高寒煤礦渣山植被建植年限對土壤細(xì)菌多樣性的影響

道日娜， 張 英， 蘇貝貝， 李希來， 馬林雄， 鐵曉龍

(青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，三江源區(qū)高寒草地生態(tài)省部共建重點實驗室， 青海 西寧 810016)

青海省江倉煤礦區(qū)是青海省最大的礦區(qū)，海拔3 800 m左右，氣候寒冷、干旱、氧缺乏、年積溫低，生長季節(jié)短。機(jī)械堆積起來的一座座渣山，嚴(yán)重破壞了草地資源，加重了水土流失，并且其本身土壤結(jié)構(gòu)性差、缺乏植物所需要的養(yǎng)分，導(dǎo)致礦區(qū)生態(tài)環(huán)境無法在短時間內(nèi)進(jìn)行恢復(fù)。為此，對高寒江倉煤礦區(qū)進(jìn)行了人工建植。由于高寒礦區(qū)特殊的地理位置，多采用不覆土直接種植植被的修復(fù)方式，因此具有較大難度。

歐美等國家很早開始了對礦區(qū)生態(tài)系統(tǒng)的研究[1]。一些學(xué)者研究表明，人工建植比自然恢復(fù)更有利于礦區(qū)植被的快速恢復(fù)[2]。我國關(guān)于土壤細(xì)菌多樣性的研究主要見于農(nóng)田和叢林生態(tài)系統(tǒng)[3]，大多在黃土丘陵區(qū)與低海拔區(qū)[4]，一般采用排土以后與客土混合來進(jìn)行土壤改良，而對高寒地區(qū)的研究屈指可數(shù)。吳道銘等[5]認(rèn)為，芒屬植物對重金屬有較強(qiáng)的抗逆性，可以根據(jù)礦山生態(tài)狀況、修復(fù)目的以及芒屬植物的生物特性，制定礦山植被的恢復(fù)模式。孫夢媛等[6]研究了煤礦排土場不同復(fù)墾模式對土壤肥力的影響，得出豆科植物和楊樹林混合復(fù)墾能有效提高土壤堿解氮、有機(jī)質(zhì)含量，酶活性以及微生物量。以上研究能夠表明植被恢復(fù)顯著改善礦區(qū)土壤質(zhì)量，但相關(guān)研究主要集中在高寒礦區(qū)生態(tài)修復(fù)的土壤理化性質(zhì)測定和植被重建方面[7]或土壤酶活性以及植物生物量方面，缺少對不同植被建植年限土壤特征演變的研究報道。研究表明，不同建植年限下，地上植被、土壤養(yǎng)分含量、土壤酶活性以及微生物多樣性以及物理結(jié)構(gòu)均有顯著變化，年限越長，越有利于土壤物理結(jié)構(gòu)的改良以及有機(jī)質(zhì)的積累[8-9]。

土壤微生物，例如土壤細(xì)菌、真菌、放線菌及微藻類等主導(dǎo)并參與了有機(jī)物的分解、植物的生長等重要過程[10-11]，受微環(huán)境的影響比較大[12-13]，對土壤質(zhì)量變化具有重要指示作用[14]。土壤細(xì)菌參與土壤中多數(shù)養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化[15]，其在土壤微生物中占絕對優(yōu)勢[16-17]。因此，土壤細(xì)菌多樣性可以用來衡量建植后土壤質(zhì)量狀況，監(jiān)測礦區(qū)環(huán)境變化[18-20]。土壤酶是指一些在土壤中具有生物催化能力的特殊蛋白質(zhì)化合物的總稱，主要來源于土壤中植物、動物及微生物活動的產(chǎn)物[21]。土壤酶在土壤生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)能量的轉(zhuǎn)化循環(huán)過程中起著重要作用，參與土壤中各種生物化學(xué)過程[22-23]。土壤酶的活性大致反映了某一種生態(tài)環(huán)境條件下土壤生物化學(xué)過程的相對強(qiáng)度，因此，可以反映土壤肥力狀況和土壤質(zhì)量的生物活性[24-25]。細(xì)菌和酶共同參與土壤養(yǎng)分循環(huán)以及轉(zhuǎn)化、土壤的發(fā)育以及更新[26]，進(jìn)而促進(jìn)植物的生長，是最能反映土壤質(zhì)量的敏感指標(biāo)[27]。在微生物群落研究方面，大多采用磷脂脂肪酸法，該方法不能全面反映土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)以及多樣性的變化，因此具有一定的局限性。近年來高通量測序的發(fā)展，使快速、準(zhǔn)確的獲取土壤微生物的信息成為可能。因此，本研究主要以江倉礦區(qū)渣山不同建植年限的草地為研究對象，利用高通量測序技術(shù)分析土壤細(xì)菌多樣性對復(fù)綠草地的響應(yīng)特征，測定土壤養(yǎng)分含量以及酶活性，在此基礎(chǔ)上探討礦區(qū)渣山不同建植年限的土壤養(yǎng)分含量、酶活性與土壤細(xì)菌多樣性的關(guān)系，以期為未來的高寒礦區(qū)建植與生態(tài)重建工作提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

