基于苦味閾值濃度的苦味中藥分子苦度當(dāng)量定量方法研究

王青曉，高曉潔，桂新景，王艷麗*，王君明，李晨旭，任延娜，姚 靜，張 璐，施鈞瀚，李學(xué)林，劉瑞新*

基于苦味閾值濃度的苦味中藥分子苦度當(dāng)量定量方法研究

王青曉1，高曉潔2，桂新景3, 4, 5，王艷麗3, 4, 5*，王君明4，李晨旭4，任延娜4，姚 靜3, 4, 5，張 璐3, 4, 5，施鈞瀚3, 4, 5，李學(xué)林3, 4, 5，劉瑞新3, 4, 5*

1. 河南省食品藥品檢驗(yàn)所，河南 鄭州 450008 2. 鄭州市中醫(yī)院制劑室，河南 鄭州 450007 3. 河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，河南 鄭州 450000 4. 河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450046 5. 河南中醫(yī)藥大學(xué) 呼吸疾病中醫(yī)藥防治省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 鄭州 450046

建立適用于苦味中藥的苦度定量方法。采用經(jīng)典人群口感評(píng)價(jià)法，以鹽酸小檗堿為參比苦味物質(zhì)，以不同濃度的23種苦味中藥飲片水煎液為載體，采用“最小極限法”預(yù)測中藥飲片的苦味閾值濃度（bitterness threshold concentration，BTC），并在此基礎(chǔ)上計(jì)算苦味中藥的分子苦度當(dāng)量（equivalent molecular bitterness，EMB）和分子苦度當(dāng)量指數(shù)（EMB-index，EMBI），進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對中藥飲片的苦度定量測定；此外，以不同濃度的黃連和苦參水煎液為載體，對建立方法的重現(xiàn)性進(jìn)行驗(yàn)證。建立了感知到苦味的人數(shù)比例與苦味中藥飲片水煎液濃度的對數(shù)模型和威布爾模型，由擬合方程的2和值可知威布爾模型優(yōu)于對數(shù)模型，由威布爾模型的擬合方程計(jì)算出中藥飲片的BTC，進(jìn)而測得了23種苦味中藥飲片的EMB和EMBI；方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果顯示，測得的黃連和苦參的EMB以及EMBI的RSD值均小于20%，重現(xiàn)性相對良好。采用經(jīng)典人群口感評(píng)價(jià)法預(yù)測出了23種中藥飲片的EMB和EMBI，建立了苦味中藥的苦度定量測定方法。

苦味中藥；經(jīng)典人群口感評(píng)價(jià)法；苦味閾值濃度；分子苦度當(dāng)量；黃連；苦參

自古以來，就有著“良藥苦口”的說法[1]，對于中藥飲片及中藥復(fù)方來說，其五味雜陳，然而最讓人難以接受的還是苦味，嚴(yán)重影響患者的服藥依從性[2-3]。此外，人們對中藥苦度的表達(dá)多使用“微苦”“苦”“極苦”等定性的描述，或半定量的測量方法，缺乏準(zhǔn)確客觀的定量描述[4-5]。且已有的評(píng)價(jià)方法存在測量標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一、適用范圍窄等問題，沒有一套科學(xué)、可行、規(guī)范的測試體系，這對于實(shí)現(xiàn)中藥飲片及中藥復(fù)方苦度的精準(zhǔn)預(yù)測，進(jìn)而開發(fā)合適的掩味劑，改善其口感是十分不利的。那么如何實(shí)現(xiàn)對中藥苦味的測量，基于測出的苦味強(qiáng)度尋求合適的掩味劑，改善中藥以及復(fù)方的口感，從而提高患者服藥依從性已經(jīng)成為擺在藥學(xué)工作人員面前亟不可待的事情。課題組前期提出了針對單體苦味化合物的“分子苦度（molecular bitterness，MB）”的概念，并且實(shí)現(xiàn)了對19種苦味單體分子苦度的測量[6]，然而，對于苦味中藥的苦度評(píng)價(jià)，其對象就不再局限于單個(gè)化合物，而是多類苦味化合物的疊加，已有的苦味單體化合物的定量方法不能完全復(fù)制于復(fù)雜成分的中藥，因此，尋求新的，適合苦味中藥苦度定量的方法十分必要。本研究旨在建立一種基于“苦味閾值濃度（bitterness threshold concentration，BTC）”測量的苦味中藥“分子苦度當(dāng)量（equivalent molecular bitterness，EMB）”的測定方法，可以準(zhǔn)確客觀地測定苦味中藥的苦度，為藥物的苦度評(píng)價(jià)提供量化指標(biāo)，并為藥物掩味提供技術(shù)支撐，開拓藥物的商業(yè)價(jià)值，提高藥物服用效果，具有顯著的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。

