑒定為豆科植物多序巖黃芪Hand.-Mazz.的干燥根，符合《中國藥典》2020年版規(guī)定。

1.3 藥品與試劑

吡非尼酮膠囊（國藥準(zhǔn)字H20133376，批號20210414）購自北京康蒂尼藥業(yè)股份有限公司；-無水葡萄糖（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，批號B21882）購自上海源葉生物科技有限公司；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA試劑盒（批號2111M33）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）ELISA試劑盒（批號2111M25）購自江蘇菲亞生物科技有限公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（批號B1501）、TNF-α抗體（批號B7201）、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）抗體（批號N1301）、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（批號B0201）均購自美國Immunoway公司；缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）抗體（批號GR3368586-5）購自英國Abcam公司；血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）抗體（批號No.43866）購自美國GeneTex公司。

1.4 儀器

MF-RO-10型實(shí)驗(yàn)動物飲用水處理器（杭州永潔達(dá)凈化科技有限公司）；X-RAD225型生物輻照儀（美國Precision X-ray公司）；Inlivew-3000B型動物PET/SPECT/CT（北京永新醫(yī)療設(shè)備有限公司）；WPB PLT-UNR-RT-2型動物肺功能儀（德國EMKA公司）；SpectraMax i3x型多功能酶標(biāo)儀（美國Molecular Devices公司）；UV-power型紫外可見分光光度計(jì)（北京瑞利分析儀器有限公司）；SCIENTZ-48型高通量組織研磨器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；WD-9405F型脫色搖床、DYY-60型電泳儀（北京六一生物科技有限公司）；SFC-182型生物顯微鏡（麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司）。

2 方法

2.1 藥物制備

2.1.1 紅芪水煎液制備 紅芪飲片加入8倍量純水浸泡6 h后，煎煮1.5 h，濾過，再加入6倍量純水煎煮1.5 h，合并2次濾液，濃縮得紅芪水煎液。

2.1.2 紅芪多糖提取純化 紅芪水煎液離心取上清液，進(jìn)行4次醇沉（分別加入無水乙醇使溶液乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到70%、80%、80%及90%），每次醇沉后靜置24 h，取沉淀加入純水溶解，離心，取上清液進(jìn)行下一次醇沉。90%乙醇醇沉后濾過取沉淀，用無水乙醇洗3遍，50 ℃烘干后得紅芪粗多糖。將紅芪粗多糖用純水配制為15 mg/mL多糖溶液，加入10%三氯乙酸溶液（多糖溶液與三氯乙酸溶液體積比為4∶1），低溫劇烈振蕩30 min，離心，取上清液，加入3倍體積95%乙醇溶液醇沉，濾過，干燥后得紅芪多糖，1 kg紅芪飲片提取純化得紅芪多糖6 g。

2.1.3 紅芪多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定 以無水葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，配制質(zhì)量濃度分別為0.024、0.035、0.047、0.059、0.071 mg/mL的葡萄糖溶液，苯酚硫酸法顯色后通過紫外分光光度儀于485 nm處測得吸光度（）值分別為0.244、0.362、0.501、0.629、0.750，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），值為縱坐標(biāo)（）進(jìn)行回歸分析，得線性回歸方程＝10.808－0.014，＝0.999 7。精密配制0.042 mg/mL紅芪多糖溶液，測得值為0.364，代入回歸方程得所提紅芪多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為83.27%。

2.2 動物分組、模型制備及給藥

將56只雌性C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為對照組、模型組、紅芪水煎液（5 g/kg）組及紅芪多糖低、中、高劑量（15、30、60 mg/kg）組和吡非尼酮（200 mg/kg）組，每組8只。所有小鼠ip 3%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉，除對照組外，其余各組小鼠均仰臥固定于動物臺，充分暴露肺部，進(jìn)行單次16 Gy全肺X線輻照，未照射部位用鉛塊屏蔽，照射距離為48 cm，劑量率為2 Gy/min，照射時間8 min；對照組麻醉后佯裝輻照。自造模前7 d，各給藥組ig相應(yīng)藥物（20 mL/kg），對照組和模型組ig等體積0.9%氯化鈉溶液，1次/d，連續(xù)5周。