研究地點位于青海省海北州剛察縣江倉煤礦區(qū)，該區(qū)地處高寒地帶，海拔3 800～4 200 m，最低氣溫—35.6℃，最高氣溫19.8℃，年平均氣溫—2.8℃，年降水量477.1 mm，多集中在夏季，年蒸發(fā)量1 049.9 mm，為中低山，氣候嚴(yán)寒。江倉礦區(qū)內(nèi)分布大量高寒草甸、沼澤，屬高寒沼澤濕地。坡面的基質(zhì)均由煤矸石與堆積的渣土組成，陽坡，沿渣山底部邊緣砌筑圍堰，以增加坡面的穩(wěn)定性。樣地建植方法一致，均有人工種植垂穗披堿草(Elymusnutans)、冷地早熟禾(Poacrymophila)、星星草(Puccinelliatenuiflora)，以2∶1∶1的比例分別種植于2015年 5月、2017年5月以及2019年5月下旬，播量8.094 3 kg·hm-2，播后覆蓋無紡布。在此期間，無施肥、澆水、放牧等情況。礦區(qū)無干擾的原始植被的海拔3 788 m，地理坐標(biāo)為99°38′E，38°03′N，優(yōu)勢種主要為小嵩草(Kobresiapygmaea)、矮嵩草(Kobresiahumilis)、細(xì)葉苔草(Carexrigescens)。

1.2 研究方法

2019年9月20日赴野外樣地，在試驗區(qū)(如圖1)選取2019年(編號Y19)、2017年(編號Y17)、2015年(編號Y15)建植的草地，用消過毒的無菌鏟采集0～20 cm的根圍土壤樣品，采集渣山外圍原生植被土壤(編號YS)為對照，重復(fù)3次，裝入自封袋中混合均勻，低溫下帶回室內(nèi)進(jìn)行化學(xué)性質(zhì)、酶活性與細(xì)菌群落特征的測定。

圖1 試驗區(qū)樣地布局圖Fig.1 The geographical location of the layout of the sample plot

1.3 測定方法

(1)土壤化學(xué)性質(zhì)測定：土壤全氮(Total nitrogen，TN)含量采用半微量凱氏定氮法，全磷(Total phosphorus,TP)含量采用氫氧化鈉熔融法，全鉀(Total potassium，TK)含量采用氫氧化鈉熔融法，堿解氮(Available nitrogen，AN)含量采用堿解擴(kuò)散法，速效磷(Available phosphoru，AP)含量采用碳酸氫鈉浸提法，速效鉀(Available potassium，AK)含量采用醋酸銨浸提法，土壤酸堿度采用電級法(水土比2.5∶1)進(jìn)行測定，土壤有機(jī)質(zhì)(Organic matter，OM)含量采用重鉻酸鉀容量法測定[28-29]。

(2)土壤酶活性測定：土壤蔗糖酶活性采用3,5-二硝基水楊酸比色法，淀粉酶活性采用二硝基水楊酸比色法，脲酶活性采用靛酚藍(lán)比色法，磷酸酶活性采用磷酸苯二鈉比色法，過氧化氫酶活性采用高錳酸鉀滴定法[30]。