1 儀器與材料

1.1 儀器

BCA2248-CW型電子天平、CP225D型十萬分之一電子天平，德國Sartorius公司；HK250型科導(dǎo)臺(tái)式超聲清洗器，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；AM-5250B型磁力攪拌器，天津奧特賽恩斯儀器有限公司；HH-S4A型電熱恒溫水浴鍋，北京科偉永興儀器有限公司；TD5M型多管架自動(dòng)平衡離心機(jī)，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.2 材料

本實(shí)驗(yàn)所用中藥飲片經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院陳天朝主任藥師鑒定均合格，符合《中國藥典》2020年版規(guī)定，具體信息見表1。

2 方法

2.1 志愿者篩選

經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)后（倫理審查批件號(hào)：2017HL-066-01），課題組對招募的志愿者進(jìn)行了包括苦味敏感度等在內(nèi)的嚴(yán)格篩選[7-8]，并且遵照參與苦度評(píng)價(jià)志愿者不低于20名的原則，最終選擇22名健康志愿者（男7名、女15名）作為受試者，并在試驗(yàn)前簽訂知情同意書。

2.2 評(píng)價(jià)方法

將樣品按照濃度由低到高的順序進(jìn)行編號(hào)并置于口嘗紙杯中，并在樣品序列中隨機(jī)加入一個(gè)陰性樣品（純化水），然后志愿者按編號(hào)順序?qū)悠泛诳谥校?jì)時(shí)15 s，此間口腔做漱口動(dòng)作，使舌根和舌側(cè)的苦味感受區(qū)能夠充分感受藥物是否具有苦味，將結(jié)果填入“藥物苦味評(píng)價(jià)表”中，然后吐出樣品，漱口5次，至口腔內(nèi)無苦味，1～2 min后測定下一個(gè)樣品[9-10]。

2.3 基于BTC的EMB

采用“最小極限法”[11]測定37 ℃下參比苦味物質(zhì)和其他各苦味中藥飲片的BTC，即半數(shù)志愿者嘗到苦味的最低質(zhì)量濃度。以鹽酸小檗堿為參比苦味物質(zhì)，在鹽酸小檗堿的BTC下，其分子苦度MBr定為1，則其他苦味中藥飲片的EMBs＝r/s×MBr。其中r表示鹽酸小檗堿的BTC；s表示未知中藥飲片的BTC。對其取自然對數(shù)，稱為“分子苦度當(dāng)量指數(shù)”（EMB-index，EMBI）。

