自身免疫性肝炎患者外周血T淋巴細(xì)胞PD-1/PD-L1表達(dá)及其與肝功能指標(biāo)的相關(guān)性

王變 沙敏 肖麗 李陽(yáng)

自身免疫性肝炎是由自身免疫反應(yīng)介導(dǎo)的一種慢性肝臟炎癥性疾病，在臨床中以Ⅰ型為主，其若不能得到及時(shí)有效控制，可并發(fā)肝性腦病、肝硬化等，嚴(yán)重者可發(fā)展為肝癌，給患者身體健康與生命安全帶來(lái)嚴(yán)重危害[1-2]。因此，積極探討影響自身免疫性肝炎病情進(jìn)展的相關(guān)因子對(duì)臨床評(píng)估患者病情及指導(dǎo)治療具有十分重要的意義。目前，該病的病因及發(fā)病機(jī)制尚未得以完全闡明，但多認(rèn)為自身免疫異?？赡軈⑴c了疾病的發(fā)病過(guò)程[3]。已有研究指出，T淋巴細(xì)胞調(diào)節(jié)失控在自身免疫性肝炎的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用[4]。程序性死亡因子-1（programmed death-1，PD-1）和程序性死亡因子配體-1（programmed death ligand-1，PD-L1）能夠在T細(xì)胞活化以及增殖時(shí)供給負(fù)性共刺激信號(hào)，負(fù)調(diào)控免疫應(yīng)答的活化，與自身免疫性疾病、惡性腫瘤免疫逃逸等密切相關(guān)[5-6]。相關(guān)研究報(bào)道，自身免疫性肝炎患者外周血T淋巴細(xì)胞中PD-1高表達(dá)，可能參與了疾病的發(fā)生[7]。根據(jù)上述研究，雖然外周血T淋巴細(xì)胞中PD-1等在自身肝炎患者中的表達(dá)情況已有定論，但關(guān)于其表達(dá)情況是否與肝功能變化具有一定的相關(guān)性尚需進(jìn)一步探討。鑒于此，本研究旨在探索PD-1、PD-L1表達(dá)在自身免疫性肝炎患者病情進(jìn)展中的意義，以期為該病的發(fā)病機(jī)制研究及臨床治療提供新方向及理論依據(jù)，詳情如下。

資料與方法

1一般資料 經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批（倫理批準(zhǔn)號(hào)：201512-003），選取2016年1月～2021年7月本院收治的131例自身免疫性肝炎患者設(shè)為疾病組，根據(jù)配對(duì)原則選取同期體檢健康者112例設(shè)為對(duì)照組，另取93例臨床資料均匹配的肝血管瘤手術(shù)患者作為肝血管瘤組。受試對(duì)象或家屬均簽署知情同意書(shū)。

納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）疾病組均符合自身免疫性肝炎診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]，經(jīng)肝活檢確診；（2）根據(jù)肝活檢結(jié)果將疾病組患者分為輕度（肝活檢顯示，匯管周?chē)⒃谄瑺顗乃?，肝小葉存在散在性壞死細(xì)胞，少于1/3匯管區(qū)有炎癥細(xì)胞）、中度（＜50%匯管周?chē)鷫乃溃?/3～2/3肝小葉內(nèi)變性，1/3～2/3匯管區(qū)有炎癥細(xì)胞）與重度（≥50%匯管周?chē)鷫乃溃?/3肝小葉內(nèi)變性，＞2/3匯管區(qū)炎癥細(xì)胞密度增加）[9]；（3）患者均處于活動(dòng)期，疾病類(lèi)型為Ⅰ型，入院后均常規(guī)給予免疫抑制劑、保肝藥物治療；（4）對(duì)照組均為體檢健康者，無(wú)心肝腎等疾??；（5）肝血管瘤組患者均為行肝血管瘤手術(shù)患者，肝功能Child-Pugh分級(jí)均為A級(jí)；（6）均無(wú)免疫抑制劑使用史。

