海南天然飼草青貯飼料中乳酸菌分離鑒定及優(yōu)良菌株篩選

劉 悅， 字學(xué)娟*, 陳 婷， 孫 蓉， 李 茂， 湯 凱

(1. 海南大學(xué)林學(xué)院， 海南 儋州 571737; 2. 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所， 海南 儋州 571737； 3. 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院湛江試驗(yàn)站， 海南 湛江 524000； 4.海南大學(xué)食品學(xué)院， 海南 ?？?570228)

微生物活動(dòng)是青貯發(fā)酵的本質(zhì)，原料表面附著微生物多樣性、菌種的生理生化特性以及外界環(huán)境等因素均能影響青貯發(fā)酵品質(zhì)[1]。因此，調(diào)控微生物群落結(jié)構(gòu)是保證青貯發(fā)酵品質(zhì)的重要舉措之一。一般來說，乳酸菌作為優(yōu)勢(shì)菌群的青貯發(fā)酵容易成功，通過產(chǎn)生乳酸和一些抗真菌代謝產(chǎn)物，可起到改善青貯飼料品質(zhì)的作用[2]。

當(dāng)前，研究人員發(fā)現(xiàn)通過篩選并添加不同種類的乳酸菌來可提高青貯成功率[3]，韋慶旭等[4](陜西)從構(gòu)樹青貯飼料、玉米青貯飼料中分離出植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、布氏乳桿菌(Lactobacillusbuchneri)、副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)、糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)4種可飼用菌種；張玉琳等[5](新疆)從雜交構(gòu)樹(Broussonetiapapyrifera)青貯飼料中最終分離得到植物乳桿菌、短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)、糞腸球菌和戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)，此外，李榮榮等[6](北京)從紫花苜蓿自然青貯飼料中篩選得到的植物乳桿菌，能夠有效促進(jìn)乳酸發(fā)酵、抑制梭菌生長(zhǎng)、顯著改善高水分苜蓿青貯品質(zhì)。Peng等[7](貴州)收獲包括紫羅蘭、高粱、玉米等12種青貯原料進(jìn)行青貯，篩選得到的優(yōu)勢(shì)菌株布氏乳桿菌(Lactobacillusbuchneri)添加到青貯飼料中有效地改善了溫暖潮濕氣候區(qū)紫花苜蓿青貯飼料的發(fā)酵質(zhì)量；Wang等[8]從青藏高原普通野豌豆、高羊茅和多年生黑麥草中分離得到的植物乳桿菌和商業(yè)植物乳桿菌MTD—1對(duì)比，發(fā)現(xiàn)在10℃和15℃的低溫環(huán)境下，3種菌均可不同程度的改善意大利黑麥草青貯發(fā)酵品質(zhì)。此外，Liu等[9]研究發(fā)現(xiàn)與商用植物乳桿菌菌株相比，篩選得到的菌株戊糖片球菌在20℃下對(duì)改善柱花草青貯品質(zhì)最為有效。因此，不同區(qū)域不同飼草附著乳酸菌種類和特性差異較大，從不同來源分離鑒定和篩選本土優(yōu)良乳酸菌菌株具有重要意義。

在全球變暖的背景下，日均最高氣溫≥40℃的天數(shù)也在增加。高溫是熱帶地區(qū)影響青貯品質(zhì)的重要環(huán)境因素，高溫會(huì)增加青貯飼料pH值和干物質(zhì)損失，降低其乳酸含量和有氧穩(wěn)定性，極大的影響飼用價(jià)值[10]。乳酸菌特性在熱帶和溫帶有明顯差異[10]，商品化乳酸菌制劑不能很好地適應(yīng)熱帶的氣候，發(fā)揮預(yù)期效果[11]。海南島為熱帶季風(fēng)氣候，夏季長(zhǎng)達(dá)6個(gè)月(月平均溫度≥30℃)且無冬季，而天然飼草青貯飼料中乳酸菌的分離及鑒定鮮有報(bào)道，因此，本研究以分布廣泛、可用作飼草為標(biāo)準(zhǔn)選取海南島的野生草本植物斑茅(Saccharumarundinaceum)、蔓生莠竹(Microstegiumvagans)和木本植物銀合歡(Leucaenaleucocephala)、構(gòu)樹(Broussonetiapapyrifera)為材料，并在5個(gè)氣候區(qū)東部濕熱區(qū)、西部干旱區(qū)、南部暖潮濕區(qū)、北部半濕熱區(qū)、中部山地潮濕區(qū)采樣對(duì)比，篩選高溫條件下適合熱帶牧草的優(yōu)良乳酸菌菌株，旨在豐富對(duì)我國(guó)熱帶地區(qū)乳酸菌菌群多樣性認(rèn)知和促進(jìn)熱帶飼草青貯添加劑的研發(fā)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料、試劑及儀器