表1 中藥飲片信息

Table 1 Information of Chinese herbal pieces

名稱基原苦味程度 黃連毛茛科黃連屬植物黃連Coptischinensis Franch.的干燥根莖氣微，味極苦 延胡索罌粟科延胡索屬植物延胡索Corydalisyanhusuo W. T. Wang的干燥塊莖氣微，味苦 蓮子心睡蓮科蓮屬植物蓮Nelumbonucifera Gaertn.的成熟種子中的干燥幼葉及胚根氣微，味苦 龍膽龍膽科龍膽屬植物龍膽Gentianascabra Bge.的干燥根及根莖氣微，味甚苦 黃柏蕓香科黃柏屬植物黃皮樹Phellodendronchinense Schneid.的干燥樹皮氣微，味極苦 穿心蓮爵床科穿心蓮屬植物穿心蓮Andrographispaniculata (Burm. f.) Nees的干燥地上部分氣微，味極苦 苦參豆科槐屬植物苦參Sophoraflavescens Ait.的干燥根氣微，味極苦 防己防己科千金藤屬植物粉防己Stephaniatetrandra S. Moore的干燥根氣微，味苦 胡黃連玄參科胡黃連屬植物胡黃連Picrorhizascrophulariiflora Pennell的干燥根莖氣微，味極苦 青風(fēng)藤防己科防己屬植物青藤Sinomeniumacutum (Thunb.) Rehd. et Wils.的干燥藤莖氣微，味苦 連翹木犀科連翹屬植物連翹Forsythiasuspensa (Thunb.) Vahl的干燥果實(shí)氣微香，味苦 金銀花忍冬科忍冬屬植物忍冬Lonicerajaponica Thunb.的干燥花蕾或帶初開的花氣清香，味淡、微苦 冬凌草唇形科香茶菜屬植物碎米椏Rabdosiarubescens (Hemsl.) Hara的干燥地上部分氣微香，味苦、甘 枳殼蕓香科柑橘屬植物酸橙Citrusaurantium L.及其栽培變種的干燥未成熟果實(shí)氣清香，味苦、微酸 益母草唇形科益母草屬植物益母草Leonurusjaponicus Houtt.的新鮮或干燥地上部分氣微，味微苦 佛手蕓香科柑桔屬植物佛手Citrusmedica L. var. sarcodactylis Swingle的干燥果實(shí)氣香，味微甜后苦 橘核蕓香科柑橘屬植物橘Citrusreticulata Blanco及其栽培變種的干燥成熟種子氣微，味苦。 牛蒡子菊科牛蒡?qū)僦参锱］駻rctiumlappa L.的干燥成熟果實(shí)氣微，味苦后微辛而稍麻舌 椿皮苦木科臭椿屬植物臭椿Ailanthusaltissima (Mill.) Swingle的干燥根皮或干皮氣微，味苦 野菊花菊科菊屬植物野菊Chrysanthemumindicum L.的干燥頭狀花序氣芳香，味苦 青皮蕓香科柑橘屬植物橘及其栽培變種的干燥幼果或未成熟果實(shí)的果皮氣香，味苦、辛 化橘紅蕓香科柑橘屬植物柚Citrusgrandis (L.) Osbeck的未成熟或近成熟的干燥外層果皮氣芳香，味苦、微辛 續(xù)斷川續(xù)斷科川續(xù)斷屬植物川續(xù)斷Dipsacusasper Wall. ex Henry的干燥根氣微香，味苦、微甜而后澀

2.4 樣品配制

苦味中藥水煎液的制備：取藥材飲片，按《中國藥典》2020年版規(guī)定用量范圍的平均值（如黃柏用量為6～9 g[12]，則取7.5 g）的10倍用量制備樣品[13]，將其置于適宜容器內(nèi)加水2000 mL，浸泡30 min，于電磁爐上加熱（功率2100 W），待沸騰后，功率改為600 W，煎煮20 min，濾過，二煎加水2000 mL，沸騰后煎煮10 min，余同一煎，合并濾液，混勻，冷卻至室溫，4000 r/min離心（離心半徑為11.6 cm）15 min，取上清液，定容至4000 mL，灌裝，壓蓋，滅菌，備用。

（1）黃連水煎液：取黃連35 g，按照上述方法制備水煎液，并分別稀釋為原液0.050%、0.075%、0.100%、0.150%、0.200%、0.300%、0.400%的溶液。

（2）延胡索水煎液：取延胡索65 g，按照上述方法制備水煎液，并分別稀釋為原液4.690%、6.250%、9.380%、12.500%、18.750%、25.000%的溶液。

（3）胡黃連水煎液：取胡黃連65 g，按照上述方法制備水煎液，并分別稀釋為原液0.938%、1.250%、1.875%、2.500%、3.750%、5.000%、7.500%的溶液。

（4）青風(fēng)藤水煎液：取青風(fēng)藤90 g，按照上述方法制備水煎液，并分別稀釋為原液2.500%、3.750%、5.000%、7.500%、10.000%、15.000%、20.000%的溶液。

（5）連翹水煎液：取連翹105 g，按照上述方法制備水煎液，并分別稀釋為原液9.375%、12.500%、18.750%、25.000%、37.500%、50.000%、75.000%的溶液。

（6）金銀花水煎液：取金銀花105 g，按照上述方法制備水煎液，并分別稀釋為原液9.375%、12.500%、18.750%、25.000%、37.500%、50.000%、75.000%的溶液。

（7）冬凌草水煎液：取冬凌草450 g，按照上述方法制備水煎液，并分別稀釋為原液1.125%、1.500%、2.250%、3.000%、4.500%、6.000%、9.000%的溶液。

（8）枳殼水煎液：取枳殼65 g，按照上述方法制備水煎液，并分別稀釋為原液2.250%、3.000%、4.500%、6.000%、9.000%、12.000%、18.000%的溶液。

