絕經(jīng)期H型高血壓大鼠模型的建立*

謝 容，陳 建，陳 鍵，洪秀琴，2△

(1.湖南師范大學(xué)附屬第一醫(yī)院/湖南省人民醫(yī)院科研部，長(zhǎng)沙 410005；2.湖南省分子流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙 410013；3.湖南省湘潭市疾病預(yù)防控制中心 411199)

原發(fā)性高血壓伴血漿同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)升高(Hcy>10 μmol/L)稱為H型高血壓[1]，約占總高血壓人群的80%[2]，H型高血壓患者罹患心腦血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)較單純?cè)l(fā)性高血壓增加。研究表明，H型高血壓患者腦卒中發(fā)生率為單純?cè)l(fā)性高血壓患者的12.7倍[3]，心肌梗死發(fā)生率為單純?cè)l(fā)性高血壓患者的5倍[4]。女性進(jìn)入絕經(jīng)期，體內(nèi)雌激素水平持續(xù)下降，影響內(nèi)皮功能的正常調(diào)節(jié)，內(nèi)皮依賴性血管舒張降低，引起血壓明顯波動(dòng)[5]。絕經(jīng)期高血壓患者伴發(fā)高同型半胱氨酸血癥(hyperhomocysteinemia，HHcy)使病情控制難度增大，同時(shí)還增加心血管疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。目前的動(dòng)物研究以H型高血壓大鼠模型和雌激素匱乏型高血壓模型為主，鮮有對(duì)絕經(jīng)期H型高血壓模型的探索。因此，本研究通過(guò)將H型高血壓大鼠模型和雌激素匱乏模型整合，探索絕經(jīng)期H型高血壓動(dòng)物模型的建立方法，并探討其可行性，從而為更好地研究這一特殊群體的病理生理特點(diǎn)提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雌性無(wú)特殊病原體(SPF)級(jí)自發(fā)性高血壓(SHR)大鼠27只(北京維通利華公司)，6～8周齡，體重160～180 g。動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(京)2016-0006。

1.1.2藥品與試劑

DL-蛋氨酸粉末(張家港市華昌藥業(yè)有限公司)；2%蛋氨酸飲水(2 g DL-蛋氨酸粉末加入雙蒸水定容至100 mL制備)。

1.1.3實(shí)驗(yàn)儀器

BP-300A全自動(dòng)大鼠無(wú)創(chuàng)血壓監(jiān)測(cè)儀(成都泰盟軟件有限公司)；日立7600生化分析儀(日本HITACHI公司)，安圖A2000化學(xué)發(fā)光儀(鄭州安圖生物工程股份有限公司)，湘儀H1650R離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

SHR大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，分為con組、2%met組和ovx+2%met組，各9只。con組為正常對(duì)照組，進(jìn)行假手術(shù)，普通飲水；2%met組為H型高血壓模型組，進(jìn)行假手術(shù)，飲用2%蛋氨酸水；ovx+2%met組為絕經(jīng)期H型高血壓模型組，進(jìn)行雙側(cè)卵巢切除術(shù)，給予2%蛋氨酸水。

1.2.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的制備

適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，各組大鼠在無(wú)菌條件下進(jìn)行腹腔麻醉注射。動(dòng)物備皮后，ovx+2%met組采用背部雙切口進(jìn)行大鼠雙側(cè)卵巢切除，假手術(shù)組(con組和2%met組)則在粉色卵巢組織周邊切除同等大小的脂肪。術(shù)后采用紅霉素抗感染處理。傷口愈合后，2%met組和ovx+2%met組用2%蛋氨酸水喂養(yǎng)，con組喂養(yǎng)普通飲用水。

1.2.3飲水量的記錄

以7 d為1個(gè)周期，每個(gè)周期第1天在大鼠飲水瓶加入250 mL水，1周后測(cè)量剩余飲水量，獲得大鼠的周飲水量，連續(xù)收集12周。

1.2.4大鼠收縮壓(SBP)的測(cè)量

利用BP-300A全自動(dòng)大鼠無(wú)創(chuàng)血壓監(jiān)測(cè)儀收集喂養(yǎng)后第2、4、6、8、10、12周的SBP。測(cè)量血壓前預(yù)熱無(wú)創(chuàng)血壓檢測(cè)儀，進(jìn)行系統(tǒng)漏氣檢測(cè)。根據(jù)大鼠體重采用不同固定器固定。待大鼠平穩(wěn)安靜后，將鼠尾插入加壓套至尾巴根部，將鼠尾脈搏傳感器置于鼠尾上1/3尾動(dòng)脈處。