供青貯的原料為從海口(110°11′E，19°54′N，年均溫24.1℃，年均降水量1 788 mm，海拔160 m)、瓊中(109°34′E，19°1′N，年均溫22.4℃，年均降水量2 350 mm，海拔560 m)、萬寧(110°25′E，18°54′N，年均溫23.9℃，年均降水量2 420 mm，海拔30 m)、三亞(109°34′ E，18°19′ N，年均溫26.9℃，年均降水量1 716 mm，海拔40 m)、昌江(108°58′ E，19°19′ N，年均溫24.6℃，年均降水量1 680 mm，海拔90 m)、儋州(109°30′ E，19°30′ N，年均溫23.8℃，年均降水量1 870 mm，海拔160 m)野外采集的草本植物斑茅、蔓生莠竹和木本植物銀合歡、構(gòu)樹。金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、沙門氏菌(Salmonella)、大腸埃希氏菌(Es-cherichiacoli)、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)來自海南大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)室。

De Man,Rogosa,Sharpe(MRS)瓊脂培養(yǎng)基、De Man,Rogosa,Sharpe(MRS)肉湯培養(yǎng)基：購自杭州百思生物技術(shù)有限責(zé)任公司；細(xì)菌微量生化反應(yīng)管：購自杭州微生物試劑有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1青貯制備 將采集得到的飼草切碎至2～3 cm，自然晾曬24 h后裝入聚乙烯青貯袋中，每袋200 g，每個(gè)處理重復(fù)3次。用抽真空包裝機(jī)抽真空后密封，于室內(nèi)35℃～40℃環(huán)境下儲(chǔ)存發(fā)酵60 d。

1.2.2菌體分離及菌種純化 將青貯樣品按草：水=1:10比例浸泡在錐形瓶中，然后進(jìn)行梯度稀釋，選取3個(gè)適宜梯度，各吸100 μL涂布于MRS固體培養(yǎng)基(含1.5% CaCO3)上，于37℃恒溫培養(yǎng)箱下厭氧培養(yǎng)48 h后，觀察菌落形態(tài)[12]等，挑取溶鈣圈明顯且較大的單菌落，于MRS固體培養(yǎng)基劃線3～4次，保存于—80℃超低溫冰箱，同時(shí)進(jìn)行革蘭氏染色、過氧化氫酶檢驗(yàn)。

1.2.3優(yōu)勢(shì)菌MRS液體培養(yǎng)基初篩 將純化后的乳酸菌菌液濃度調(diào)至108cfu·mL-1搖勻接100 uL至裝有MRS液體培養(yǎng)基的離心管，放置在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8，16，36 h后測(cè)定發(fā)酵液的pH值。測(cè)600 nm處OD(Optical density,吸光度)值，選取pH≤4且OD≥2[13]的菌株為初篩代表菌株。

1.2.4高溫條件下MRS液體培養(yǎng)基優(yōu)勢(shì)菌復(fù)篩及耐酸能力測(cè)定 按初篩同樣的方法接100 ul至裝有MRS液體培養(yǎng)基的離心管，分別置于40，45，50℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，測(cè)發(fā)酵液600 nm處OD值。同上述方法再將乳酸菌接入pH為3.0，3.5，4.0，6.0，8.0，9.0的MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天后，測(cè)發(fā)酵液600 nm處OD值。

1.2.5測(cè)序及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 篩選所得優(yōu)勢(shì)菌株進(jìn)行16S rDNA測(cè)序(華大基因)，在NCBI數(shù)據(jù)庫搜索并選擇序列同源性較高菌株16S rRNA基因序列，采用MEGA7軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，建樹方法為鄰接法(Neighbor-joining，NJ)[14]。