（9）益母草水煎液：取益母草195 g，按照上述方法制備水煎液，并分別稀釋為原液5.000%、7.500%、10.000%、15.000%、20.000%、30.000%、40.000%的溶液。

（10）佛手水煎液：取佛手65 g，按照上述方法制備水煎液，并分別稀釋為原液4.500%、6.000%、9.000%、12.000%、18.000%、24.000%、36.000%的溶液。

（11）橘核水煎液：取橘核60 g，按照上述方法制備水煎液，并分別稀釋為原液1.250%、1.500%、2.250%、3.000%、4.500%、6.000%、9.000%的溶液。

（12）牛蒡子水煎液：取牛蒡子90 g，按照上述方法制備水煎液，并分別稀釋為原液2.250%、3.130%、4.500%、6.250%、9.000%、12.500%、18.000%的溶液。

（13）椿皮水煎液：取椿皮75 g，按照上述方法制備水煎液，并分別稀釋為原液4.500%、6.500%、9.000%、13.000%、18.000%、26.000%、36.000%的溶液。

（14）野菊花水煎液：取野菊花120 g，按照上述方法制備水煎液，并分別稀釋為原液0.563%、0.750%、1.150%、1.500%、2.250%、3.000%、4.500%的溶液。

（15）化橘紅水煎液：取化橘紅45 g，按照上述方法制備水煎液，并分別稀釋為原液4.500%、6.000%、9.000%、12.000%、18.000%、24.000%、36.000%的溶液。

（16）青皮水煎液：取青皮65 g，按照上述方法制備水煎液，并分別稀釋為原液4.500%、6.500%、9.000%、13.000%、18.000%、26.000%、36.000%的溶液。

（17）續(xù)斷水煎液：取續(xù)斷120 g，按照上述方法制備水煎液，并分別稀釋為原液4.500%、6.500%、9.000%、13.000%、18.000%、26.000%、36.000%的溶液。

（18）蓮子心水煎液：取蓮子心35 g，按照上述方法制備水煎液，并分別稀釋為原液1.125%、1.500%、2.250%、3.000%、4.500%、6.000%、9.000%的溶液。

（19）龍膽水煎液：取龍膽45 g，按照上述方法制備水煎液，并分別稀釋為原液0.563%、0.750%、1.125%、1.500%、2.250%、3.000%、4.500%的溶液。

（20）黃柏水煎液：取黃柏75 g，按照上述方法制備水煎液，并分別稀釋為原液0.075%、0.100%、0.150%、0.200%、0.300%、0.400%、0.600%的溶液。

（21）穿心蓮水煎液：取穿心蓮75 g，按照上述方法制備水煎液，并分別稀釋為原液0.300%、0.400%、0.600%、0.800%、1.200%、1.600%、2.400%的溶液。

（22）苦參水煎液：取苦參67.5 g，按照上述方法制備水煎液，并分別稀釋為原液0.563%、0.750%、1.125%、1.500%、2.250%、3.000%、4.500%的溶液。

（23）防己水煎液：取防己75 g，按照上述方法制備水煎液，并分別稀釋為原液0.150%、0.200%、0.300%、0.400%、0.600%、0.800%、1.200%的溶液。

2.5 離群值的剔除

對所有評(píng)價(jià)員的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，當(dāng)評(píng)價(jià)員對陰性樣品的評(píng)價(jià)分值為“1”，或者違反韋伯-費(fèi)希納定律[14]：刺激量與刺激強(qiáng)度成正比的規(guī)律，則剔除該評(píng)價(jià)員對該組樣品的評(píng)價(jià)結(jié)果。

2.6 “苦度軸”的建立

根據(jù)所得結(jié)果，分別建立中藥EMB軸和中藥EMBI軸，以更加直觀地掌握不同中藥的EMB的相對大小。

2.7 方法學(xué)驗(yàn)證

分別取黃連、苦參飲片，按照“2.4”項(xiàng)中方法制備成供試品溶液，分別在第1、2、3天，由不同的口嘗評(píng)價(jià)員按照“2.2”項(xiàng)中方法進(jìn)行評(píng)價(jià)，分別計(jì)算3次測試得的黃連和苦參的EMB以及EMBI的RSD值。