2.3 一般狀況觀察

觀察小鼠毛發(fā)改變、精神狀態(tài)、活動度等，每周定時測量并記錄小鼠體質(zhì)量。于造模后28 d取材時測量肺組織質(zhì)量并計(jì)算小鼠肺指數(shù)。

肺指數(shù)＝肺質(zhì)量/體質(zhì)量

2.4 肺功能檢測

于取材前1 d運(yùn)用無約束全身體積描記儀對各組小鼠進(jìn)行清醒狀態(tài)下肺功能檢測。將小鼠放入動物體積描記箱中，待其呼吸狀態(tài)平穩(wěn)時記錄肺功能指標(biāo)，包括吸氣時間（Ti）、呼氣時間（Te）、潮氣量（TV）、每分鐘通氣量（MV）、吸氣氣流高峰（PIF）、呼氣氣流高峰（PEF）。

2.5 CT檢測

分別于造模1 d前及肺功能檢測結(jié)束后，對小鼠進(jìn)行麻醉后CT檢測。各組小鼠ip 3%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉，以俯臥位放置于小動物PET/CT床位，勾選全肺進(jìn)行CT掃描。采用NMsoft-AIWS V1.7圖像處理軟件將掃描結(jié)果斷層重建后融合顯示，選用3D等值線限定CT值Min＝?1000 HU、Max＝0勾選全肺，軟件統(tǒng)計(jì)小鼠肺部平均CT值。

2.6 肺組織病理學(xué)檢測

各組小鼠麻醉后，股動脈取血，脫頸椎處死，取左肺，以10%甲醛溶液固定，經(jīng)脫水、包埋、切片后，進(jìn)行蘇木素-伊紅（HE）染色。采用Szapiel法評價肺泡炎癥程度[18]：無肺泡炎癥，記0分；輕度肺泡炎，肺泡間隔略微增寬，其間有炎性細(xì)胞浸潤，病變面積小于全肺20%，記1分；中度肺泡炎，病變面積占全肺20%～50%，記2分；重度肺泡炎，病變面積占全肺50%以上，記3分。

2.7 ELISA檢測血清中TNF-α和IL-6水平

各組小鼠全血常溫靜置2 h后，4 ℃、3000 r/min離心15 min，分離血清。按照ELISA試劑盒說明書檢測小鼠血清中TNF-α和IL-6水平。

2.8 Western blotting檢測肺組織中TNF-α、mTOR、VEGF和HIF-1α蛋白表達(dá)

取各組小鼠右肺組織，加入蛋白裂解液，低溫勻漿裂解，用高通量組織研磨器（70 Hz）充分研磨肺組織，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，分離上清液。用BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度，上清液加入蛋白上樣緩沖液，沸水浴10 min，蛋白樣品于?20 ℃保存?zhèn)溆谩５鞍讟悠方?jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，用5%脫脂牛奶封閉2 h后，以TBST洗滌3次，分別加入相應(yīng)抗體，4 ℃孵育過夜；TBST洗滌3次，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體，室溫孵育2 h，TBST洗滌后，均勻滴加ECL試劑，暗室曝光，用Image J 1.48V圖像處理軟件分析條帶灰度值。

2.9 統(tǒng)計(jì)分析

3 結(jié)果

3.1 一般狀況觀察

3.1.1 小鼠生存狀況 如圖1所示，對照組小鼠在實(shí)驗(yàn)過程中動作敏捷、精神良好、皮毛光澤。其余各組小鼠在輻照后均出現(xiàn)不同程度的動作減緩、精神萎靡。各給藥組小鼠在輻照后7 d左右動作、精神狀況逐漸恢復(fù)，模型組及吡非尼酮組小鼠恢復(fù)較慢。小鼠在輻照后21 d左右出現(xiàn)輻照部位毛發(fā)脫落。

