血清白介素-10、胸苷激酶1在急性淋巴細(xì)胞白血病患兒中的表達(dá)及與危險(xiǎn)度分層的相關(guān)性

宋春艷 林云碧 雷慶齡 呂瑜 肖祖剛

急性淋巴細(xì)胞白血?。╝cute lymphoblastic leukemia，ALL）是一種惡性克隆性疾病，該疾病的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，臨床多認(rèn)為與基因改變、遺傳因素等密切相關(guān)[1]。目前，臨床對(duì)于ALL的治療手段較多，包括化療、造血干細(xì)胞移植及免疫治療等，但ALL仍具有一定的復(fù)發(fā)及病死風(fēng)險(xiǎn)[2]。研究指出，臨床依據(jù)ALL患兒病情、治療反應(yīng)等情況，可將患兒分為低危、中危和高危3種危險(xiǎn)度分層，在治療前進(jìn)行充分的危險(xiǎn)度分層，對(duì)于選擇合理的治療路徑尤為重要[3]。因此，積極探討分析與ALL患兒危險(xiǎn)度分層相關(guān)的指標(biāo)，有利于準(zhǔn)確判斷患兒病情，并為后續(xù)治療提供新思路，更有助于后續(xù)治療方案的優(yōu)化。相關(guān)研究指出，細(xì)胞免疫功能在ALL的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮關(guān)鍵性作用[4]。血清白介素（Interleukin，IL）-10是一種多細(xì)胞源、多功能的細(xì)胞因子，可參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長與分化、炎性反應(yīng)和免疫反應(yīng)等病理生理過程，在急性白血病患者中存在明顯異常[5]。另有研究指出，骨髓異常增殖與ALL發(fā)病有關(guān)[6]。胸苷激酶1（thymidine kinase 1，TK1）是一種在分裂的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的激酶，可參與催化胸苷磷酸化補(bǔ)救途徑，是細(xì)胞增殖的標(biāo)志物，主要用于檢測體內(nèi)細(xì)胞異常增殖速度[7]。因此，結(jié)合IL-10、TK1與免疫功能、細(xì)胞增殖的關(guān)系，推測IL-10、TK1在ALL患兒中存在異常表達(dá)，且與患兒危險(xiǎn)度分層存在一定的關(guān)系。基于此，本研究重點(diǎn)分析血清IL-10、TK1在ALL患兒中的表達(dá)及其與患兒危險(xiǎn)度分層的相關(guān)性，為病情評(píng)估提供依據(jù)，并為后續(xù)ALL治療提供新的靶點(diǎn)。

資料與方法

1樣本量計(jì)算 參照下列樣本量公式估算樣本量：，其中n代表總樣本量，P代表總體比例的估計(jì)值，δ代表總體比例估計(jì)值的容許誤差；經(jīng)查閱文獻(xiàn)獲取估計(jì)值，ALL發(fā)病率為0.35%，檢驗(yàn)方式為雙側(cè)檢驗(yàn)，α（檢驗(yàn)水準(zhǔn)）為0.05，μα取1.96，容許誤差為1.5%，得出最小樣本量為60例，以失訪率為20%計(jì)算，則最少需要71例樣本，故本研究共納入100例患兒進(jìn)行研究。

2一般資料 研究實(shí)施已獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)同意。選取2018年5月～2021年5月醫(yī)院收治的100例ALL患兒作為研究對(duì)象，全部患兒家屬對(duì)研究內(nèi)容知情，且簽署同意書。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）ALL符合《兒童急性淋巴細(xì)胞白血病診療建議（第四次修訂）》[8]中相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)，且經(jīng)骨髓象、血液檢查等確診；（2）年齡≤16歲；（3）新發(fā)ALL。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）伴有心、肝、腎等臟器功能不全；（2）伴有先天性心臟?。唬?）既往有放療、化療和生物學(xué)治療史；（4）合并其他惡性腫瘤；（5）繼發(fā)性免疫缺陷??；（6）伴有唐氏綜合征；（7）合并其他血液系統(tǒng)疾病和自身免疫性疾病的患兒；（8）伴有視力、聽力等障礙；（9）預(yù)計(jì)生存期≤3個(gè)月；（10）伴有神志不清或精神障礙患兒；（11）成熟B細(xì)胞型ALL。100例患兒中男60例，女40例；年齡1～12歲，平均年齡（5.81±0.46）歲；身高67～161 cm，平均身高（112.51±8.79）cm；體重6～56 kg，平均體重（31.06±3.51）kg。

