基于SERS技術(shù)對水產(chǎn)中硝基呋喃檢測的基底研究

⊙ 文 曾波明 曾莉 撫州幼兒師范高等專科學(xué)校

近年來食品中的違規(guī)添加現(xiàn)象層出不窮，水產(chǎn)養(yǎng)殖中的硝基呋喃類抗生素就是其中的一種。硝基呋喃是一種抗生素，被用作動物的生長促進(jìn)劑，還多用于預(yù)防和治療大腸桿菌、沙門氏菌等引起的胃腸道感染。但由于硝基呋喃類藥物及其代謝物對人體有致癌、致畸胎等副作用，原中國衛(wèi)生部將其列入違法添加的非食用物質(zhì)黑名單。

盡管各國已經(jīng)明確禁止使用硝基呋喃類抗生素，但許多養(yǎng)殖者受利益的驅(qū)使，仍然違禁使用此類藥物用于治療水生生物疾病。由于硝基呋喃類抗生素半衰期非常短，在生物的體內(nèi)代謝快，這為此類藥物的檢測帶來了巨大的困難，所以硝基呋喃類檢測技術(shù)的研究重點放在了不要衍生化步驟下實現(xiàn)準(zhǔn)確測定。因此，研究和開發(fā)一種集萃取、富集、分離和檢測一體的快速檢測技術(shù)是未來硝基呋喃類藥物檢測的發(fā)展方向。

表面增強拉曼散射（Surface Enhanced Raman Scattering，下稱 SERS）技術(shù)是一種振動光譜分析技術(shù)。SERS的產(chǎn)生在大多數(shù)情況下必須依賴貴金屬（通常是Au、Ag、Cu等），以納米材料作為信號增強基底。SERS不僅分析速度快（幾秒到幾分鐘），而且靈敏度可達(dá)到單分子水平。與紅外光譜相比，SERS不僅遠(yuǎn)超其靈敏度，幾乎不存在水分子光譜干擾，而且同樣可提供分子指紋信息，可用于物質(zhì)定性分析。不僅如此，SERS光譜半峰寬僅為1nm左右，可以對多種物質(zhì)同時進(jìn)行定性和定量分析而不發(fā)生相互干擾。尤為重要的是，拉曼儀器是當(dāng)前少有的幾種可以實現(xiàn)便攜而幾乎不損失分析性能的光譜分析儀器之一。這些優(yōu)點奠定了SERS技術(shù)作為一種適合痕量及超痕量定性和定量分析方法的基礎(chǔ)?，F(xiàn)在，SERS技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生命醫(yī)學(xué)、環(huán)境監(jiān)測、食品安全，乃至國家安全等領(lǐng)域。鑒于Raman和SERS光譜可提供分子指紋信息，能進(jìn)行原位表征，其非常適合用于呋喃類抗生素指紋檢測，因而開發(fā)穩(wěn)定、高效的基底是SERS技術(shù)發(fā)揮出其效應(yīng)的基礎(chǔ)。本文使用溴化鉀修飾銀納米粒子作為SERS檢測技術(shù)的基底，用SERS方法獲得了不同濃度下呋喃唑酮標(biāo)準(zhǔn)液的光譜，發(fā)現(xiàn)其檢出限可達(dá)到1ppb，檢測靈敏度良好。

一、硝基呋喃檢測方法和SERS基底合成

由于抗生素屢禁不止，全世界各地在呋喃類抗生素檢測方面已有不少研究。目前對硝基呋喃類抗生素的檢測方法主要分為色譜法（包括高相液相色譜-紫外、高效液相-熒光、高效液相-二極管陣列、液相色譜-電化學(xué)檢測器）、分光光度法、酶免疫色譜法、液相色譜-質(zhì)譜法等。

在目前所有的基底中，SERS的研究者普遍認(rèn)為，金、銀溶膠的穩(wěn)定性與SERS效果較之其他種類的納米材料更為理想，制備方法也更為簡單。目前，人們已經(jīng)可以根據(jù)實驗?zāi)康膶鸺{米粒子的形貌、尺寸、聚集度等因素進(jìn)行調(diào)控，其中核殼結(jié)構(gòu)、分子組裝技術(shù)成為研究的熱點。

二、實驗材料及過程

（1）實驗主要試劑：呋喃唑酮、呋喃妥因、呋喃西林、乙腈、去離子水、檸檬酸鈉、溴化鉀等。（2）實驗主要儀器：拉曼光譜儀（Pixis-100BR CCD，Acton SP-2500ispectrograph），實驗條件：激發(fā)波長，632.8nm；物鏡，20倍；紫外可見光譜儀（UV-Vis sp-756）；超純水機(jī)Nanopure，Thermo；離心機(jī)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（Shen Shun technology R-501）；電子天平（梅特勒-托利多 AL204）；水平振蕩器；加熱盤（IKA RCT basic）；三頻恒溫數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器，KQ-300GVDV）。

本實驗主要通過用檸檬酸鈉還原硝酸銀獲得銀納米顆粒，下面簡要闡述其制備過程。首先將50mL AgNO（1mM）溶液在快速攪拌下加熱至沸騰，然后快速加入1mL配置好的1%檸檬酸鈉水溶液。在此基礎(chǔ)上，將得到的混合物繼續(xù)快速攪拌煮沸1h。停止加熱但仍然保持快速攪拌直至溶液冷卻至室溫，此時得到的黃綠色液體即為本實驗需要的Ag NPs，其紫外吸收光譜和透射電鏡的表征如圖1所示。