3.1.2 小鼠體質(zhì)量變化 如圖2所示，輻照后，除對照組小鼠體質(zhì)量平緩上升外，其余各組小鼠體質(zhì)量均在7 d內(nèi)呈下降趨勢，7 d后小鼠體質(zhì)量開始逐漸恢復(fù)并上升。其中，模型組及吡非尼酮組上升最慢，紅芪多糖高劑量組上升最快。7～21 d，與對照組比較，模型組小鼠體質(zhì)量顯著降低（＜0.01）。14 d時，與模型組比較，紅芪多糖中、高劑量組小鼠體質(zhì)量顯著增加（＜0.05、0.01）。21 d時，除吡非尼酮組外，其余各給藥組小鼠體質(zhì)量均高于模型組（＜0.01）。

3.2 肺組織病理學(xué)觀察

如圖3所示，對照組小鼠肺組織無明顯病理學(xué)改變，結(jié)構(gòu)清晰，輪廓完整。模型組小鼠肺組織破壞嚴(yán)重，可見支氣管上皮細(xì)胞壞死脫落，肺泡間隔明顯增寬，肺間質(zhì)有大量炎性細(xì)胞浸潤，血管肌層增厚，周圍水腫。與模型組比較，各給藥組均能在一定程度減輕小鼠肺組織炎癥反應(yīng)，其中紅芪多糖中、高劑量組及吡非尼酮組效果較為明顯。

圖1 輻照后21 d各組小鼠脫毛情況

與對照組比較：**P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01，下圖同

圖3 紅芪多糖對RILI小鼠肺組織病理變化的影響 (HE, ×200)

如表1所示，與對照組比較，模型組小鼠肺指數(shù)和肺泡炎評分顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，紅芪多糖低、中、高劑量組及吡非尼酮組小鼠肺指數(shù)顯著降低（＜0.01），吡非尼酮組和紅芪多糖中、高劑量組小鼠肺泡炎評分顯著降低（＜0.05、0.01）。

表1 各組小鼠肺指數(shù)和肺泡炎評分(, n = 8)

與對照組比較，P＜0.01；與模型組比較，P＜0.05P＜0.01，下表同

P< 0.01control group;P< 0.05P< 0.01model group, same as below tables

3.3 小鼠肺功能檢測

于輻照后27 d對小鼠進(jìn)行清醒狀態(tài)下肺功能檢測，如表2所示，與對照組比較，模型組小鼠Ti、TE顯著升高（＜0.01），PIF、PEF、TV及MV顯著降低（＜0.01）。與模型組比較，紅芪多糖低、中、高劑量組及吡非尼酮組小鼠Ti、TE均顯著降低（＜0.05、0.01），MV顯著升高（＜0.01）；紅芪多糖中、高劑量組及吡非尼酮組TV及PEF顯著升高（＜0.05、0.01）。

3.4 小鼠肺組織CT值變化

如表2所示，輻照前各組之間小鼠肺部CT值無明顯差異。輻照后27 d，與對照組比較，模型組小鼠肺部CT值升高（＜0.01）；與模型組比較，紅芪多糖高劑量組及吡非尼酮組小鼠肺部CT值顯著降低（＜0.01）。

表2 各組小鼠肺功能指標(biāo)及CT值(, n = 8)

3.5 血清中TNF-α和IL-6水平

如圖4所示，與對照組比較，輻照28 d后模型組小鼠血清中TNF-α和IL-6水平均顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，紅芪多糖中、高劑量組及吡非尼酮組小鼠血清中TNF-α和IL-6水平均顯著降低（＜0.05、0.01）。

3.6 肺組織中TNF-α、mTOR、VEGF和HIF-1α蛋白表達(dá)

如圖5所示，與對照組比較，輻照28 d后模型組小鼠肺組織中TNF-α、mTOR、VEGF及HIF-1α蛋白表達(dá)水平均顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，紅芪多糖中、高劑量組及吡非尼酮組肺組織中TNF-α、mTOR、VEGF及HIF-1α蛋白表達(dá)均水平顯著降低（＜0.05、0.01）。

圖4 紅芪多糖對RILI小鼠血清中TNF-α及IL-6水平的影響(, n = 8)

圖5 紅芪多糖對RILI小鼠肺組織中mTOR、HIF-1α、VEGF和TNF-α蛋白表達(dá)的影響(, n = 8)