排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）酒精性或病毒性肝炎；（2）原發(fā)性膽汁性膽管炎、原發(fā)性硬化性膽管炎者，或自身免疫性肝炎-原發(fā)性膽汁性膽管炎/原發(fā)性硬化性膽管炎重疊綜合征；（3）藥物引發(fā)肝損傷或遺傳代謝性肝病等；（4）腫瘤；（5）膽結(jié)石或膽囊炎等其他肝膽疾病；（6）甲狀腺功能亢進(jìn)等內(nèi)分泌疾??；（7）心腦血管疾??；（8）貧血、營(yíng)養(yǎng)不良；（9）急性感染；（10）免疫系統(tǒng)疾病。

2方法

2.1外周血T淋巴細(xì)胞中PD-1、PD-L1表達(dá)檢測(cè)：均抽取受試者（對(duì)照組于體檢時(shí)，疾病組于入院第二天，肝血管瘤組于手術(shù)前）空腹外周靜脈血2 mL，經(jīng)EDTA抗凝后，取150 μL全血分三等份，分別加入3支流式管中（A、B、C支），其中A、B支均加入小鼠抗人CD3-PerCP-Cy5.5、CD4-FITC與CD8-FITC單克隆抗體各10 μL，此外A支額外加入10 μL的鼠抗人PD-1-PE單克隆抗體，B支額外加入10 μL的鼠抗人PD-L1-PE單克隆抗體，另C支加入FITC-IgGⅠ、PE-IgGⅠ各10 μL作為同型對(duì)照；渦旋后，在室溫下避光孵育30 min，加入450 μL的紅細(xì)胞裂解液（經(jīng)10倍稀釋后），接著在室溫下避光孵育15 min，完全溶血后，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌3次，用300 μL的1%多聚甲醛重新懸浮細(xì)胞，立即采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。用BD Cell Quest軟件分析數(shù)據(jù)，以FSC與SSC設(shè)門(mén)進(jìn)行細(xì)胞的讀取，并以CD3和CD4雙陽(yáng)性圈定記作CD4+T細(xì)胞，而以CD3和CD8雙陽(yáng)性圈定記作CD8+T細(xì)胞，分別測(cè)定CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞的PD-1、PD-L1陽(yáng)性比例。相關(guān)抗體試劑盒均購(gòu)自美國(guó)BD公司，紅細(xì)胞裂解液、PBS緩沖液均購(gòu)自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司，流式細(xì)胞儀（Cytomics FC 500）購(gòu)自美國(guó)貝克曼公司。

2.2肝功能相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)：均抽取受試者靜脈血5 mL，離心、分離血清，應(yīng)用貝克曼AU5800全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清總膽紅素（total bilirubin，TBIL）、直接膽紅素（direct bilirubin，DBIL）、間接膽紅素（indirect bilirubin，IBIL）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、總蛋白（total protein，TP）、白蛋白（albumin，ALB）、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（gamma glutamyltranspeptidas，GGT）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）水平。

3觀察指標(biāo)

3.1一般資料比較

3.2疾病組、肝血管瘤組、對(duì)照組外周血CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞中PD-1、PD-L1表達(dá)水平比較。

3.3輕、中、重度自身免疫性肝炎患者外周血CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞中PD-1、PD-L1表達(dá)水平比較。

3.4疾病組、肝血管瘤組、對(duì)照組肝功能相關(guān)指標(biāo)（TBIL、DBIL、IBIL、ALT、AST、TP、ALB、GGT、ALP）比較。

3.5自身免疫性肝炎外周血T淋巴細(xì)胞中PD-1、PD-L1表達(dá)水平與肝功能指標(biāo)的相關(guān)性。

3.6不同肝功能Child-Pugh分級(jí)自身免疫性肝炎患者外周血T淋巴細(xì)胞中PD-1、PD-L1表達(dá)情況。

4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 21.0軟件，計(jì)量資料以（）表示，獨(dú)立樣本采用t檢驗(yàn)，多樣本計(jì)量資料采用單因素方差分析與SNK-q檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以“例/%”表示，采用χ2檢驗(yàn)；采用Pearson相關(guān)性分析法分析外周血T淋巴細(xì)胞中PD-1、PD-L1表達(dá)水平與肝功能指標(biāo)的相關(guān)性；P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1一般資料 三組在性別、年齡方面比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；疾病組與肝血管瘤組的病程比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；疾病組與肝血管瘤組的病情嚴(yán)重程度、肝功能Child-Pugh分級(jí)方面比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 一般資料比較

