霞多麗葡萄營(yíng)養(yǎng)系果實(shí)中酚類和香氣物質(zhì)研究

劉政海，董志剛，李曉梅，譚敏，楊镕兆，賀晉瑜，趙旗峰

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)果樹(shù)研究所,山西省葡萄與葡萄酒工程技術(shù)研究中心,山西 太原, 030031)

葡萄(Vitisvinifera)為多年生藤蔓植物，在我國(guó)有著悠久的葡萄種植歷史[1]，近幾年，我國(guó)從國(guó)外引進(jìn)大量?jī)?yōu)良釀酒品種，但所有的品種，尤其是具有古老起源的品種會(huì)出現(xiàn)品種退化的現(xiàn)象，無(wú)性系選種是指在無(wú)性繁殖的果樹(shù)群體中，為了維持、提升品種原先具有的優(yōu)良形狀對(duì)優(yōu)良植株進(jìn)行選取、繁育的工作[2]。PAGLARANI等[3]從35株葡萄中根據(jù)產(chǎn)量、串重、果實(shí)重、含糖量等指標(biāo)，鑒定出最具發(fā)展?jié)摿Φ?4株?duì)I養(yǎng)系。以湖南省懷化縣的商品葡萄園4個(gè)紅色無(wú)性系和2個(gè)白色無(wú)性系為例，研究發(fā)現(xiàn)高山4號(hào)和白葡萄1號(hào)無(wú)性系中C6和C9揮發(fā)物含量最高[4]。釀酒葡萄品質(zhì)主要取決于葡萄品種及相應(yīng)的生態(tài)條件[5]。營(yíng)養(yǎng)系選種是品種選育的有效方法，與常規(guī)育種方法相比具有成本低、見(jiàn)效快等優(yōu)點(diǎn)[2]。酚類物質(zhì)是葡萄酒最重要的風(fēng)味物質(zhì)之一，且具有生物活性功能[6]。果實(shí)的酚類物質(zhì)組成和含量受生長(zhǎng)條件、品種和果實(shí)成熟度等多種因素影響，但品種的基因型對(duì)其影響超越任何環(huán)境因素[7]。任瑞華等[8]以雷司令和小芒森為材料，發(fā)現(xiàn)高果皮百分比、較小果粒及果實(shí)糖含量高有益于葡萄果實(shí)酚類物質(zhì)的積存。香氣是衡量葡萄果實(shí)和葡萄酒感官品質(zhì)的重要指標(biāo)，葡萄果實(shí)可揮發(fā)性狀態(tài)的香氣主要包括醛、芳香化合物、萜、酯類等，共同作用下形成葡萄酒最終的香氣。

霞多麗(Chardonnay)別名雪當(dāng)利、莎當(dāng)妮等，歐亞種，原產(chǎn)于法國(guó)勃艮第，是世界著名的釀造白葡萄酒的優(yōu)良品種。在許多國(guó)家都有栽培，自1979年從法國(guó)引進(jìn)中國(guó)，近幾年霞多麗在山西、山東、河北、內(nèi)蒙古、新疆等省栽培面積逐漸增加，栽培適宜當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)氣候條件的營(yíng)養(yǎng)系決定著當(dāng)?shù)仄咸丫频钠焚|(zhì)和風(fēng)格，國(guó)內(nèi)外關(guān)于霞多麗葡萄酒品質(zhì)的研究較多[9-10]，對(duì)霞多麗不同營(yíng)養(yǎng)系的成熟果實(shí)香氣以及果實(shí)不同部位在生長(zhǎng)發(fā)育階段的酚類物質(zhì)研究甚少。本試驗(yàn)以霞多麗4個(gè)營(yíng)養(yǎng)系果實(shí)為試驗(yàn)材料，對(duì)各個(gè)營(yíng)養(yǎng)系的成熟果實(shí)的香氣物質(zhì)的種類、含量、香氣活性值以及不同生長(zhǎng)發(fā)育階段的酚類物質(zhì)含量進(jìn)行比較分析，以期選育出適宜黃土高原地區(qū)栽培的最優(yōu)霞多麗葡萄營(yíng)養(yǎng)系，為釀酒葡萄育種材料選擇提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

以霞多麗4個(gè)營(yíng)養(yǎng)系霞多麗76、霞多麗95、霞多麗96、霞多麗277為材料，引種于中法莊園，定植于2010年，以株行距0.8 m×2.5 m種植于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)果樹(shù)研究所釀酒葡萄采穗圃[N37.34°，E112.49°，海拔(846±5) m]，常規(guī)栽培管理，該地區(qū)屬溫帶大陸性季風(fēng)氣候，年均溫10.6 ℃，160～180 d的無(wú)霜期，均為傾斜式單龍蔓“廠”字形立架栽培。霞多麗葡萄果實(shí)分別于盛花后40 d(2020年7月3日)、60 d(2020年7月23日)、80 d(2020年8月12日)、100 d(2020年9月1日)、110 d(達(dá)到生產(chǎn)成熟)進(jìn)行采樣。