(3)土壤細(xì)菌多樣性的測定：先進(jìn)行基因組DNA的提取，稱取土壤樣品，在液氮中研磨呈細(xì)粉末，振蕩混勻；將上清轉(zhuǎn)移到新的離心管中離心2 min；在吸附柱中加入溶液50 μL(10 mL D2600-50T)和離心后的上清液，并加入漂洗液后離心；拿出吸附柱干燥后，加洗脫液，放在新的離心管中離心；然后將離心管中的液體重新加入吸附柱中離心，所得物為土壤微生物。將DNA溶液進(jìn)行電泳；再以稀釋后的基因組DNA為模板，來進(jìn)行PCR基因擴(kuò)增。采用Illumina MiSeq測序平臺的通用引物對土壤細(xì)菌16SrDNAV3-V4區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在進(jìn)行實驗的時候，需做對照實驗(無菌去離子水)，代替模板DNA。擴(kuò)增完成后對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化、定量和均一化[31]。利用Illumina MiSeq進(jìn)行上機(jī)測序及分析。

1.4 數(shù)據(jù)測定

采用Excel 2007 進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，運(yùn)用SPSS對土壤養(yǎng)分及酶活性采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)。利用Duncan復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗(P<0.05)。土壤酶數(shù)據(jù)運(yùn)用Origin 64做柱狀圖。細(xì)菌多樣性使用Silva(細(xì)菌)數(shù)據(jù)庫比對，用Blast軟件物種比對注釋。細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與土壤因子的關(guān)系，采用百邁客云平臺的RDA分析法進(jìn)行土壤因子與土壤真菌的相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同建植年限草地土壤化學(xué)性質(zhì)及酶活性變化

不同建植年限的草地土壤化學(xué)性質(zhì)的結(jié)果如表1所示。研究區(qū)域土壤為弱堿性土壤。Y19與Y17的pH值差異顯著(P<0.05)，而Y15與YS之間沒有顯著性差異。各樣地之間OM，AK，AP，TK，TN含量有差異顯著性(P<0.05)。Y19和Y17樣地之間TP和AN含量無顯著差異；Y15和YS樣地之間TP，AN含量無顯著差異；但Y19和Y17與Y15和YS之間呈現(xiàn)出了顯著性差異(P<0.05)。隨著建植年限的增長，TP含量、TK含量、AN含量呈上升趨勢；而TN含量、AP含量、AK含量和OM含量隨著建植年限的增長而上升，但恢復(fù)到一定年限時，呈下降趨勢。

表1 不同建植年限草地土壤化學(xué)性質(zhì)Table 1 Soil chemical properties of grassland in different construction years

對不同復(fù)綠年限草地土壤酶活性的變化進(jìn)行分析，如圖2所示，隨著建植年限的增長，土壤酶活性呈上升趨勢。脲酶活性在不同建植年限之間有顯著差異(P<0.05)，與Y19相比,Y15脲酶活性增加了64.6%。過氧化氫酶的活性在Y19時最低，Y15時最高，與YS相比，建植土壤的過氧化氫酶的活性較大。由圖2(c)可知磷酸酶的活性在各建植年限的土壤中差異顯著(P<0.05)；在Y15時活性達(dá)到最高，但與YS相比，降低了43.7%。淀粉酶和蔗糖酶活性在各樣地的值隨著建植年限的增長呈現(xiàn)出上升的趨勢，但建植一段時間過后才能恢復(fù)到原生植被的土壤狀態(tài)?？傮w來說，隨著建植年限的增長，土壤養(yǎng)分含量逐漸增加，使得土壤微生物分泌的土壤酶增加。

圖2 不同復(fù)綠年限草地土壤酶活性Fig.2 Soil enzyme activities in different years of construction grassland

2.2 不同建植年限草地土壤細(xì)菌多樣性分析

對不同建植年限草地土壤細(xì)菌群落豐富度與多樣性進(jìn)行分析，如表2所示，Ace，Shannon，Chao指數(shù)在各樣地都出現(xiàn)了顯著性的差異(P<0.05)，Simpson指數(shù)無顯著差異。所有樣本覆蓋度均在99%以上，表明測序結(jié)果可靠。Y17的細(xì)菌豐富度(Ace指數(shù)與Chao指數(shù))最高，YS的最低。從Shannon指數(shù)來看，Y17的最高，為8.59；Y15的最低，為6.47。表明Y17的細(xì)菌多樣性最高，Y15則相反。