3 結(jié)果

3.1 23種中藥飲片的EMB和EMBI

對上述23種苦味中藥飲片水煎液的口嘗評(píng)價(jià)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表明，感知到苦味的人數(shù)比例與23種苦味中藥飲片水煎液質(zhì)量濃度的對數(shù)呈正相關(guān)關(guān)系，與韋伯-費(fèi)希納定律一致[15-16]。因此，分別對23種中藥飲片水煎液感知到苦味的人數(shù)比例為0～100%對不同質(zhì)量濃度（）下感知苦味的人數(shù)比例（0）分別做威布爾曲線和對數(shù)曲線，二者關(guān)系式如式（1）、（2）。采用“規(guī)劃求解”建立威布爾曲線和Excel建立對數(shù)曲線，23種中藥飲片水煎液與0（在0～100%）之間的擬合方程見表2。

0＝1()＝[1－e?(C－)/k] （1）

0＝1()＝ln＋（2）

表示質(zhì)量濃度，、、、、、為待定參數(shù)，0代表感知到苦味的人數(shù)比例，是樣品質(zhì)量濃度個(gè)數(shù)

表2 23種中藥飲片水煎液不同的質(zhì)量濃度C與感知到苦味的人數(shù)比例P0的擬合方程

Table 2 Fitting equation between different concentrations (C) of 23 kinds of bitter Chinese herbal pieces decoction and proportion (P0) of people who felt bitter

苦味中藥n威布爾曲線對數(shù)曲線 黃連6P0＝5.38 [1－e?(C－0.004)0.45/0.81]，R2＝0.945 0，P＜0.01P0＝0.53 lnC＋3.01，R2＝0.942 2，P＜0.01 延胡索5P0＝1.02 [1－e?(C－0.76)0.49/0.74]，R2＝1.000 0，P＜0.01P0＝0.49 lnC＋0.33，R2＝0.857 8，P＜0.05 蓮子心5P0＝1.10 [1－e?(C－0.09)0.69/0.21]，R2＝0.976 0，P＜0.01P0＝0.59 lnC＋1.59，R2＝0.925 4，P＜0.01 龍膽6P0＝0.97 [1－e?(C－0.04)1.57/0.02]，R2＝0.967 2，P＜0.01P0＝0.54 lnC＋1.67，R2＝0.917 2，P＜0.01 黃柏7P0＝0.99 [1－e?(C－0.01)1.22/0.01]，R2＝0.993 0，P＜0.01P0＝0.48 lnC＋2.13，R2＝0.969 3，P＜0.01 穿心蓮6P0＝0.99 [1－e?(C－0.004)3.58/0.000 3]，R2＝0.991 5，P＜0.01P0＝0.61 lnC＋1.88，R2＝0.900 4，P＜0.01 苦參7P0＝1.05 [1－e?(C－0.09)0.64/0.26]，R2＝0.995 3，P＜0.01P0＝0.41 lnC＋1.21，R2＝0.921 4，P＜0.01 防己6P0＝0.94 [1－e?(C－0.03)1.07/0.04]，R2＝0.996 4，P＜0.01P0＝0.46 lnC＋1.68，R2＝0.981 5，P＜0.01 胡黃連5P0＝0.98 [1－e?(C－0.15)2.19/0.008]，R2＝0.997 1，P＜0.01P0＝0.78 lnC＋1.54，R2＝0.870 9，P＜0.05 青風(fēng)藤5P0＝1.08 [1－e?(C－0.55)0.79/0.54]，R2＝0.998 5，P＜0.01P0＝0.68 lnC＋0.56，R2＝0.921 5，P＜0.01 連翹6P0＝0.98 [1－e?(C－1.69)2.01/11.87]，R2＝0.998 7，P＜0.01P0＝0.61 lnC－0.46，R2＝0.937 0，P＜0.01 金銀花6P0＝0.99 [1－e?C2.10/25.64]，R2＝0.990 1，P＜0.01P0＝0.49 lnC－0.16，R2＝0.934 3，P＜0.01 冬凌草6P0＝1.10 [1－e?(C－1.23)1.05/2.26]，R2＝0.995 0，P＜0.01P0＝0.62 lnC－0.11，R2＝0.985 1，P＜0.01 枳殼7P0＝1.01 [1－e?(C－0.36)0.80/0.42]，R2＝0.985 7，P＜0.01P0＝0.44 lnC＋0.68，R2＝0.851 9，P＜0.01 益母草4P0＝2 338.46 [1－e?(C－3.53)0.88/12 866.82]，R2＝0.989 6，P＜0.01P0＝0.88 lnC－1.13，R2＝0.931 8，P＜0.01 佛手6P0＝1.01 [1－e?(C－0.47)1.90/2.47]，R2＝0.994 7，P＜0.01P0＝0.63 lnC＋0.16，R2＝0.981 7，P＜0.01 橘核5P0＝1.00 [1－e?(C－0.15)1.67/0.07]，R2＝1.000 0，P＜0.01P0＝0.74 lnC＋1.32，R2＝0.948 3，P＜0.01 牛蒡子4P0＝3 362.87 [1－e?(C－0.001)1.13/4 914.98]，R2＝0.993 6，P＜0.01P0＝0.67 lnC＋0.73，R2＝0.962 7，P＜0.01 椿皮7P0＝0.99 [1－e?(C－0.79)1.95/3.91]，R2＝0.999 2，P＜0.01P0＝0.56 lnC＋0.01，R2＝0.956 0，P＜0.01 野菊花6P0＝0.98 [1－e?(C－0.03)2.27/0.07]，R2＝0.996 4，P＜0.01P0＝0.54 lnC＋1.15，R2＝0.943 4，P＜0.01 青皮5P0＝1.01 [1－e?(C－0.73)1.06/0.61]，R2＝0.998 2，P＜0.01P0＝0.72 lnC＋0.32，R2＝0.945 9，P＜0.01 化橘紅6P0＝0.99 [1－e?(C－0.50)0.82/0.32]，R2＝0.997 3，P＜0.01P0＝0.51 lnC＋0.63，R2＝0.791 5，P＜0.05 續(xù)斷5P0＝1.00 [1－e?(C－1.35)3.21/1.42]，R2＝0.998 2，P＜0.01P0＝0.84 lnC－0.25，R2＝0.853 7，P＜0.05