氫氧化鈉、正丁醇、碳酸鈉、氯化鉀、甲醇、醋酸鈉、氯化鋁、乙醇、亞硝酸鈉等，均為分析純；4-甲基-2-戊醇、乙醇、單寧酸、兒茶素，均為色譜純。

1.2 儀器與設(shè)備

50/30 μm固相微萃取(solid phase micro extraction, SPME)萃取頭(PDMS/CARDVB)，北京華爾博科技有限責(zé)任公司；7890-5975B氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(gas chromatograph-mass spectrometer，GC-MS)、HP-INNOWAX毛細(xì)管柱，美國(guó)安捷倫公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 果實(shí)性狀調(diào)查

參照《葡萄種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》對(duì)4個(gè)營(yíng)養(yǎng)系成熟果實(shí)基本品質(zhì)性狀的鑒定。

1.3.2 酚類物質(zhì)含量的測(cè)定

采用Folin酚法測(cè)定總酚、單寧含量，用單寧酸等價(jià)表示(mg/g FW)；總類黃酮含量測(cè)定采用氯化鋁比色法，根據(jù)兒茶素(0～100 mg/L)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總類黃酮含量；采用香草醛-鹽酸法測(cè)定黃烷醇，結(jié)果以兒茶素等價(jià)表示(mg/g FW)[11]。

1.3.3 果實(shí)揮發(fā)性香氣物質(zhì)的測(cè)定

1.3.3.1 揮發(fā)性香氣物質(zhì)提取

將葡萄果實(shí)放進(jìn)研缽內(nèi)并且加入液氮，用研磨杵輕微敲碎葡萄使葡萄果實(shí)各部分分離，除去種子、果蒂，取50 g果肉并且往里面加1 g交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮，在液氮作用下，通過(guò)冷凍研磨機(jī)將果肉磨成粉末狀，將其裝入50 mL離心管中，靜置在4 ℃冰箱內(nèi)12 h，每個(gè)重復(fù)裝2管，離心轉(zhuǎn)速為10 000 r/min條件下進(jìn)行15 min，離心2次得到澄清葡萄汁液。

1.3.3.2 SPME及氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(gas chromatograph- mass spectrometer，GC-MS)條件

在樣品瓶中放入澄清葡萄汁液5 mL，加入1 g NaCl、磁力轉(zhuǎn)子和10 μL(4-甲基-2-戊醇)內(nèi)標(biāo)后，蓋上樣品蓋子并且立刻將其放到磁力攪拌加熱臺(tái)上，在40 ℃ 條件下保持30 min后，將活化好的SPME萃取頭插入樣品瓶上部，在40 ℃下吸附30 min后，立即將萃取頭插入GC進(jìn)樣口，在250 ℃溫度下解析8 min。

GC-MS條件：毛細(xì)管柱為60 mm×0.25 mm×0.25 μm，高純氦氣為其載氣，流速為1 mL/min，手動(dòng)進(jìn)樣不分流；程序升溫為50 ℃下1 min后，以3 ℃/min的速度升溫到220 ℃并保持5 min；質(zhì)譜接口溫度為 280 ℃，離子源溫度為230 ℃，電離的方式為EI，電離能為70 eV，掃描范圍為20～350 u。

1.3.3.3 香氣物質(zhì)定性和定量

香氣物質(zhì)定性：根據(jù)GC-MS分離得到的質(zhì)譜全離子掃描圖譜，將與標(biāo)樣一樣的香氣物質(zhì)進(jìn)行定性。對(duì)于沒(méi)有標(biāo)樣的香氣物質(zhì)，將其與己有文獻(xiàn)相似圖譜進(jìn)行比對(duì)，還可使用計(jì)算機(jī)檢索NIST 11標(biāo)準(zhǔn)庫(kù)進(jìn)行半定性。

香氣物質(zhì)定量：根據(jù)葡萄的揮發(fā)性香氣濃度高低，用目標(biāo)香氣的標(biāo)準(zhǔn)品制備香氣物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)果實(shí)中相應(yīng)香氣物質(zhì)進(jìn)行定量，如果香氣物質(zhì)沒(méi)有標(biāo)樣，可以根據(jù)與香氣化合物碳原子數(shù)接近的或者化學(xué)結(jié)構(gòu)接近的標(biāo)樣進(jìn)行半定量。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

利用Excel 2019、SAS 9.2進(jìn)行數(shù)據(jù)分析與繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 霞多麗葡萄營(yíng)養(yǎng)系果實(shí)基本品質(zhì)比較