4 討論

RILI從臨床上主要分為炎癥期和纖維化期，炎癥期常發(fā)生于1～3個月，纖維化期常發(fā)生于6～24個月，而從分子水平觀察，RILI則是一個連續(xù)進(jìn)展的過程。肺部輻照產(chǎn)生大量的活性氧和活性氮，氧化損傷DNA、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)，從而導(dǎo)致肺泡上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷或凋亡。隨后，許多炎性細(xì)胞被募集到損傷部位，并分泌大量細(xì)胞因子，進(jìn)而產(chǎn)生一系列細(xì)胞因子級聯(lián)反應(yīng)，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)及后期的纖維化[19]。由于肺纖維化的不可逆性及難治性，在肺炎時期采取積極的干預(yù)措施對防治RILI具有重要意義。

組織病理學(xué)、肺功能及CT影像學(xué)檢測在診斷RILI中發(fā)揮重要作用，可有效評價RILI程度及發(fā)展階段[20]。本研究根據(jù)文獻(xiàn)調(diào)研及前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果綜合分析，最終采用單次16 Gy全肺X線輻照建立RILI模型，于輻照后28 d取材。肺組織HE染色結(jié)果顯示，模型組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，炎性細(xì)胞浸潤明顯；肺功能及CT檢測結(jié)果顯示，模型組小鼠肺功能明顯受損，肺部CT值顯著升高；而給予紅芪多糖后可減少小鼠肺組織炎癥細(xì)胞浸潤，改善肺功能各項(xiàng)指標(biāo)，降低肺部CT值。在肺功能檢測結(jié)果中，紅芪多糖組小鼠PIF雖較模型組有所提高，但差異不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能是由于小鼠并沒有自主用力吸氣意識導(dǎo)致結(jié)果并不完全準(zhǔn)確。RILI前期炎癥CT影像學(xué)表現(xiàn)在動物模型中并不明顯，可表現(xiàn)為均勻的斑片狀、小結(jié)節(jié)狀磨玻璃影或?qū)嵶冇暗?，在后期纖維化時可出現(xiàn)條狀、帶狀纖維條索影等[21]。由于本研究只進(jìn)行到輻照后28 d，小鼠尚未出現(xiàn)明顯的肺纖維化，故通過比較各組間輻照前后CT值來統(tǒng)計(jì)分析CT結(jié)果。肺部CT值是X線輻照衰減在CT圖像上的量化指標(biāo)，能客觀地評價肺組織密度，反映肺組織損傷程度，可應(yīng)用于輔助診斷RILI[22]。以上結(jié)果表明RILI小鼠模型成功建立且紅芪多糖對RILI具有一定保護(hù)作用。

在肺部輻照早期，TNF-α、IL-6等細(xì)胞因子的過度表達(dá)對RILI的發(fā)生發(fā)展起到了重要作用。TNF-α是RILI炎癥階段的啟動因子，通過誘導(dǎo)黏附分子的表達(dá)，招募炎性細(xì)胞到組織損傷部位，啟動炎性細(xì)胞產(chǎn)生氧化物，從而發(fā)揮促炎作用[23]。IL-6是下丘腦-垂體-腎上腺軸的內(nèi)源性調(diào)節(jié)因子，在炎癥過程中的免疫-神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[24]。臨床研究亦顯示，循環(huán)IL-6早期變化可作為預(yù)測放射性肺炎的指標(biāo)[25]。因此，檢測小鼠血清中TNF-α和IL-6水平可在一定程度反映RILI前期肺炎損傷情況，且在初始階段對TNF-α和IL-6進(jìn)行藥理調(diào)控可能會阻止RILI的進(jìn)展。本研究發(fā)現(xiàn)模型組小鼠輻照后血清中TNF-α及IL-6水平顯著升高，而紅芪多糖可下調(diào)TNF-α及IL-6水平，提示紅芪多糖減輕RILI前期炎癥損傷可能與抑制TNF-α及IL-6的釋放有關(guān)。