表2 不同建植年限草地土壤細(xì)菌群落豐富度與多樣性指數(shù)Table 2 The richness and diversity index of soil bacterial community in grassland with different greening years

不同建植年限草地土壤細(xì)菌群落物種組成分布，如圖3所示。隨著建植年限的增長，細(xì)菌物種組成也發(fā)生了較大變化。Y19當(dāng)中，鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、未培養(yǎng)到的Micrococcac、未培養(yǎng)到的Intrasporan為優(yōu)勢菌屬。而在Y17和Y15中，優(yōu)勢菌屬為鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、未培養(yǎng)到的Subgroup-6，Ellin6067。YS中的優(yōu)勢菌屬為鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)和蒼白桿菌(Ochrobactrum)。Ellin6067在Y17與Y15中的相對豐度在3.5%～6.6%之間，而在Y19與YS中只占到了0.1%左右。蒼白桿菌(Ochrobactrum)在Y19 中占到了6.5%左右，而在其他樣本中占到了0.1%以下，甚至更少。Y19中未培養(yǎng)到的Micrococcac占到了19.5%左右，在其他當(dāng)中只占到了0.7%～1.3%。鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)在4個樣本中都是以優(yōu)勢菌屬的形式存在，也證明了該屬的菌株有著較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)性。

圖3 不同建植年限草地土壤細(xì)菌物種組成分布Fig.3 Composition and distribution of soil bacterial species in grassland with different years of construction注：一種顏色代表一個物種，色塊長度表示物種所占相對豐度比例；為使視圖效果最佳，柱狀圖只顯示豐度水平前10的物種，并將其他物種合并為Others在圖中顯示，Uncultured代表未得到培養(yǎng)的物種Note:Acolor represents a species,and the block length represents the relative abundance of species. To maximize the view effect,only the top 10 species with abundance level are shown in the histogram,and the other species are combined into Others as shown in the figure. Uncultured represents the species that have not been cultured

由圖4可知，物種在三個樣本中的分布不太均勻。放線菌門(Actinobacteria)離Y19近且相對豐度較大，而離其他兩個頂點較遠(yuǎn)。變形菌門(Proteobacteria)離頂點Y15較近，分布較多；而離Y19相對較遠(yuǎn)，分布較少。擬桿菌門(Bacteroidetes)在Y19中分布的較多，Y15中的分布較少。酸桿菌門(Acidobacteria)在Y17的分布較多，而綠彎菌門(Chloroflexi)在Y19和Y17中的分布較多，在Y15中不存在。

在屬分類水平上，根據(jù)不同建植年限草地土壤細(xì)菌群落在屬水平的物種注釋以及豐度信息，選取了土壤細(xì)菌豐度排名前20個物種及其在每個樣本中的豐度信息繪制了熱圖，可以使高豐度和低豐度的物種分塊聚焦。結(jié)果顯示(圖5)，Y19的主要細(xì)菌屬為uncultured-bacterium-f-Micrococcac,Sphingomonas,Massilia,uncultured-bacterium-f-Intrasporangi,uncultured-bacterium-o-Chloroplast、uncultured-bacterium-c-Subgroup-6，相對豐度在3.0%～19.6%之間。YS的主要菌屬為Ochrobactrum,uncultured-bacterium-f-Lachnospira、乳球菌屬(Lactobacillus)、Brevibacterium，相對豐度在2.5%～6.6%之間。Y17的主要菌屬為uncultured-bacterium-f-Saprospiraceae,uncultured-bacterium-f-A4b，相對豐度在3.1%～4.7%之間。Y15的主要菌屬為Ellin6067,uncultured-bacterium-o-Saccharimonadales，豐度在2.0%～6.6%之間。Y17與Y15的優(yōu)勢菌群的區(qū)域顏色相近，表明它們有較高的群落結(jié)構(gòu)相似性。而Y19與其他樣本、YS與其他樣本的顏色變化明顯不同，說明他們的結(jié)構(gòu)差異明顯。

圖4 不同建植年限草地土壤細(xì)菌三元相圖Fig.4 Ternary phase diagram of soil bacteria in grassland with different years of construction注：等邊三角形的頂點表示各樣本，點的大小代表屬的相對豐度Note:The vertices of the equilateral triangle represent each sample,and the size of the points represents the relative abundance of the genus