1.2.6生理生化試驗(yàn) 采用細(xì)菌微量生化反應(yīng)管，嚴(yán)格按照說明書操作，接菌方法為從MRS平板挑取單菌落到生化管，封口，放置于恒溫培養(yǎng)箱[15]。

1.2.7乳酸菌的生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)酸曲線的測(cè)定 將復(fù)篩后選出的優(yōu)良乳酸菌稀釋定菌數(shù)(按上述方法)并接種置于37℃恒溫培養(yǎng)，在0—24 h每隔2 h取出1批樣品于600 nm處分別測(cè)定MRS培養(yǎng)基的OD值，同時(shí)用pH測(cè)定儀測(cè)定MRS培養(yǎng)基的pH值[16]，分別用來表征乳酸菌的生長(zhǎng)速率和產(chǎn)酸速率。

1.2.8抑菌能力的測(cè)定 將指示菌株的活化劃線于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)48 h。挑取單菌落接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37℃，180 r·min-1條件下培養(yǎng)24 h。調(diào)整菌體濃度為1×107cfu·mL-1作為指示菌懸液；以1%(V∶V)的接種量將乳酸菌種子液接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃條件下靜置培養(yǎng)12 h，10 000 r·min-1離心2 min后取上清液，4℃保存作為上清液備用；利用牛津杯法測(cè)定抑菌性能，首先傾注15 mL將2%營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(滅菌)于培養(yǎng)皿，待水平靜置凝固后，打入100 μL指示菌菌液，涂布均勻后備用，均勻放置牛津杯垂直于培養(yǎng)基表面，在其中加入乳酸菌上清液100 μL，4℃擴(kuò)散2 h后再37℃培養(yǎng)24 h。根據(jù)抑菌圈直徑大小來判斷結(jié)果[17]。

1.2.9數(shù)據(jù)分析 基礎(chǔ)數(shù)據(jù)用Excel 2019處理，用Oringin 2018軟件作圖，用MEGA 7繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的分離純化

從青貯樣品中分離得到127株乳酸菌，98株菌株革蘭氏染色均為陽性，過氧化氫觸酶試驗(yàn)均為陰性，初步鑒定為乳酸菌。

2.2 乳酸菌的產(chǎn)酸能力和生長(zhǎng)能力初篩

就產(chǎn)酸能力而言，發(fā)酵36 h后，98株菌株中，pH≤4的有39株，占比為39.8%，其中，產(chǎn)酸能力最強(qiáng)的1株菌pH為3.91，以上菌株在8 h和16 h時(shí)也表現(xiàn)較好，8 h時(shí)39株中有一半以上pH≤5，而16 h時(shí)pH又進(jìn)一步下降，39株中有95%左右pH≤4.5；此外，發(fā)酵36 h時(shí)，4

在生長(zhǎng)能力方面，30.77%的菌株8 h時(shí)OD≥2，所有菌株均OD≥0.5；發(fā)酵36 h時(shí)，pH≤4的菌株同時(shí)滿足OD≥2。以36 h的pH≤4且OD≥2為條件，篩選得到39株優(yōu)勢(shì)菌，同時(shí)以8 h和16 h的結(jié)果為參考，發(fā)現(xiàn)所選菌株均滿足生命力強(qiáng)且產(chǎn)酸能力強(qiáng)的要求。

2.3 乳酸菌的耐高溫能力和耐酸能力復(fù)篩

對(duì)初篩優(yōu)勢(shì)菌39株進(jìn)行耐高溫能力和耐酸能力復(fù)篩，以T=50℃條件下的生長(zhǎng)情況為依據(jù)，以T=40℃和T=45℃時(shí)的OD值為參考，選出OD值最大的15株為復(fù)篩優(yōu)勢(shì)菌，去掉測(cè)序結(jié)果中重復(fù)的菌種，最終得到4株優(yōu)勢(shì)菌，并對(duì)其進(jìn)行耐酸能力的實(shí)驗(yàn)。隨著溫度的上升，所有菌株的OD值都呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，在T=50℃時(shí)，菌株10D，13C，15B的OD值為1.72，菌株14B的OD值為1.77；以pH=6為界，pH值越小則越抑制乳酸菌的生長(zhǎng)，這種抑制作用在pH=3時(shí)最為明顯，僅14B的OD≥0.5，10D，13C，15B的OD分別為0.39，0.38，0.4。(表1)。