3方法

3.1治療方法：參照《兒童急性淋巴細(xì)胞白血病診療建議（第四次修訂）》中相關(guān)內(nèi)容，全部患兒在確診后均接受VDLP（B-ALL）或VDLD（T-ALL）治療方案，VDLP方案內(nèi)容包括長春新堿[靜脈注射，1.5 mg/（m2·d），d8，d15，d22，d29]、柔紅霉素[靜脈滴注，30 mg/（m2·d），LR：d8，d15，IR和HR：d8，d15，d22，d29]、培門冬酶，肌注，2 500 IU/（m2·d），d9、d23共2次；潑尼松，口服，60 mg/（m2·d），d1～d28]治療。VDLD方案包括長春新堿[靜脈注射，1.5 mg/（m2·d），d8，d15，d22，d29]、柔紅霉素[靜脈滴注，30 mg/（m2·d），LR：d8，d15，IR和HR：d8，d15，d22，d29]、培門冬酶，肌注，2 500 IU/（m2·d），d9、d23共2次；潑尼松，口服，60 mg/（m2·d），d1～d7和地塞米松6 mg/（m2·d），d8～d28，口服，d29起用藥量每2天減半，1周內(nèi)減停]治療。低度、中度和高度危險(xiǎn)：鞘注甲氨蝶呤d1，三聯(lián)鞘注d15，d33。

3.2ALL患兒的危險(xiǎn)度分層判定及分組方法：參照《國家臨床路徑》[9]中相關(guān)內(nèi)容，將全部患兒分為標(biāo)危組、中危組和高危組。判定標(biāo)準(zhǔn)：標(biāo)危組必須同時(shí)滿足以下所有條件：（1）年齡≥1歲且＜10歲；（2）白細(xì)胞計(jì)數(shù)（white blood cell，WBC）＜50×109/L；（3）非急性T淋巴細(xì)胞白血??；（4）非成熟B細(xì)胞型ALL；（5）無t（9；22）或BCR/ABL融合基因；無t（4；11）或MLL/AF4融合基因；無t（1；19）或E2A/PBX1融合基因；（6）治療第15天骨髓呈M1（原幼淋細(xì)胞＜5%）或M2（原幼淋細(xì)胞5%～25%），第33天骨髓完全緩解。中危必須同時(shí)滿足以下4個(gè)條件：（1）無t（9；22）或BCR/ABL融合基因；（2）中樞白血病或和睪丸白血??；（3）標(biāo)危誘導(dǎo)緩解治療第15天骨髓呈M3（原幼淋細(xì)胞＞25%）或中危誘導(dǎo)緩解治療第15天骨髓呈M1/M2；（4）如有條件進(jìn)行微小殘留病檢測，則第33天危險(xiǎn)殘留病＜10-2。同時(shí)至少符合以下條件之一：（1）WBC≥50×109/L；（2）年齡≥10歲；（3）急性T淋巴細(xì)胞白血??；（4）t（1；19）或E2A/PBX1融合基因陽性；（5）年齡＜1歲且無MLL基因重排。高危必須滿足下列條件之一：（1）t（9；22）或BCR/ABL融合基因陽性；（2）t（4；11）或MLL/AF4融合基因陽性；（3）中危誘導(dǎo)緩解治療第15天骨髓呈M3；（4）第33天骨髓形態(tài)學(xué)未緩解（＞5%），呈M2/M3；（5）如有條件進(jìn)行微小殘留病檢測，則第33天危險(xiǎn)殘留病≥10-2，或第12周危險(xiǎn)殘留病≥10-3。

3.3基線資料調(diào)查方法：由研究人員設(shè)計(jì)一般資料調(diào)查問卷，詢問患兒家屬，記錄相關(guān)內(nèi)容：（1）性別；（2）年齡；（3）身高、體重（可從病案室調(diào)取患兒身高、體重）。

3.4實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)檢測方法：全部患兒均于初診當(dāng)天采集靜脈血8 mL，分為4支試管。（1）血常規(guī)：取1支試管標(biāo)本，使用日本希森美康XS-800i血細(xì)胞分析儀測定血紅蛋白（hemoglobin，Hb）、WBC、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)（red blood cell count，RBC）及血小板（blood platelet，PLT）。（2）IL-10：取1支試管標(biāo)本，經(jīng)離心機(jī)進(jìn)行離心處理（離心速度3 000 r/min，離心10 min，離心半徑15 cm），離心后取血清待檢。使用上海酶聯(lián)的試劑盒，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法測定IL-10水平。（3）TK1：取1支試管標(biāo)本，經(jīng)離心機(jī)進(jìn)行離心處理（3 500 r/min，5 min，15 cm），離心后取血清待檢。使用海西唐生物科技有限公司的試劑盒，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法測定TK1水平。（4）凝血功能：取1支試管樣本，經(jīng)離心機(jī)進(jìn)行離心處理（3 000 r/min，10 min，15 cm），離心完畢后取血漿待檢。使用深圳市美思康的US-2200血液分析儀測定活化部分凝血酶原時(shí)間（activated partial thromboplastin time，APTT）、纖維蛋白原（fibrinogen，F(xiàn)IB）、凝血酶時(shí)間（thrombin time，TT）、凝血酶原時(shí)間（prothrombin time，PT）水平。