由上述擬合方程的2可知，23種中藥飲片的威布爾模型均優(yōu)于對數(shù)模型，因此采用威布爾模型建立23種中藥飲片不同質(zhì)量濃度下感知到苦味的人數(shù)比例0模型，結(jié)果如圖1所示。由課題組前期研究結(jié)果可知[6]，鹽酸小檗堿的BTC為4.148 mg/L，計(jì)算各中藥飲片的EMB和EMBI，結(jié)果見表3。

3.2 苦度軸

按照“3.1”項(xiàng)中結(jié)果，建立的2類苦度軸如圖2所示。

3.3 方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果

按照“3.1”項(xiàng)中的方法，分別計(jì)算出第1、2、3天測得的黃連和苦參的EMB和EMBI值，3次試驗(yàn)測得的黃連的EMB和EMBI的RSD分別值為19%、4%，3次試驗(yàn)測得的苦參的EMB和EMBI的RSD值分別為13%、11%。

4 討論

4.1 參比苦味物質(zhì)的選擇

在進(jìn)行藥物苦味評(píng)價(jià)時(shí)，一般選擇奎寧作為參比苦味物質(zhì)，但因其相對不易得、有一定毒性等原因，本研究選擇苦味純正，毒副作用小，且價(jià)廉易得的鹽酸小檗堿作為參比苦味物質(zhì)，比奎寧更具有可比性和代表性。

圖1 23種中藥飲片不同質(zhì)量濃度水煎液與感知到苦味的人數(shù)比例威布爾圖

4.2 苦味中藥飲片的選擇

對苦味中藥飲片的選擇，從《中國藥典》2020年版[12]中選擇了各飲片“性狀”項(xiàng)下描述為“味淡”“味微苦”“味苦”“味極苦”和“味甚苦”的5類中藥飲片按照本研究所述的樣品制備方法制備，經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)，描述為“味淡”的飲片制備的樣品基于THTPM方法均嘗不到苦味。因此，最終選擇的載體，從描述為“味微苦”“味苦”“味極苦”和“味甚苦”且無毒的飲片中選擇，其中龍膽屬于味甚苦的范疇，黃連、黃柏、穿心蓮、苦參、胡黃連屬于味極苦的范疇，延胡索、蓮子心、防己、青風(fēng)藤、連翹、冬凌草、枳殼、佛手、橘核、牛蒡子、椿皮、野菊花、青皮、化橘紅、續(xù)斷屬于味苦的范疇，金銀花、益母草屬于味微苦的范疇。