2.4 優(yōu)良乳酸菌的生理生化、16S rDNA序列分析、系統(tǒng)發(fā)育樹、生長(zhǎng)速率及產(chǎn)酸速率和抑菌效果

從表2中可以看出，所選菌株能利用廣泛的糖源，但利用種類和能力有差別。所有的菌株七葉苷和苦杏仁苷生化管反應(yīng)都呈陽性，七葉苷水解試驗(yàn)陽性說明該乳酸菌可將七葉苷分解成葡萄糖和七葉素；苦杏仁苷陽性則說明該該乳酸菌含β-葡萄糖苷酶可催化苦杏仁苷水解為兩分子葡萄糖和1分子杏仁腈；另外，所有的菌株都能利用纖維二糖、葡萄糖、乳糖、果糖、半乳糖、麥芽糖、蕈糖、蔗糖、鼠李糖、木糖、蜜二糖、L-阿拉伯糖，但利用能力不一，其中，15B對(duì)乳糖的利用能力較弱；14B對(duì)蜜二糖的利用能力較弱；13C，14B，15B對(duì)甘露醇的利用能力較弱；14B，15B則對(duì)L-阿拉伯糖的利用能力較弱；10D，15B對(duì)木糖和屬李糖的利用能力較弱；10D，13C，14B對(duì)半乳糖的利用能力較弱；然而，所有的菌株都不能利用山梨醇、淀粉且硝酸鹽反應(yīng)呈陰性，說明所選菌株不含硝酸還原酶和淀粉水解酶；10D不能利用棉子糖、甘露醇。

表1 4株優(yōu)勢(shì)菌株耐受性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Tolerance of four representative strains to acid and high temperature

表2 4株優(yōu)勢(shì)菌株生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Physiological and biochemical characteristics of four representative strains

將代表菌株進(jìn)行16S rDNA測(cè)序后，將序列結(jié)果提交至NCBI數(shù)據(jù)庫對(duì)相似性進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果見表3。菌株10D和植物乳桿菌(Lactiplantibacillusplantarumstrain Heal19)同源性最高，菌株13C和植物乳桿菌(LactobacillusplantarumSN13T)同源性最高，菌株14B和植物乳桿(Lactiplantibacillusplantarumstrain 202195) 同源性最高，菌株15B和乳酸片球菌(Pediococcusacidilacticistrain CACC 537)同源性最高，所有菌種的同源性和標(biāo)準(zhǔn)菌株序列覆蓋率均達(dá)到100%，E值都為0。E值代表在隨機(jī)狀態(tài)時(shí)，目標(biāo)序列與其他序列的相似度大于本條序列的可能性。表中所列E值均為0，說明比對(duì)結(jié)果可靠。

表3 4株優(yōu)勢(shì)菌株的16S rDNA序列同源性比對(duì)結(jié)果Table 3 Homologous alignment analysis of 16S rDNA sequences from four typical isolates

表4可知，4株代表菌株抑菌效果均較明顯，表現(xiàn)在其對(duì)所有致病菌抑菌圈的直徑均大于10 mm。其中10D和13C對(duì)大腸桿菌的抑制作用更強(qiáng)；13C對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果更好；10D對(duì)沙門氏菌的抑制作用較好；菌株10D，14B和15B對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的抑菌圈直徑大小較為接近且數(shù)值較高，說明對(duì)該致病菌有更強(qiáng)的抑制能力。

表4 4株優(yōu)勢(shì)菌株的抑菌能力Table 4 Antibacterial activity of four representative strains

圖1所示，4株優(yōu)勢(shì)菌株呈現(xiàn)出相似的生長(zhǎng)情況，0～2 h菌株生長(zhǎng)緩慢，處于遲滯期；2 h后迅速生長(zhǎng)繁殖，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；到10 h后，生長(zhǎng)速率減緩；22 h后趨于穩(wěn)定，基本不再生長(zhǎng)，曲線趨向“S”型。在對(duì)數(shù)期，相比其他菌種，菌株13C長(zhǎng)勢(shì)較快，菌株15B在2～4 h相對(duì)平緩；在穩(wěn)定期，菌株13C生長(zhǎng)情況最好，其余菌株長(zhǎng)勢(shì)相似。