1.2.5血生化指標(biāo)檢測(cè)

通過(guò)眼眶采血的方式收集大鼠血液標(biāo)本后送至湖南省人民醫(yī)院馬王堆院區(qū)檢驗(yàn)科進(jìn)行血生化指標(biāo)的檢測(cè)。利用安圖安圖A2000化學(xué)發(fā)光儀在喂養(yǎng)后第2周檢測(cè)雌二醇(E2)水平；利用日立7600生化分析儀在喂養(yǎng)第6、10、12周檢測(cè)Hcy水平，在喂養(yǎng)第12周檢測(cè)血漿葡萄糖(BS)、總蛋白(TP)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)和高密度脂蛋白(HDL)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠周飲水量比較

3組平均周飲水量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=173.46，P<0.01)，且2%met組與ovx+2%met組周飲水量均明顯小于con組(P<0.01)，而2%met組與ovx+2%met組周飲水量無(wú)明顯差異(P>0.05)，見圖1。

2.2 各組大鼠血清Hcy水平比較

不同喂養(yǎng)時(shí)間各組間大鼠血清Hcy水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；喂養(yǎng)第6周，ovx+2%met組大鼠血清Hcy水平明顯高于con組和2%met組(P<0.01)，con組與2%met組無(wú)明顯差異(P>0.05)；喂養(yǎng)第10周，ovx+2%met組和2%met組大鼠血清Hcy水平均明顯高于con組(P<0.01)，且ovx+2%met組與2%met組大鼠血清Hcy水平也有明顯差異(P<0.01)；喂養(yǎng)第12周，2%met組和ovx+2%met組大鼠血清Hcy水平均超過(guò)10 μmol/L，ovx+2%met組大鼠血清Hcy水平明顯高于2%met組(P<0.05)，且兩組血清Hcy水平均明顯高于con組(P<0.01)，見表1。

2.3 各組大鼠血清E2水平比較

喂養(yǎng)第2周，3組大鼠血清E2水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=29.990，P<0.01)；ovx+2%met組大鼠血清E2水平明顯低于con組和2%met組(P<0.01)，且con組和2%met組大鼠血清E2水平無(wú)明顯差異(P>0.05)，見圖2。

圖1 大鼠周飲水量曲線圖

表1 各組大鼠不同喂養(yǎng)時(shí)間血清Hcy水平比較

a：P<0.01，與con組相比；b：P<0.01，與2%met組相比。

2.4 各組大鼠不同喂養(yǎng)時(shí)間SBP比較

喂養(yǎng)第8、10、12周，3組大鼠血清SBP水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5.183，P<0.05；F=6.259，P<0.01；F=173.500，P<0.01)；ovx+2%met組與2%met組大鼠SBP在各時(shí)間點(diǎn)均高于con組，且從第8周開始，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或0.01)，ovx+2%met組與2%met組大鼠SBP在各時(shí)間點(diǎn)均無(wú)明顯差異(P>0.05)，見圖3。

a：P<0.01，b：P<0.05，與con組相比。

2.5 各組大鼠生化指標(biāo)水平比較

喂養(yǎng)第12周，3組大鼠血漿TC、HLD水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；2%met組和ovx+2%met組大鼠血漿TC、HDL水平均明顯高于con組(P<0.01)，且ovx+2%met組大鼠血漿TC、HDL水平均明顯高于2%met組(P<0.01或0.05)，見表2。

表2 各組大鼠生化指標(biāo)水平比較

3 討 論

兩側(cè)卵巢手術(shù)切除所致絕經(jīng)稱為人工絕經(jīng)，術(shù)后雌激素水平降低，可出現(xiàn)血管舒縮障礙。雙側(cè)卵巢切除術(shù)由于具有控制因素單一、手術(shù)成功率高和造模結(jié)果穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，目前已被廣泛應(yīng)用于模擬絕經(jīng)導(dǎo)致的雌激素水平匱乏[6-7]。預(yù)實(shí)驗(yàn)與趙梓妍等[8]研究顯示，與經(jīng)腹部的雙側(cè)卵巢切除術(shù)相比，經(jīng)背部雙側(cè)卵巢切除術(shù)所造成的傷口小，輕微剝開切口處脂肪即可看到粉色輸卵管和卵巢組織，避免了探查過(guò)程造成的臨近臟器損害或腸扭轉(zhuǎn)。所以，本實(shí)驗(yàn)采用雌性SHR大鼠經(jīng)背部雙側(cè)卵巢切除術(shù)建立高血壓絕經(jīng)模型。研究結(jié)果表明，與con組和2%met組相比，ovx+2%met組大鼠血清E2水平明顯降低。該現(xiàn)象可反映高血壓女性人工絕經(jīng)后的雌激素水平狀態(tài)。