圖1 ：Ag NPs的紫外吸收光譜圖（左）和透射電鏡圖（右）

為了制備Ag-BrNPs，首先需要將1mL上述制備獲得的Ag NPs在10000rpm條件下離心10min，然后除去上清液。此時，離心管中剩下的液體大約為10-20μL，將其渦旋震蕩1min從而使?jié)饪s后的Ag NPs溶膠更均勻。最后向離心管中滴加15μL的10mM溴化鉀水溶液，渦旋震蕩1min備用。

準(zhǔn)確稱取呋喃妥因、呋喃西林和呋喃唑酮標(biāo)準(zhǔn)品各0.01g，分別用10mL乙腈溶解，得到質(zhì)量濃度為1000ppm（μg/L）的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，在常溫下避光密封保存。將此標(biāo)準(zhǔn)儲備液用乙腈逐級稀釋成質(zhì)量濃度分別為100、50、10、5、1、0.5、0.1、0.01、0.001ppm（μg/L）等濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在常溫下避光密封保存。

（1）優(yōu)化鹵素離子種類。分別取1mL檸檬酸鈉還原制備的1mM的Ag NPs，離心去除上清液后向里面添加15μL 10mM KI（碘化鉀）、KCL（氯化鉀）和KBr（溴化鉀），渦旋震蕩1min后取5μL滴加在玻璃片上，然后在相同位置上馬上分別滴加5μL 1ppm呋喃唑酮。取1mL檸檬酸鈉還原制備的1mM的Ag NPs，離心去除上清液后渦旋震蕩1min，取5μL滴加在玻璃片上，然后在相同位置馬上分別滴加5μL 1ppm呋喃唑酮。結(jié)果顯示，用KBr修飾銀納米粒子對呋喃唑酮的SERS響應(yīng)最好，如圖2所示。

圖2 ：不同鹵素離子修飾Ag NPs對呋喃唑酮的SERS譜圖

（2）優(yōu)化KBr的量。分別取1mL檸檬酸鈉還原制備的1mM的Ag NPs，離心去除上清液后向里面添加5、10、15、20、25、30、40、50、80μL 10mM KBr，渦旋震蕩1min后取5μL滴加在玻璃片上，然后在相同位置馬上分別滴加5μL 1ppm呋喃唑酮。結(jié)果顯示，當(dāng)用15μL 10mM KBr修飾Ag NPs對呋喃唑酮的SERS響應(yīng)最好（如圖3所示），因此，15μL 10mM KBr為最佳KBr的量。

圖3 ：不同量KBr修飾Ag NPs對呋喃唑酮的SERS譜圖（左）及其在1357cm-1處的SERS信號強度對比圖（右）

（3）優(yōu)化反應(yīng)時間。分別取1mL檸檬酸鈉還原制備的1mM的Ag NPs，離心去除上清液后向里面添加15μL 10mM Kbr，渦旋震蕩1min后分別放置0、5、10、20、30、60min后取5μL滴加在玻璃片上，然后在相同位置馬上分別滴加5μL 1ppm 呋喃唑酮。結(jié)果顯示，反應(yīng)時間在1h內(nèi)，Ag-BrNPs對呋喃唑酮SERS響應(yīng)都比較好，如圖4所示。

圖4 ：KBr修飾Ag NPs在不同反應(yīng)時間對呋喃唑酮的SERS譜圖對比圖

（1）拉曼檢測條件。633nm激光器、激光功率40μw、積分時間10s*5次、光柵1200line、中心線1300、物鏡50×鏡頭。

（2）SERS檢測方法。分別取上述制備好的1mL檸檬酸鈉還原制備的Ag NPs，按照上述步驟離心去除上清液后向里面添加15μL 10mM KBr，渦旋震蕩1min后取5μL滴加在干凈玻璃片上，然后在相同位置馬上分別滴加5μL不同濃度的呋喃唑酮乙腈溶液。等溶劑揮發(fā)后，進(jìn)行拉曼檢測。呋喃唑酮的SERS光譜圖如圖5所示。

圖5 ：呋喃唑酮的SERS譜圖

根據(jù)文獻(xiàn)，SERS的主要峰出現(xiàn)在971、1416和1609cm處，這歸因于環(huán)C-OC-C拉伸振動模式。1245cm處的峰歸屬于苯環(huán)內(nèi)CH彎曲振動模式，1357和1570cm處的峰歸因于-NO的對稱拉伸振動模式。

（3）SERS方法對呋喃唑酮的檢出限。用SERS方法獲得了不同濃度呋喃唑酮標(biāo)準(zhǔn)液的光譜，發(fā)現(xiàn)其檢出限可達(dá)到1ppb，遠(yuǎn)低于文獻(xiàn)報道（0.1μg/g或者0.1ppm），如圖6。

圖6 ：呋喃唑酮在不同濃度的SERS譜圖

三、結(jié)論

現(xiàn)在SERS技術(shù)對痕量硝基呋喃的檢測日趨成熟，高效快捷的檢測有賴于合適的高效基底。因此，如何在實驗室快速制備廉價、合適、易組裝的基底，是SERS技術(shù)在水產(chǎn)檢測中發(fā)揮出應(yīng)用效應(yīng)的核心。