圖1 在MRS肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)的4株乳酸菌于600 nm 處的光密度值Fig.1 The optical density values at 600 nm of four LAB strains in MRS broth with the process of incubation

圖2所示，菌株10D培養(yǎng)2～12 h產(chǎn)酸速率較快，12～24 h產(chǎn)酸效率減?。痪?3C和14B在2～6 h時(shí)pH迅速下降，在6～24 h時(shí)pH有所下降但幅度變小；菌株15B在2～8 h時(shí)產(chǎn)酸速率較快，8～22 h產(chǎn)酸效率減小，22 h時(shí)趨于穩(wěn)定期，pH值基本保持不變。在產(chǎn)酸速率上，菌株13C較其他菌株更快；在產(chǎn)酸能力上，菌株10D最強(qiáng)。

圖2 4株乳酸菌于MRS肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)的 pH值變化Fig.2 The pH values of four LAB strains in MRS broth with the process of incubation

由圖3可知，菌株10D，13C，14B與植物乳桿菌(GenBank登錄號(hào)：MT229370.1)和植物乳桿菌HBUAS52250(GenBank登錄號(hào)MH472975.1)聚于一枝，親緣關(guān)系最近，故將這3株菌株鑒定為植物乳桿菌。由圖4可知，菌株15B與乳酸片球菌(GenBank登錄號(hào)MW425291.1)聚于一枝，親緣關(guān)系最近，因此，將其鑒定為乳酸片球菌(Pediococcusacidilactic)。

圖3 利用16S rDNA序列對(duì)植物乳桿菌進(jìn)行構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree for Lactobacillus plantarum based on their 16S rDNA sequences

圖4 利用16S rDNA序列對(duì)乳酸片球菌進(jìn)行構(gòu)建 系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree for Pediococcus acidilactici based on its16S rDNA sequence

3 討論

青貯發(fā)酵的微觀層面是由飼草表面附著微生物的活動(dòng)所主導(dǎo)的[18]，其中，乳桿菌屬(Lactobacillus)和乳球菌屬(Lactococcus)等在青貯飼料發(fā)酵中起關(guān)鍵作用[19]。乳酸菌的迅速繁殖會(huì)使得發(fā)酵體系中的pH值迅速下降，抑制大部分好氧細(xì)菌、大腸桿菌和霉菌等不利于青貯發(fā)酵的微生物繁殖[20]，使得發(fā)酵品質(zhì)更佳。因此，從青貯飼料中篩選優(yōu)良乳酸菌對(duì)改善青貯發(fā)酵品質(zhì)具有重要意義。

本研究以不同氣候區(qū)以及草本、木本飼草為微生物富集材料，為分離純化更豐富的菌株提供了基礎(chǔ)。有學(xué)者總結(jié)，在青貯中若要作為添加劑使用，乳酸菌需具備兩個(gè)條件1)耐酸能力強(qiáng)，活性高，生長(zhǎng)迅速；同時(shí)大量產(chǎn)酸，迅速使得pH≤4，其它微生物的生長(zhǎng)因此而受到抑制；2)除了乳糖外，可以利用蔗糖、果糖、葡萄糖等，最好可以發(fā)酵戊糖[21]。從初篩結(jié)果和生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，大部分乳酸菌在MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)36 h，培養(yǎng)液的pH≥4，這表明這些菌株的產(chǎn)酸能力較低，自然青貯難以取得良好效果，而優(yōu)勢(shì)菌10D，13C，14B和15B 在2 h即進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在36 h時(shí)pH降至4.0以下，且均可發(fā)酵多種糖源，因此，所選優(yōu)勢(shì)菌株都有潛力作為乳酸菌添加劑來改善青貯發(fā)酵品質(zhì)。篩選到的優(yōu)勢(shì)菌10D，13C，14B和15B比付浩等[22]從玉米青貯飼料中篩選得到的短乳桿菌和戊糖片球菌(12～20 h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期)生長(zhǎng)更快，但其優(yōu)勢(shì)菌株36 h左右pH達(dá)到3.6，最終的產(chǎn)酸能力較本實(shí)驗(yàn)所篩的優(yōu)勢(shì)菌稍強(qiáng)。