Fleckenstein等[26]研究發(fā)現(xiàn)，RILI炎癥期、纖維化期與組織缺氧有關(guān)。肺部輻照后幾周內(nèi)就會發(fā)生血管損傷，如內(nèi)皮細(xì)胞腫脹導(dǎo)致毛細(xì)血管狹窄和閉塞、較大血管內(nèi)纖維蛋白栓的形成及內(nèi)皮細(xì)胞增生等，從而導(dǎo)致組織缺氧[27]。而在缺氧條件下，HIF-1α激活VEGF過表達(dá)，從而促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)血管生成，增加血管通透性，導(dǎo)致肺高滲性水腫和毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，引起肺部炎癥[28-29]。mTOR是HIF-1α的上游基因，mTOR激活可以使HIF-1α入核，進(jìn)而調(diào)控下游的VEGF表達(dá)，加重炎癥損傷[30]。本研究結(jié)果顯示，輻照后小鼠肺組織mTOR蛋白表達(dá)顯著增加，并伴隨著HIF-1α、VEGF及TNF-α上調(diào)；而紅芪多糖可以降低小鼠肺組織中mTOR、HIF-1α、VEGF及TNF-α蛋白表達(dá)，表明紅芪多糖改善RILI的作用可能與抑制mTOR/HIF-1α/ VEGF信號通路有關(guān)。

綜上所述，紅芪多糖有明顯改善RILI炎癥的作用，其機(jī)制可能與下調(diào)mTOR/HIF-1α/VEGF信號通路從而抑制TNF-α和IL-6等炎癥因子的釋放有關(guān)。吡非尼酮改善RILI前期炎癥的總體效果優(yōu)于紅芪多糖，但從體質(zhì)量變化趨勢分析，吡非尼酮組小鼠輻照后體質(zhì)量下降明顯且恢復(fù)較慢，考慮為吡非尼酮誘發(fā)小鼠出現(xiàn)胃腸道反應(yīng)甚至肝損傷所致。而紅芪多糖中、高劑量組對前期肺炎也有較好的治療作用，且輻照后體質(zhì)量均快速回升，并未出現(xiàn)不良反應(yīng)。由此可以考慮為紅芪多糖的毒副作用低于吡非尼酮，需要進(jìn)一步深入研究。本研究只進(jìn)行到輻照后28 d，病理上處于放射性肺炎階段，關(guān)于紅芪多糖對RILI后期肺纖維化階段的作用效果及機(jī)制有待后續(xù)探索研究。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] Madani I, de Ruyck K, Goeminne H,. Predicting risk of radiation-induced lung injury [J]., 2007, 2(9): 864-874.

[2] Hanania A N, Mainwaring W, Ghebre Y T,. Radiation-induced lung injury: Assessment and management [J]., 2019, 156(1): 150-162.

[3] Xia C C, Shi W Y, Zhang Y Y,. Prevention and treatment of radiation-induced lung injury [J]., 2020, 12(23): 2161-2173.

[4] Raghu G, Remy-Jardin M, Richeldi L,. Idiopathic pulmonary fibrosis (an update) and progressive pulmonary fibrosis in adults: An official ATS/ERS/JRS/ALAT clinical practice guideline [J]., 2022, 205(9): e18-e47.

[5] Lopez-de la Mora D A, Sanchez-Roque C, Montoya-Buelna M,. Role and new insights of pirfenidone in fibrotic diseases [J]., 2015, 12(11): 840-847.

[6] 胡朝陽, 張小紅, 常瑞, 等. 漢防己甲素片聯(lián)合吡非尼酮治療肺間質(zhì)纖維化的臨床研究[J]. 現(xiàn)代藥物與臨床, 2020, 35(4): 739-743.

[7] King T E Jr, Jr B, Castro-Bernardini S,. A phase 3 trial of pirfenidone in patients with idiopathic pulmonary fibrosis [J]., 2014, 370(22): 2083-2092.

[8] 張彥偉, 張志強(qiáng), 吳麗賢, 等. 雷公藤內(nèi)酯醇減少放射性肺纖維化中肌成纖維細(xì)胞活化與抑制TGF-β1/ERK/Smad3通路相關(guān) [J]. 中國藥理學(xué)通報(bào), 2017, 33(5): 630-636.