4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS24.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，全部計(jì)量資料均經(jīng)Shapiro-Wilk正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的資料以表示，組間用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用百分比表示，采用χ2檢驗(yàn)；若期望值＜5，則采用連續(xù)校正卡方檢驗(yàn)；血清IL-10、TK1表達(dá)與ALL患兒危險(xiǎn)度分層之間的相關(guān)性采用Kendall's tau-b相關(guān)性檢驗(yàn)；血清IL-10、TK1表達(dá)與ALL患兒危險(xiǎn)度分層的關(guān)系采用Logistic回歸分析檢驗(yàn)；P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1ALL患兒危險(xiǎn)度分層情況 全部患兒均接受危險(xiǎn)度分層評(píng)估，其中24例標(biāo)危，50例中危，26例高危，占比分別為24.00%（24/100），50.00%（50/100），26.00%（26/100）。

23組基線資料對(duì)比 3組患兒基線資料對(duì)比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 3組基線資料對(duì)比

33組患兒實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)檢測 全部ALL患兒的平均IL-10、TK1表達(dá)分別為（9.81±2.94）pg/mL、（4.79±1.35）pmol/L；高危組的IL-10、TK1及WBC計(jì)數(shù)均高于標(biāo)危組和中危組，且組間兩兩比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 3組患兒實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)對(duì)比（）

表2 3組患兒實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)對(duì)比（）

注：與標(biāo)危組對(duì)比，aP＜0.05；與中危組對(duì)比，bP＜0.05。

4血清IL-10、TK1及WBC計(jì)數(shù)與ALL患兒危險(xiǎn)度分層的相關(guān)性分析 采用Kendall's tau-b相關(guān)性分析結(jié)果顯示，ALL患兒血清IL-10、TK1及WBC計(jì)數(shù)與危險(xiǎn)度分層之間呈正相關(guān)（r＞0，P＜0.05）。見表3。

表3 血清IL-10、TK1及WBC計(jì)數(shù)與ALL患兒危險(xiǎn)度分層的之間的相關(guān)性分析

5血清IL-10、TK1及WBC計(jì)數(shù)與ALL患兒危險(xiǎn)度分層關(guān)系的多元Logistic回歸分析 將血清IL-10、TK1及WBC計(jì)數(shù)作為自變量，將ALL患兒危險(xiǎn)度分層作為因變量（1=標(biāo)危，2=中危，3=高危），建立多元Logistic回歸分析結(jié)果顯示，血清IL-10、TK1及WBC計(jì)數(shù)與ALL患兒危險(xiǎn)度分層有關(guān)（P＜0.05）。相關(guān)參數(shù)見表4。

表4 血清IL-10、TK1及WBC計(jì)數(shù)與ALL患兒危險(xiǎn)度分層關(guān)系的多元Logistic回歸分析結(jié)果

討論

作為兒童群體中高發(fā)的惡性血液腫瘤，ALL約占全部白血病類型的70%，具有起病急驟、病程短及進(jìn)展迅速等特點(diǎn)，存在發(fā)生感染、貧血、出血等風(fēng)險(xiǎn)[10]。目前，經(jīng)過規(guī)范化的診治，ALL患兒的長期無事件生存率已增長至70%～80%，但仍有少數(shù)部分患兒臨床治療效果不理想，發(fā)生難治、復(fù)發(fā)等，對(duì)患兒預(yù)后產(chǎn)生不良影響[11]。臨床既往通常采用WBC計(jì)數(shù)、原始/幼稚細(xì)胞比例、遺傳學(xué)等指標(biāo)判斷ALL患兒病情、預(yù)后等情況，已成為臨床公認(rèn)指標(biāo)[12]。但為了更好地評(píng)估ALL患兒病情和預(yù)后，仍需積極尋找其他與ALL發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)的生物分子標(biāo)志物，或可為后續(xù)治療提供新的靶點(diǎn)。