圖5 不同建植年限草地土壤細(xì)菌物種豐度熱圖Fig.5 Heat map of soil bacterial species abundance in grassland with different greening years注：熱圖中著色方格對應(yīng)的值為樣品在屬分類上的Z值，即為樣品在該分類上的相對豐度和所有樣品在該分類的平均相對豐度的差除以所有樣品在該分類上的標(biāo)準(zhǔn)差所得到的值；方格顏色越紅，說明該樣品相對豐度越高Note:The value corresponding to the colored squares in the heat map is the Z value of the sample in the genus classification,that is,the value obtained by dividing the difference between the relative abundance of the sample in this classification and the average relative abundance of all samples in this classification by the standard deviation of all samples in this classification;The redder the grid color,the higher the relative abundance of the sample

不同建植年限草地土壤細(xì)菌群落的主成分分析結(jié)果表明(圖6)，主成分1(PC1)、主成分2(PC2)以及主成分3(PC3)的樣品差異性貢獻(xiàn)率為7.12%，27.46%和65.42%，是主要的差異來源。Y19位于PC1的正值區(qū)域和PC2的負(fù)值區(qū)域及PC3的正負(fù)兩側(cè)。Y17位于PC1的負(fù)值區(qū)域和PC3的正值區(qū)域以及PC2的正負(fù)兩側(cè)。Y15位于PC1,PC3的負(fù)值區(qū)域。YS位于PC1和PC2以及PC3的正值區(qū)域。這4個樣本之間，間隔位置較大，細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了較大變化。

圖6 不同建植年限草地土壤細(xì)菌主成分分析Fig.6 Principal component analysis of soil bacteria in grassland with different years of construction

2.3 不同建植年限草地土壤化學(xué)性質(zhì)、酶活性與細(xì)菌多樣性

不同建植年限草地土壤化學(xué)性質(zhì)、土壤酶活性與土壤細(xì)菌的相關(guān)性分析結(jié)果如圖7所示，第一排序軸和第二排序軸解釋了細(xì)菌群落變化的30.55%和19.23%。土壤有機(jī)質(zhì)(OM)、全氮(TN)、土壤酶的射線都較長，因此對土壤細(xì)菌群落的影響較大。堿解氮(AN)、有機(jī)質(zhì)(OM)、全氮(TN)與全磷(TP)含量與蔗糖酶(SC)、脲酶(UE)、過氧化氫酶(CAT)、淀粉酶(AMY)和磷酸酶(PA)等土壤酶活性，以及酸桿菌門(Acidobacteria)等細(xì)菌門類相對豐度之間呈正相關(guān)性，彼此之間受影響較大。而全鉀(TK)、速效磷(AP)、速效鉀(AK)與芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、酸桿菌門(Acidobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、裝甲菌門(Armatimonadetes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)等細(xì)菌門類相關(guān)性較強(qiáng)。其中，變形菌門(Proteobacteria)、硬壁菌門(Firmicutes)對環(huán)境的適應(yīng)性強(qiáng)，耐低溫?？傮w來說，土壤化學(xué)性質(zhì)、土壤酶活性以及土壤細(xì)菌之間相互影響、相互制約。

圖7 不同建植年限草地土壤化學(xué)性質(zhì)、土壤酶活性與 土壤細(xì)菌相關(guān)性分析Fig.7 Correlation analysis of soil chemical properties,soil enzyme activities and soil bacteria in grassland with different greening years注：TN表示全氮；TP表示全鉀；TK表示全鉀；AN表示堿解氮；AP表示速效磷；AK表示速效鉀；OM表示有機(jī)質(zhì)；pH表示酸堿度；SC表示蔗糖酶；UE表示脲酶；CAT表示過氧化氫酶；PA表示磷酸酶；AMY表示淀粉酶；Acidobacteria表示酸桿菌門；Actinobacteria表示放線菌門；Firmicutes表示硬壁菌門；Gemmatimonadetes表示芽單胞菌門；Proteobacteria表示變形菌門；Rokubacteria表示己科河菌門Note:TN indicate total nitrogen;TP indicate total potassium;TK indicate total potassium;AN indicate alkali-hydrolyzed nitrogen;AP indicate available phosphorus;AK indicate available potassium;OM indicate organic matter;pH indicate pH value;SC indicate sucrase;UE indicate urease;CAT indicate catalase;PA indicate phosphatase;AMY indicate amylase