2疾病組、肝血管瘤組、對(duì)照組外周血T淋巴細(xì)胞中PD-1、PD-L1表達(dá)水平 疾病組外周血CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞中的PD-1、PD-L1表達(dá)率均明顯高于肝血管瘤組與對(duì)照組（P＜0.05）；肝血管瘤組與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；見(jiàn)表2。

表2 各組外周血T淋巴細(xì)胞中PD-1、PD-L1表達(dá)水平比較（，%）

表2 各組外周血T淋巴細(xì)胞中PD-1、PD-L1表達(dá)水平比較（，%）

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與肝血管瘤組比較，bP＜0.05。

3輕、中、重度自身免疫性肝炎患者外周血T淋巴細(xì)胞中PD-1、PD-L1表達(dá)水平 外周血CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞中PD-1、PD-L1表達(dá)率在輕度、中度、重度自身免疫性肝炎患者中逐漸升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表3和圖1-4。另對(duì)照組、肝血管瘤組外周血T淋巴細(xì)胞中PD-1、PD-L1表達(dá)情況分別見(jiàn)圖5、圖6。

圖1 輕、中、重度患者PD-1/CD4+表達(dá)水平（橫坐標(biāo)均表示CD4+T淋巴細(xì)胞，縱坐標(biāo)均表示PD-1表達(dá)情況）

圖2 輕、中、重度患者PD-1/CD8+表達(dá)水平（橫坐標(biāo)均表示CD8+T淋巴細(xì)胞，縱坐標(biāo)均表示PD-1表達(dá)情況）

圖3 輕、中、重度患者PD-L1/CD4+表達(dá)水平（橫坐標(biāo)均表示CD4+T淋巴細(xì)胞，縱坐標(biāo)均表示PD-L1表達(dá)情況）

圖4 輕、中、重度患者PD-L1/CD8+表達(dá)水平（橫坐標(biāo)均表示CD8+T淋巴細(xì)胞，縱坐標(biāo)均表示PD-L1表達(dá)情況）

圖5 對(duì)照組外周血CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞中PD-1、PD-L1表達(dá)水平（橫坐標(biāo)分別表示CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞，縱坐標(biāo)分別表示PD-1、PD-L1表達(dá)情況）

圖6 肝血管瘤組外周血CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞中PD-1、PD-L1表達(dá)水平（橫坐標(biāo)分別表示CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞，縱坐標(biāo)分別表示PD-1、PD-L1表達(dá)情況）

表3 不同疾病程度患者外周血T淋巴細(xì)胞中PD-1、PD-L1表達(dá)水平比較（，%）

表3 不同疾病程度患者外周血T淋巴細(xì)胞中PD-1、PD-L1表達(dá)水平比較（，%）

注：與輕度比較，aP＜0.05；與中度比較，bP＜0.05。

4疾病組、肝血管瘤組、對(duì)照組肝功能相關(guān)指標(biāo)水平 疾病組血清TBIL、DBIL、IBIL、ALT、AST、GGT、ALP水平均明顯高于肝血管瘤組與對(duì)照組（P＜0.05），TP、ALB水平均低于肝血管瘤組與對(duì)照組（P＜0.05）；肝血管瘤組肝功能相關(guān)指標(biāo)水平與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；見(jiàn)表4。