[9] 劉煒, 駱新, 沈靜. 補(bǔ)肺湯通過TGF-β/Smad3信號通路抑制小鼠肺纖維化的研究 [J]. 醫(yī)藥導(dǎo)報(bào), 2020, 39(6): 747-752.

[10] 張, 周尚儒, 燕玉奎, 等. 紅芪雜多糖及其透明質(zhì)酸水凝膠對大鼠骨關(guān)節(jié)炎的治療作用 [J]. 免疫學(xué)雜志, 2019, 35(1): 65-70.

[11] Zhao L G, Chen T Q, Feng D M,. Structural characterization and antioxidant activity of a heteropolysaccharide isolated from[J]., 2014, 16(6): 677-684.

[12] 楊杰, 衛(wèi)東鋒, 李曉東, 等. 紅芪多糖對腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷保護(hù)作用的差異蛋白質(zhì)研究 [J]. 中藥藥理與臨床, 2016, 32(2): 113-118.

[13] 顏春魯, 李欽, 姚貞宇, 等. 紅芪多糖對免疫抑制大鼠免疫功能與細(xì)胞因子的影響 [J]. 中國臨床藥理學(xué)雜志, 2017, 33(13): 1233-1236.

[14] 趙良功, 方瑤瑤, 劉小花, 等. 紅芪多糖對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和成骨細(xì)胞的影響[J]. 中草藥, 2021, 52(2): 432-436.

[15] 耿廣琴, 謝曉蓉, 王雅莉, 等. 紅芪總多糖對急性肺損傷小鼠細(xì)胞因子及抗氧化功能的影響 [J]. 中國臨床藥理學(xué)雜志, 2017, 33(15): 1443-1446.

[16] 蘇韞, 張毅, 李娟, 等. 紅芪有效部位對肺間質(zhì)纖維化模型大鼠肺組織膠原面積、透明質(zhì)酸及層黏連蛋白的影響 [J]. 中國中醫(yī)藥信息雜志, 2016, 23(4): 72-76.

[17] 王藝, 張毅, 李娟, 等. 紅芪多糖、紅芪黃酮和紅芪皂苷抗博來霉素致大鼠肺間質(zhì)纖維化的作用 [J]. 中成藥, 2022, 44(2): 573-578.

[18] Szapiel S V, Elson N A, Fulmer J D,. Bleomycin-induced interstitial pulmonary disease in the nude, athymic mouse [J]., 1979, 120(4): 893-899.

[19] Huang Y J, Zhang W Q, Yu F R,. The cellular and molecular mechanism of radiation-induced lung injury [J]., 2017, 23: 3446-3450.

[20] 王綠化, 傅小龍, 陳明, 等. 放射性肺損傷的診斷及治療 [J]. 中華放射腫瘤學(xué)雜志, 2015, 24(1): 4-9.

[21] 張安妮, 孫晶晶, 胡鈱琪. 放射性肺損傷影像學(xué)表現(xiàn)的研究進(jìn)展 [J]. 腫瘤學(xué)雜志, 2021, 27(3): 236-240.

[22] Tao Q S, Zhu T, Ge X Q,. The application value of spiral CT lung densitometry software in the diagnosis of radiation-induced lung injury [J]., 2021, 2021: 9305508.

[23] Rübe C E, Wilfert F, Uthe D,. Modulation of radiation-induced tumour necrosis factor α (TNF-α) expression in the lung tissue by pentoxifylline [J]., 2002, 64(2): 177-187.

[24] Dai C D, Imaki T, Suda T,. Involvement of corticotropin-releasing hormone- and interleukin (IL)-6-dependent proopiomelanocortin induction in the anterior pituitary during hypothalamic-pituitary-adrenal axis activation by IL-1alpha [J]., 2005, 146(12): 5496-5502.

[25] Arpin D, Perol D, Blay J Y,. Early variations of circulating interleukin-6 and interleukin-10 levels during thoracic radiotherapy are predictive for radiation pneumonitis [J]., 2005, 23(34): 8748-8756.

[26] Fleckenstein K, Zgonjanin L, Chen L G,. Temporal onset of hypoxia and oxidative stress after pulmonary irradiation [J]., 2007, 68(1): 196-204.