3 討論

3.1 不同建植年限草地土壤化學(xué)性質(zhì)與酶活性

對高寒煤礦渣山進(jìn)行建植可提高土壤養(yǎng)分含量、酶活性以及細(xì)菌群落多樣性。土壤養(yǎng)分和酶活性能直接或間接反映土壤肥力狀況。張小琴等[32]發(fā)現(xiàn)隨著植被恢復(fù)時間的增加，氮、磷、鉀等逐漸積累，pH值降低[33]。楊鑫光等[34]、王銳等[35]等研究認(rèn)為，高寒煤礦在建植短期內(nèi)土壤速效氮含量呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢。在本研究中，速效氮含量在建植1年和3年之間無顯著差異，而在建植5年時顯著增加，并未出現(xiàn)下降趨勢。造成這種差異的原因可能與土壤生物化學(xué)過程有關(guān)，還需進(jìn)一步進(jìn)行分析研究。本試驗中，建植1年時，土壤pH值為8.48，建植5年時pH值為7.91，雖然pH值有所降低，但依舊呈弱堿性。這是由于建植時間較短，植被生長過程中損耗了大量養(yǎng)分，并未得到及時的補(bǔ)充。建植5年的全氮含量與建植3年相比含量降低，是由于植物的生長發(fā)育主要受到氮素的影響，建植初期植物可用氮素缺乏，隨著建植時間的延長，土壤氮素隨之減少。全鉀含量隨著建植年限的增長呈上升趨勢；而速效鉀含量呈先上升后下降的趨勢。由于渣山氣溫低，海拔高，有機(jī)質(zhì)分解緩慢，導(dǎo)致速效磷與速效鉀含量建植5年時呈下降趨勢，因此渣山在建植后需及時補(bǔ)充磷、鉀等速效肥料，從而滿足植被生長所需。土壤有機(jī)質(zhì)是土壤微生物能量的來源和養(yǎng)分的儲備庫[36-37]，在植物生長過程中極其重要[38]，能夠反映植被蓋度以及生物量的狀況[39]。在本試驗中，隨著建植年限的增長，土壤有機(jī)質(zhì)含量呈現(xiàn)出先增加后下降的趨勢。而諸多的研究發(fā)現(xiàn)，隨著建植時間的增長，有機(jī)質(zhì)含量呈顯著增長趨勢[40-43]。從理論上講，煤礦渣山氣候寒冷，土壤有機(jī)質(zhì)分解緩慢，引起土壤有機(jī)質(zhì)呈上升狀態(tài)。造成這種差異的原因，還需進(jìn)一步進(jìn)行試驗與探討。

植被恢復(fù)后，土壤脲酶與土壤蔗糖酶的活性表現(xiàn)出上升的趨勢。隨著建植年限的增長，煤礦渣山草地土壤酶活性均表現(xiàn)出上升趨勢。土壤酶的主要來源是根系分泌物與植物殘體分解物。在植被建植前期，土壤養(yǎng)分含量較低，水土流失較為嚴(yán)重；而在后期，植物凋落物積累，根系分泌物增加，養(yǎng)分含量逐漸升高，土壤酶活性也就相應(yīng)的提高。建植年限短，蔗糖酶活性較低的原因可能是由于地上生物量少，減少了蔗糖酶的產(chǎn)生。在李鵬飛等[44]、胡華英等[45]等的研究中，隨著植被的恢復(fù)土壤磷酸酶呈現(xiàn)出無規(guī)律的變化。這與本試驗結(jié)果不一致。土壤磷酸酶受較多因素的影響，是由土壤微生物、植被豐富度的不同所導(dǎo)致。