表4 各組肝功能相關(guān)指標(biāo)水平比較（）

表4 各組肝功能相關(guān)指標(biāo)水平比較（）

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與肝血管瘤組比較，bP＜0.05。

5自身免疫性肝炎患者外周血T淋巴細(xì)胞中PD-1、PD-L1表達(dá)與肝功能指標(biāo)的相關(guān)性 經(jīng)Pearson相關(guān)性分析，自身免疫性肝炎患者外周血CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞中的PD-1、PD-L1表達(dá)率與TBIL、DBIL、IBIL、ALT、AST、GGT、ALP水平均呈明顯正相關(guān)（P＜0.05），與TP、ALB水平均呈負(fù)相關(guān)性（P＜0.05），見(jiàn)表5。

表5 自身免疫性肝炎患者外周血T淋巴細(xì)胞中PD-1、PD-L1表達(dá)與肝功能指標(biāo)的相關(guān)性

續(xù)表5

6不同肝功能Child-Pugh分級(jí)自身免疫性肝炎患者外周血T淋巴細(xì)胞中PD-1、PD-L1表達(dá)情況 外周血CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞中PD-1、PD-L1表達(dá)率在自身免疫性肝炎患者肝功能Child-Pugh分級(jí)A、B、C級(jí)中依次升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表6。

表6 不同肝功能Child-Pugh分級(jí)患者外周血T淋巴細(xì)胞中PD-1、PD-L1表達(dá)比較（，%）

表6 不同肝功能Child-Pugh分級(jí)患者外周血T淋巴細(xì)胞中PD-1、PD-L1表達(dá)比較（，%）

注：與A級(jí)比較，aP＜0.05；與B級(jí)比較，bP＜0.05。

討論

自身免疫性肝炎屬于免疫損傷性肝臟疾病，其可進(jìn)展為肝硬化或肝衰竭，嚴(yán)重影響患者生存[10-11]?，F(xiàn)階段，盡管自身免疫性肝炎的發(fā)病機(jī)制仍未完全清楚，但自身免疫異常在其發(fā)病中的作用已得到明確[12-13]。PD-1、PD-L1可抑制T細(xì)胞活化與增殖，對(duì)免疫應(yīng)答具有負(fù)性調(diào)控的作用[14-15]。本研究特探討自身免疫性肝炎患者外周血T淋巴細(xì)胞中PD-1、PD-L1的表達(dá)及其與肝功能的相關(guān)性，以期為臨床工作提供指導(dǎo)。

PD-1屬于免疫細(xì)胞負(fù)性共刺激分子，與其配體PD-L1相結(jié)合后，能夠傳入抑制信號(hào)而對(duì)T淋巴細(xì)胞活化與增殖發(fā)揮抑制作用[16]。PD-1/PD-L1信號(hào)通路在淋巴細(xì)胞免疫應(yīng)答的初始部位及效應(yīng)階段具有雙重作用，可適時(shí)阻止過(guò)強(qiáng)的免疫應(yīng)答，以維持免疫功能穩(wěn)定，從而可避免發(fā)生自身免疫性疾病[17-18]。本研究中，自身免疫性肝炎外周血CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞中的PD-1、PD-L1表達(dá)率均較健康人群與肝血管瘤患者高，且隨病情加重而逐漸升高，此與理論上PD-1、PD-L1在自身免疫性疾病中應(yīng)表達(dá)下調(diào)不相符合，可能是因在機(jī)體效應(yīng)T淋巴細(xì)胞激活的同時(shí)，雖然PD-1、PD-L1表達(dá)逐漸增多，但表達(dá)PD-1與PD-L1的CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞的增殖能力卻出現(xiàn)下降的情況，并未達(dá)到下調(diào)免疫應(yīng)答和抑制自身免疫的效果，考慮其升高可能是機(jī)體對(duì)自身免疫的一種代償，通過(guò)增加PD-1、PD-L1的表達(dá)以實(shí)現(xiàn)負(fù)調(diào)控T淋巴細(xì)胞的目的，抑制過(guò)強(qiáng)的免疫反應(yīng)而造成的肝細(xì)胞損傷，但該自身代償反應(yīng)作用有限，增高的PD-1、PD-L1對(duì)免疫反應(yīng)的下調(diào)并不足以阻止疾病的進(jìn)一步發(fā)展[19-20]；亦可能是正性刺激過(guò)強(qiáng)，超過(guò)了PD-1/PD-L1通路的負(fù)性抑制作用，或是該通路在共刺激通路中發(fā)生了功能障礙，促使免疫耐受失衡，不能發(fā)揮抑制性調(diào)控免疫反應(yīng)的作用，導(dǎo)致病變發(fā)生[21-22]。PD-1/PD-L1通路并不能夠?qū)罨疶細(xì)胞增殖分化的速度與強(qiáng)度進(jìn)行有效控制，最終導(dǎo)致了自身免疫性肝炎的發(fā)生[23]。芮志蓮[24]研究報(bào)道，自身免疫性肝炎患者外周血CD8+T細(xì)胞PD-1表達(dá)水平較健康人群明顯升高，與本研究結(jié)果相似。另熊克宮等[25]研究表明，Ⅰ型自身免疫性肝炎患者外周血CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞PD-L1的表達(dá)均高于健康者，此與本研究結(jié)果相一致。另本研究中，疾病組血清TBIL、DBIL、IBIL、ALT、AST、GGT、ALP水平均較對(duì)照組與肝血管瘤組明顯升高，而TP、ALB水平較對(duì)照組與肝血管瘤組降低，表明自身免疫性肝炎患者存在肝功能受損情況。肝細(xì)胞壞死是自身免疫性肝炎的主要病理特征之一，可導(dǎo)致肝功能降低[26-27]。肝血管瘤屬于肝臟良性腫瘤，一般對(duì)肝功能無(wú)影響，肝功能通常在正常狀態(tài)。