高蛋氨酸飲食可誘導(dǎo)HHcy的發(fā)生。Hcy是蛋氨酸的中間產(chǎn)物，當(dāng)機(jī)體攝入過(guò)量的蛋氨酸時(shí)，會(huì)影響胱硫醚-β-合成酶的活性，使得胱硫醚合成受阻，Hcy代謝受阻[9]；同時(shí)，蛋氨酸過(guò)量使甜菜堿水平明顯降低，蛋氨酸再生障礙，造成Hcy堆積[10]。在通過(guò)飲食增加蛋氨酸負(fù)荷來(lái)制造HHcy模型的研究中，蛋氨酸常見濃度為0.5%～5.0%，造模成功時(shí)間從2周至3個(gè)月不等。任曉麗等[11]研究表明，SD大鼠給予5%蛋氨酸飲食在第8周時(shí)Hcy水平達(dá)到(10.07±0.09)μmol/L，而給予1%蛋氨酸飲食Hcy水平則為(9.04±0.06)μmol/L；同時(shí)，該研究提示飲食中蛋氨酸濃度>3%可能導(dǎo)致生長(zhǎng)毒性。SHR大鼠是公認(rèn)的模擬人類原發(fā)性高血壓發(fā)病機(jī)制最穩(wěn)定、最具代表的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型[12]。而蛋氨酸飼料屬于特殊飼料，難以獲得，自行制備不易。因此，本實(shí)驗(yàn)采用SHR+2%蛋氨酸飲水構(gòu)建H型高血壓大鼠模型。喂養(yǎng)第12周，2%met組血清Hcy水平達(dá)到(13.07±0.65)μmol/L，ovx+2%met組血清Hcy水平達(dá)到(14.20±1.29)μmol/L。根據(jù)H型高血壓的判定標(biāo)準(zhǔn)(Hcy>10 μmol/L)[1]，SHR大鼠經(jīng)12周2%蛋氨酸飲水能建立穩(wěn)定的H型高血壓大鼠模型。

Hcy水平升高是高血壓的危險(xiǎn)因素之一。Hcy異常升高會(huì)引起內(nèi)皮功能障礙，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞分泌的一氧化氮(NO)生成減少,血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)、 內(nèi)皮素(ET)生成增加。舒血管物質(zhì)減少，縮管物質(zhì)增加，血管舒張功能障礙，使血壓升高[13]。雌激素參與維持血壓調(diào)節(jié)。雌激素能激活血管內(nèi)皮一氧化氮合酶(eNOS)，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞釋放NO并提高其生物利用度；降低AngⅡ水平，調(diào)節(jié)腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)，發(fā)揮穩(wěn)定血壓的作用[14-15]。有研究顯示，卵巢切除加重HHcy大鼠ET表達(dá)，使eNOS生成明顯降低，補(bǔ)充雌激素通過(guò)降低血漿Hcy水平并拮抗eNOS表達(dá)來(lái)減輕HHcy帶來(lái)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損害[16]。曹艷麗等[17]研究報(bào)道，喂養(yǎng)1周后，給予2%蛋氨酸飲水的SHR大鼠SBP明顯高于雙蒸水喂養(yǎng)組(P<0.05)；張志敏等[18]研究表明，從第8周起2%蛋氨酸組與對(duì)照組的SBP比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。本研究結(jié)果表明，2%蛋氨酸喂養(yǎng)的大鼠SBP在各時(shí)間點(diǎn)均高于cos組，且從第8周起，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，與上述文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相似。但是，本研究中大鼠的SBP差異是否因切除卵巢后雌激素水平改變所致尚未能體現(xiàn)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)12周的2%蛋氨酸飲水+SHR大鼠卵巢切除術(shù)成功構(gòu)建了穩(wěn)定的絕經(jīng)期H型高血壓實(shí)驗(yàn)大鼠模型。