3.2 不同建植年限草地土壤細(xì)菌多樣性

對煤礦渣山不同建植年限草地土壤細(xì)菌多樣性分析發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌豐富度與多樣性呈現(xiàn)出先增加后下降的趨勢，建植3年時達(dá)到最高值。土壤細(xì)菌豐富度的增加主要是由于根系分泌物的增加和養(yǎng)分利用率的提高[46]。本研究中，在屬水平物種分布圖中可看到，鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)在各個樣地均為優(yōu)勢菌屬。從三元相圖中可以看到，放線菌門(Actinobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、酸桿菌門(Acidobacteria)與綠彎菌門(Chloroflexi)為優(yōu)勢菌門。變形菌門(Proteobacteria)的豐度隨著建植年限的增加而上升，這是由于養(yǎng)分含量與酶活性增加，促進(jìn)了土壤細(xì)菌的豐度增加。放線菌門(Actinobacteria)與綠彎菌門(Chloroflexi)的豐度隨建植年限的增長而呈下降趨勢。這是因為放線菌門(Actinobacteria)與綠彎菌門(Chloroflexi)在較為貧瘠的土壤環(huán)境中具有生存優(yōu)勢[47-48]。

3.3 影響土壤細(xì)菌多樣性的關(guān)鍵因子

土壤酶由植物根系、微生物和動物等分泌，參與土壤養(yǎng)分合成或者分解等過程，與土壤微生物直接或間接地影響土壤生化反應(yīng)，因此土壤酶活性、土壤理化性質(zhì)與土壤細(xì)菌存在著密切的聯(lián)系。劉善江等[49]學(xué)者指出，土壤酶是各種生化反應(yīng)的催化劑，同時也是土壤細(xì)菌活性強(qiáng)弱的表現(xiàn)和影響因子之一，印證了本文結(jié)果。土壤全氮、速效氮含量與土壤酶活性對土壤細(xì)菌的影響較大，說明土壤全氮、速效氮含量與土壤酶活性是土壤中較為重要的環(huán)境影響因子。Lauber等[50]研究發(fā)現(xiàn)土壤pH值與土壤細(xì)菌群落關(guān)系密切相關(guān)，這與本試驗結(jié)果有差異。這種差異可能是由于土壤酶活性的影響因素還有其他菌類或細(xì)菌種類，并且作用方式不同所導(dǎo)致。蔗糖酶、脲酶、過氧化氫酶、淀粉酶和磷酸酶等土壤酶活性，以及酸桿菌門(Acidobacteria)、己科河菌門(Rokubacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、硬壁菌門(Firmicutes)等細(xì)菌門類相對豐度之間呈正相關(guān)關(guān)系，彼此之間受影響較大。其中，蔗糖酶和脲酶是土壤碳、氮循環(huán)的限制因子之一。馬轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)等學(xué)者[51]的研究表明，土壤細(xì)菌群落與土壤脲酶、蔗糖酶活性呈顯著相關(guān)關(guān)系，這與本試驗結(jié)果相一致。朱靈等[52]研究發(fā)現(xiàn)，土壤酶活性與綠彎菌門(Chloroflexi)、變形菌門(Proteobacteria)、裝甲菌門(Armatimonadetes)與芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)相對豐度存在顯著正負(fù)相關(guān)性，但與其他門類的相關(guān)性不顯著，這與本試驗結(jié)果有些差異。這可能是由于植被的不同直接或間接影響酶活性與土壤細(xì)菌，并且土壤中的細(xì)菌類群較多，土壤酶活性與土壤細(xì)菌之間有著復(fù)雜而非單一的關(guān)系。有些土壤養(yǎng)分、土壤酶活性與土壤細(xì)菌群落關(guān)系不顯著，這可能是由于土壤酶活性的影響因素還有其他菌類或細(xì)菌種類繁多，并且作用方式不同所導(dǎo)致。

4 結(jié)論

對煤礦渣山不同建植年限(1年、3年、5年)草地土壤酶活性與土壤細(xì)菌多樣性研究發(fā)現(xiàn)：隨著建植年限的增長，TP，TK，AN含量及土壤中酶活性呈上升趨勢，TN，AP，AK和OM含量剛開始時隨著建植年限的增長而上升，但土地恢復(fù)到一定年限時，呈下降趨勢；4個樣地中鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)為共有的優(yōu)勢菌屬；土壤OM和TN含量及土壤酶活性對土壤細(xì)菌群落的影響較大；土壤細(xì)菌相對豐度與土壤養(yǎng)分、酶活性存在密切的聯(lián)系，隨建植年限的增長，植被覆蓋度、根系分泌物增加，土壤養(yǎng)分含量及酶活性增加，最終促進(jìn)細(xì)菌多樣性提高，從而生態(tài)環(huán)境逐漸改善。