表3 23種苦味中藥BTC、EMB、EMBI值

Table 3 BTC, EMB and EMBI of 23 kinds of bitter Chinese herbal pieces

中藥BTC/(g?L?1)EMBEMBI中藥BTC/(g?L?1)EMBEMBI中藥BTC/(g?L?1)EMBEMBI 黃連0.008 00.520 7?0.652 6野菊花0.296 80.014 0?4.270 4佛手1.783 50.002 3?6.063 7 黃柏0.032 10.129 3?2.045 9橘核0.317 50.013 1?4.337 9續(xù)斷2.344 90.001 8?6.337 4 防己0.073 40.056 6?2.872 6枳殼0.567 80.007 3?4.919 1椿皮2.468 20.001 7?6.388 6 穿心蓮0.105 20.039 4?3.233 2化橘紅0.662 90.006 3?5.074 0冬凌草2.584 70.001 6?6.434 7 龍膽0.107 60.038 6?3.255 8牛蒡子0.757 90.005 5?5.207 9金銀花3.965 10.001 0?6.862 7 蓮子心0.141 60.029 3?3.530 4青風(fēng)藤0.808 90.005 1?5.273 0連翹4.587 80.000 9?7.008 5 苦參0.155 20.026 7?3.622 1延胡索1.002 20.004 1?5.487 3益母草6.691 60.000 6?7.386 0 胡黃連0.248 40.016 7?4.092 4青皮1.165 90.003 6?5.638 6

圖2 中藥的苦度軸

4.3 中藥飲片的EMB與《中國藥典》“性狀”描述的差異

從EMB軸上可以直觀的看出23種苦味中藥飲片的EMB高低順序，部分飲片測得的EMB與藥典“性狀”項(xiàng)下的描述不符，如“味甚苦”的龍膽EMB小于“味極苦”的黃連、黃柏、穿心蓮，以及“味苦”的防己；“味極苦”的苦參、胡黃連EMB小于“味苦”的防己、蓮子心，這主要是因?yàn)棰傺芯繉ο蟛煌?，本?shí)驗(yàn)的研究對象為中藥水煎液，而藥典性狀項(xiàng)下的味道描述對象為飲片本身，中藥飲片在水煎煮的過程中會(huì)發(fā)生一系列的化學(xué)反應(yīng)，伴隨著部分化學(xué)成分的分解以及新的化學(xué)成分的生成，因此苦味也會(huì)發(fā)生變化；②適用范圍不同，本研究所提出的方法適用于低濃度苦味中藥飲片水煎藥的苦度預(yù)測，而藥典描述的苦味是通過口腔咀嚼等方式直接品嘗，是局部高濃度測得的結(jié)果。

4.4 方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果

由于本實(shí)驗(yàn)研究的載體均為低質(zhì)量濃度的中藥飲片水煎液，其苦味處于有與無之間，且受試者為存在個(gè)體差異的人類，不同的受試者味覺靈敏度不同，因此3次測得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)會(huì)存在差異，但由“3.3”項(xiàng)中結(jié)果可知，黃連重現(xiàn)性考察結(jié)果的RSD值均小于20%，苦參重現(xiàn)性考察結(jié)果的RSD值均小于15%，表明本研究的試驗(yàn)方法重現(xiàn)性相對較好。

4.5 中藥飲片的EMB與其所含主要單體成分MB的差異

中藥飲片化學(xué)成分復(fù)雜多樣，但每種飲片都會(huì)有一種或者幾種特征性成分，有的是該中藥飲片中含量較高的成分，有的是該飲片藥效的主要物質(zhì)基礎(chǔ)[17-18]，那么，能否通過預(yù)測苦味單體的MB來預(yù)測以該單體為主要成分的飲片的EMB，或者通過預(yù)測飲片的EMB預(yù)測其主要化學(xué)成分的MB。