研究指出，機(jī)體免疫功能在白血病的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮關(guān)鍵性作用，免疫功能異常不僅是白血病發(fā)病的重要原因之一，也會(huì)造成白血病患者體內(nèi)的細(xì)胞因子分泌失衡[13]。IL-10是由輔助性T淋巴細(xì)胞（T helper cells，Th）2合成、分泌的一種細(xì)胞因子，可抑制抗原已致敏的CD4+Th0細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化，進(jìn)而促使Th0細(xì)胞向Th2方向分化，減弱Th1細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的能力，從而抑制機(jī)體免疫功能，在腫瘤等疾病的發(fā)生、發(fā)展中占據(jù)重要角色[14]。另有研究指出，白血病進(jìn)展過程中因克隆性白血病細(xì)胞的增殖失控、分化障礙及凋亡受阻等多種作用機(jī)制，導(dǎo)致骨髓或其他造血組織中的白血病細(xì)胞大量增殖，影響機(jī)體正常造血功能，進(jìn)而引發(fā)疾病相關(guān)癥狀[15]。B系或T系淋巴細(xì)胞大量增殖是ALL的顯著特征，患兒WBC計(jì)數(shù)明顯升高，且極易發(fā)生眼、中樞神經(jīng)系統(tǒng)等髓外浸潤，增加預(yù)后不良的風(fēng)險(xiǎn)[16]。而TK1是一種細(xì)胞周期依賴性標(biāo)志物，主要存在于增殖細(xì)胞質(zhì)中，有研究表明TK1與細(xì)胞的增殖密切相關(guān)，其能夠敏感反映細(xì)胞增殖異常，動(dòng)態(tài)評(píng)估細(xì)胞增殖發(fā)展趨勢，可用于評(píng)估腫瘤增殖速度和分期，與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)[17]。既往研究證明，細(xì)胞的增殖速度、DNA的合成與TK1水平變化呈正相關(guān)，TK1在細(xì)胞分裂的G1期濃度較低，在G1和S期交界處開始逐漸升高，直至S/G2期達(dá)到高峰[18]。因此，本研究試圖通過測定有關(guān)免疫功能和細(xì)胞增殖的血清指標(biāo)IL-10、TK1水平，研究二者與ALL患兒危險(xiǎn)度分層的關(guān)系。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高危組的IL-10、TK1水平均高于標(biāo)危組和中危組，ALL患兒血清IL-10、TK1水平與危險(xiǎn)度分層之間呈正相關(guān)，表明ALL患兒的血清IL-10、TK1水平存在異常變化，且血清IL-10、TK1水平與不同危險(xiǎn)度分層的ALL患兒存在一定的關(guān)系。究其原因：當(dāng)IL-10水平升高時(shí)，機(jī)體免疫功能受到抑制，免疫監(jiān)控能力降低，極易促使白血病細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸，與ALL的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)[19]。并且，IL-10可抑制炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞對(duì)免疫無應(yīng)答，增加免疫功能缺陷的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，促進(jìn)ALL的發(fā)生與發(fā)展[20]。TK1與細(xì)胞增殖速度有關(guān)，當(dāng)其水平增加時(shí)，則提示細(xì)胞增殖分裂旺盛，淋巴細(xì)胞具有更強(qiáng)的增殖能力和侵襲能力，ALL患兒的危險(xiǎn)度分層越高[21]。最后，本研究多元Logistic回歸分析結(jié)果顯示，以高危為參照，血清IL-10、TK1表達(dá)降低時(shí)，ALL患兒危險(xiǎn)度分層低的可能性分別為7.128倍、13.572倍，進(jìn)一步證實(shí)，血清IL-10、TK1與ALL患兒危險(xiǎn)度分層密切相關(guān)。未來或可將血清IL-10、TK1作為評(píng)估ALL病情與預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物，有較好的應(yīng)用前景。但本研究也存在一定的局限性，如血清IL-10、TK1二者能否相互作用、相互影響，促進(jìn)ALL的發(fā)生和發(fā)展，其中機(jī)制尚未完全明確，未來仍需開展更多的研究進(jìn)一步探索、分析。

綜上所述，血清IL-10、TK1在ALL患兒中存在異常表達(dá)，且與危險(xiǎn)度分層具有相關(guān)性，聯(lián)合傳統(tǒng)WBC計(jì)數(shù)、原始/幼稚細(xì)胞比例等檢測有助于更加準(zhǔn)確評(píng)估ALL患兒的病情，同時(shí)也為了解ALL的發(fā)病機(jī)制和ALL的靶向治療提供新的思路。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突