[27] Yarnold J, Brotons M C V. Pathogenetic mechanisms in radiation fibrosis [J]., 2010, 97(1): 149-161.

[28] Zhang X J, Li J J, Li C F,. HSPA12B attenuates acute lung injury during endotoxemia in mice [J]., 2015, 29(2): 599-606.

[29] Lin F, Pan L H, Ruan L,. Differential expression of HIF-1α, AQP-1, and VEGF under acute hypoxic conditions in the non-ventilated lung of a one-lung ventilation rat model [J]., 2015, 124: 50-55.

[30] Hu Y, Liu J, Wu Y F,. mTOR and autophagy in regulation of acute lung injury: A review and perspective [J]., 2014, 16(9): 727-734.

Mechanism of hedysarum polysaccharides on preventing and treating radiation-induced lung injury based on mTOR/HIF-1α/VEGF signaling pathway

WANG Qiang1, WANG Yi1, ZHANG Li1, SHANG Yun1, LI Liang-liang1, DU Xian-qin1, LI Shuang1, LIN Xing-yao1, 2

1. Gansu University of Chinese Medicine, Lanzhou 730000, China 2. Key Laboratory of Dunhuang Medicine, Ministry of Education, Lanzhou 730000, China

To investigate the preventive effect and mechanism of hedysarum polysaccharides on radiation-induced lung injury (RILI).Female C57BL/6J mice were randomly divided into control group, model group,decoction (5 g/kg) group, hedysarum polysaccharides low-, medium-, high-dose (15, 30, 60 mg/kg) groups and pirfenidone (200 mg/kg) group, with eight mice in each group. Control group was feigned to be irradiated, other groups were accepted a single dose of 16 Gy X-ray irradiation to establish RILI model. Before 7 d of modeling, each administration group was ig corresponding drugs, once a day for five weeks. All mice were tested for pulmonary function at 1 d before sampling; CT imaging was performed before modeling and after pulmonary function test; Hematoxylin-eosin (HE) staining was used to observe the pathological changes in lung tissue of mice; ELISA was used to detect levels of tumor necrosis factor-α (TNF-α) and interleukin-6 (IL-6) in serum of mice; Western blotting was used to detect mammalian target of rapamycin (mTOR), hypoxia-inducible factor-1α (HIF-1α), vascular endothelial growth factor (VEGF) and TNF-α protein expressions in lung tissue of mice.Compared with control group, model group showed significant alveolar inflammation, impaired pulmonary function, and lung CT value was increased (< 0.01), TNF-α and IL-6 levels in serum were increased (< 0.01), mTOR, HIF-1α, VEGF and TNF-α protein expressions in lung tissue were up-regulated (< 0.01). Compared with model group, hedysarum polysaccharides group reduced alveolar inflammation, improved pulmonary function, reduced lung CT value (< 0.01), inhibited levels of TNF-α and IL-6 in serum (< 0.05, 0.01), and down-regulated mTOR, HIF-1α, VEGF and TNF-α protein expressions in lung tissues (< 0.05, 0.01).Hedysarum polysaccharides can effectively alleviate the inflammatory injury in early stage of RILI in mice, and its mechanism may be related to the inhibition of mTOR/HIF-1α/VEGF signaling pathway.

hedysarum polysaccharides; radiation-induced lung injury; lung function; inflammation; mammalian target of rapamycin/hypoxia-inducible factor-1α/vascular endothelial growth factor signaling pathway

R285.5

A

0253 - 2670(2022)21 - 6771 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.21.014

2022-07-16

甘肅省人才發(fā)展專項(xiàng)資金（40160401）；甘肅省中醫(yī)藥研究中心專項(xiàng)開放課題（zyzx-2020-zx19）

王 強(qiáng)，碩士研究生，研究方向?yàn)橹形麽t(yī)結(jié)合防治腫瘤。E-mail: 1033618469@qq.com

藺興遙，碩士生導(dǎo)師，教授，從事中醫(yī)藥防治重大疾病基礎(chǔ)與應(yīng)用基礎(chǔ)研究。E-mail: 878104134@qq.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]