此外，本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，自身免疫性肝炎患者外周血CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞中的PD-1、PD-L1均與TBIL、DBIL、IBIL、ALT、AST、GGT、ALP水平均呈明顯正相關(guān)，而與TP、ALB水平呈負(fù)相關(guān)性，另其在自身免疫性肝炎患者肝功能Child-Pugh分級(jí)A、B、C級(jí)中均依次升高，表明外周血CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞中的PD-1、PD-L1表達(dá)與自身免疫性肝炎患者肝功能密切相關(guān)。當(dāng)自身免疫性肝炎進(jìn)展時(shí)，為維持免疫耐受狀態(tài)，機(jī)體過(guò)表達(dá)PD-1、PD-L1，以發(fā)揮負(fù)性調(diào)控T淋巴細(xì)胞的作用，避免過(guò)度免疫反應(yīng)所致的肝細(xì)胞損傷[28-30]。相關(guān)研究[31]表明，自身免疫性肝炎患者肝組織中PD-L1的表達(dá)與肝功能指標(biāo)TBIL、ALT、GGT、ALP水平呈正相關(guān)，此與本研究結(jié)果相一致。PD-1、PD-L1在自身免疫性肝炎發(fā)病進(jìn)展中具有重要作用，與肝功能密切相關(guān)，此對(duì)臨床治療具有一定的指導(dǎo)作用。

綜上，自身免疫性肝炎患者外周血CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞中PD-1、PD-L1表達(dá)均升高，且與肝功能關(guān)系密切。本研究的創(chuàng)新之處在于通過(guò)對(duì)外周血T淋巴細(xì)胞中PD-1、PD-L1表達(dá)情況與自身免疫性肝炎患者肝功能關(guān)系的探索分析，為臨床疾病進(jìn)展的預(yù)測(cè)與治療提供了指導(dǎo)，可作為評(píng)估機(jī)體是否存在一定程度的免疫紊亂的參考指標(biāo)，并有助于推動(dòng)自身免疫性肝炎抑炎和免疫調(diào)節(jié)治療新策略的發(fā)展。但本研究尚存在一定的不足，納入研究的樣本量相對(duì)較少，并未對(duì)外周血T淋巴細(xì)胞中PD-1、PD-L1影響肝功能的具體機(jī)制進(jìn)行探討分析，且因PD-1、PD-L1在機(jī)體內(nèi)的表達(dá)具有廣泛性，后續(xù)仍需擴(kuò)大樣本量進(jìn)行深層次的研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突