結(jié)合課題組前期測得的苦味單體的MB與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，按照苦度由強(qiáng)到弱的順序?yàn)辄S連＞穿心蓮＞龍膽＞苦參＞枳殼＞化橘紅＞青風(fēng)藤＞延胡索＞益母草，而作為主要化學(xué)成分的苦味單體的苦味強(qiáng)度：氧化苦參堿＞鹽酸小檗堿＞龍膽苦苷＞鹽酸青藤堿＞柚皮苷＞益母草堿＞苦參堿＞穿心蓮內(nèi)酯＞延胡索乙素。同時(shí)，在預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，青皮的水煎液存在苦味，但作為其主要成分的橙皮苷在水中溶解度小[19]，其飽和水溶液經(jīng)評(píng)價(jià)員評(píng)價(jià)仍感知不到苦味。此外，對于主要成分為梔子苷和京尼平苷的梔子而言[20]，按本研究的中藥飲片水煎液制備方法，梔子飲片水煎液的原液經(jīng)評(píng)價(jià)員評(píng)價(jià)感知不到苦味，而梔子苷和京尼平苷水溶液卻存在苦味。由于中藥飲片水煎液的味道為多種成分的復(fù)合味道，可能存在味道的協(xié)同和拮抗[16]，因此，不能通過中藥飲片的EMB直接預(yù)測其主要含有的化學(xué)成分的MB，反之，亦不可行。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Study on quantitative method of equivalent molecular bitterness of traditional Chinese medicines based on bitterness threshold concentration

WANG Qing-xiao1, GAO Xiao-jie2, GUI Xin-jing3, 4, 5, WANG Yan-li3, 4, 5, WANG Jun-ming4, LI Chen-xu4, REN Yan-na4, YAO Jing3, 4, 5, ZHANG Lu3, 4, 5, SHI Jun-han3, 4, 5, LI Xue-lin3, 4, 5, LIU Rui-xin3, 4, 5

1. Henan Institute for Food and Drug Control, Zhengzhou 450008, China 2. Department of Pharmaceutical Preparation, Traditional Chinese Medicine Hospital of Zhengzhou, Zhengzhou 450007, China 3. Department of Pharmacy, the First Affiliated Hospital of Henan University of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou 450000, China 4. Henan University of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou 450046, China 5. Collaborative Innovation Center of Chinese Medicine for Respiratory Diseases Co-construction by Henan Province & Ministry of Education,, Henan University of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou 450046, China

To establish a quantitative method for bitterness intensity of bitter traditional Chinese medicines.With the application of traditional human taste panel method (THTPM), the decoction of 23 kinds of bitter Chinese herbal pieces of different concentrations was used as the research subject and the “minimum limit method” was employed to predict the bitterness threshold concentration (BTC) of Chinese herbal pieces using berberine hydrochloride as the reference bitter substance. Based on this, the “equivalent molecular bitterness” (EMB) and molecular bitterness equivalent index (EMB-index, EMBI) of bitter Chinese medicine were calculated, so as to realize the quantitative determination of bitterness of Chinese medicinal slices. In addition, different concentrations of Huanglian () and Kushen () decoction were used as carriers to verify the reproducibility of the established method.The logarithmic model and Weibull model of the proportion of the number of people who perceived bitter taste and the concentration of the decoction of bitter Chinese herbal pieces were established. From the2andvalue of the fitting equation, it can be seen that the Weibull model was better than the logarithmic model. The BTC of Chinese herbal pieces was calculated through the fitting equation yield by Weibull model, and then the EMB and EMBI of 23 kinds of bitter Chinese herbal pieces were measured; Methodological validation results showed that the RSD values of EMB and EMBI ofandwere less than 20%, and the reproducibility was relatively well.The EMB and EMBI of 23 kinds of Chinese herbal pieces was predicted through THTPM, and a quantitative determination method for the bitterness intensity of bitter traditional Chinese medicines has been established.

bitter traditional Chinese medicines; traditional human taste panel method; bitterness threshold concentration; equivalent molecular bitterness;;

R283.6

A

0253 - 2670(2022)21 - 6698 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.21.006

2022-05-11

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81774452）；國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81001646）；2017年國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃中醫(yī)藥現(xiàn)代化重點(diǎn)專項(xiàng)（2017YFC1703402）；河南省中醫(yī)藥拔尖人才培養(yǎng)項(xiàng)目資助（2019ZYBJ07）；河南省高層次人才特殊支持“中原千人計(jì)劃”——“中原青年拔尖人才”項(xiàng)目（ZYQR201912158）

王青曉，碩士，副主任藥師，從事中藥檢驗(yàn)、分析與質(zhì)控研究。Tel: (0371)63388285 E-mail: wangqingxiao@126.com

劉瑞新，博士，主任藥師，從事中藥飲片臨床應(yīng)用現(xiàn)代化關(guān)鍵技術(shù)研究。Tel: (0371)66233562 E-mail: liuruixin7@163.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]