此外，青貯微生物受溫度影響比較大，熱帶的高溫環(huán)境會(huì)影響細(xì)菌細(xì)胞酶的活性，從而影響其生長(zhǎng)代謝。而生活在這種環(huán)境中的菌株，會(huì)改變生理生化特性以達(dá)到適應(yīng)環(huán)境的目的，形成特定的氣候生態(tài)型。本研究旨在分離純化出適應(yīng)熱帶氣候的優(yōu)勢(shì)乳酸菌，使本土優(yōu)良菌種種質(zhì)資源得以合理利用。因此在復(fù)篩時(shí)采用T=50℃下的生長(zhǎng)情況較好(OD值高)為篩選原則，得到了4株耐高溫同時(shí)耐酸能力良好的優(yōu)勢(shì)菌株，此前，研究人員從貴州省[7]青貯飼料中篩選得到的布氏乳桿菌(L.buchneri)和西南高溫高濕地區(qū)[10]青貯飼料中篩選得到的植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)在pH=3.5和T=45℃的條件下均可生長(zhǎng)，對(duì)高溫和酸性環(huán)境具有良好的適應(yīng)性。從蘭州市[23]玉米秸稈和白菜尾菜混貯料中分離純化得到的12株乳酸菌可以在pH=4.5和T=45℃條件下生長(zhǎng)。而本實(shí)驗(yàn)分離純化得到的乳酸菌對(duì)高溫脅迫的耐受性更強(qiáng)，能在50℃的環(huán)境下生長(zhǎng)繁殖。

對(duì)微生物的16S rDNA序列進(jìn)行分析可以達(dá)到初步分類鑒定的目的，基于其構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹可以確定菌種在進(jìn)化中的位置。一般認(rèn)為，在種分類水平上，2個(gè)分類單位間16S rDNA序列同源性高于97.5%則屬于同一個(gè)種。經(jīng)16S rDNA測(cè)序，結(jié)合糖發(fā)酵結(jié)果，10D，13C，14B為植物乳桿菌，15B為乳酸片球菌(Pediococcusacidilactic)。其中，植物乳桿菌被發(fā)現(xiàn)可以從多種飼草中篩選得到，新鮮仙人掌植物和青貯飼料中最常見的乳酸菌是植物乳桿菌(65%)[24]；Li等[25]從玉米秸稈青貯飼料中分離出的植物乳桿菌ZZU 203和204具有抗菌活性，可用作青貯添加劑，以抑制青貯過程中不良微生物的增殖并保存青貯飼料的營(yíng)養(yǎng)；袁潔等[26]從自然青貯多花黑麥草中篩選出的優(yōu)質(zhì)菌株中80%為植物乳桿菌。乳酸菌可以通過產(chǎn)生大量的有機(jī)酸、過氧化氫等物質(zhì)來抑制致病菌的生長(zhǎng)，是否具有抑菌作用和抑菌作用的強(qiáng)弱是評(píng)價(jià)乳酸菌的重要內(nèi)容。結(jié)果顯示4株菌株對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的抑菌圈直徑均大于10 mm，具有很強(qiáng)的抑制作用，說明從青貯飼料分離的這4株乳酸菌對(duì)常見病原菌具有抑制作用。

4 結(jié)論

本研究從海南島不同地區(qū)不同植物樣本中共分離到98株乳酸菌，經(jīng)過初篩和復(fù)篩，得到4株優(yōu)勢(shì)菌株并進(jìn)行16S rDNA測(cè)序。經(jīng)鑒定，10D，13C，14B為植物乳桿菌，15B為乳酸片球菌(Pediococcusacidilactic)，4株代表菌株中，菌株13C長(zhǎng)勢(shì)較好且產(chǎn)酸速率較快，菌株10D產(chǎn)酸能力較強(qiáng)。耐受性試驗(yàn)中，菌株14B在pH=3.0環(huán)境下生長(zhǎng)較好，耐酸能力較好；所有菌株在50℃環(huán)境下生長(zhǎng)良好，耐高溫能力強(qiáng)，在抑菌試驗(yàn)中，所選優(yōu)勢(shì)菌株均可有效抑制致病菌的生長(zhǎng)，其中，菌株10D可以有效的抑制大腸桿菌、沙門氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌，菌株13C則對(duì)金黃色葡萄球菌有明顯的抑菌作用。