霞多麗葡萄4個(gè)營(yíng)養(yǎng)系成熟果實(shí)基本品質(zhì)如表1所示，霞多麗95平均穗重、果穗長(zhǎng)寬均顯著高于霞多麗76(P<0.05)；4個(gè)營(yíng)養(yǎng)系果梗長(zhǎng)無(wú)顯著差異。霞多麗277可溶性固形物分別比霞多麗76、霞多麗95、霞多麗96高15.73%(P<0.05)、10.81%(P<0.05)、14.12%(P<0.05)；霞多麗76固酸比、果形指數(shù)顯著高于其他3個(gè)營(yíng)養(yǎng)系；霞多麗277皮肉比為0.23，顯著高于其他3個(gè)營(yíng)養(yǎng)系；霞多麗葡萄4個(gè)營(yíng)養(yǎng)系百粒重為2.45～3.00 g，其中霞多麗76的種子百粒重顯著高于霞多麗95和霞多麗277(P<0.05)；霞多麗96的pH值顯著低于其他3個(gè)營(yíng)養(yǎng)系。

表1 霞多麗葡萄4個(gè)營(yíng)養(yǎng)系果實(shí)基本品質(zhì)Table 1 Basic quality of Chardonnay grape fruit from four clones

2.2 霞多麗葡萄營(yíng)養(yǎng)系果實(shí)酚類物質(zhì)比較

2.2.1 霞多麗葡萄營(yíng)養(yǎng)系果皮和果肉中單寧含量比較

霞多麗4個(gè)營(yíng)養(yǎng)系盛花后不同時(shí)期果皮中單寧含量如圖1-A所示。單寧含量從盛花后40 d至果實(shí)成熟期呈先下降又上升的趨勢(shì)，盛花后40 d時(shí)，霞多麗96果皮中單寧含量為14.23 mg/g，顯著高于其他3個(gè)營(yíng)養(yǎng)系；霞多麗96果皮中單寧含量在5個(gè)發(fā)育期含量均較高，在果實(shí)成熟期霞多麗96果皮中單寧含量顯著高于霞多麗76和霞多麗95。

霞多麗4個(gè)營(yíng)養(yǎng)系果肉中單寧含量如圖1-B所示。4個(gè)營(yíng)養(yǎng)系果肉中單寧含量呈先下降后上升的趨勢(shì)，在盛花后40 d時(shí)，霞多麗277果肉中單寧含量為5.41 mg/g，顯著高于其他3個(gè)營(yíng)養(yǎng)系，霞多麗277在盛花后60、80 d時(shí)下降幅度較大，但在果實(shí)完全成熟時(shí)霞多麗277果肉中單寧含量顯著高于霞多麗76和95。霞多麗95在盛花后100 d，果肉單寧含量為2.24 mg/g，分別比霞多麗76、霞多麗96、霞多麗277高33.89%(P<0.05)、204.70%(P<0.05)、48.21%(P<0.05)。霞多麗96果肉中單寧在盛花后60 d、盛花后80 d、果實(shí)成熟期含量分別為5.39、2.62、3.21 mg/g，顯著高于其他3個(gè)營(yíng)養(yǎng)系。

2.2.2 霞多麗葡萄營(yíng)養(yǎng)系果皮和果肉中總類黃酮含量含量比較

如圖2-A所示，為霞多麗葡萄營(yíng)養(yǎng)系盛花后不同時(shí)期果皮中總類黃酮含量，其中從盛花后40 d起果皮中總類黃酮含量逐漸下降而后又上升的趨勢(shì)。霞多麗4個(gè)營(yíng)養(yǎng)系果皮中總類黃酮含量在各時(shí)期差異基本一致，其中霞多麗96果皮中總類黃酮含量在盛花后40 d、盛花后60 d、盛花后80 d、盛花后100 d和果實(shí)成熟期的含量均顯著高于其他3個(gè)營(yíng)養(yǎng)系。

由圖2-B中霞多麗4個(gè)營(yíng)養(yǎng)系果肉中總類黃酮含量可知，總類黃酮含量從盛花后40 d至果實(shí)成熟期總體呈下降趨勢(shì)。其中霞多麗96果肉中總類黃酮含量在盛花后60 d以及盛花80 d含量分別為0.18、0.13 mg/g，均顯著高于其他3個(gè)營(yíng)養(yǎng)系。在盛花后40 d和果實(shí)成熟期，霞多麗277果肉中總類黃酮含量分別為0.26、0.09 mg/g，均顯著高于其他3個(gè)營(yíng)養(yǎng)系。

2.2.3 霞多麗葡萄營(yíng)養(yǎng)系果皮和果肉中黃烷醇含量比較

霞多麗4個(gè)營(yíng)養(yǎng)系盛花后不同時(shí)期果皮中黃烷醇含量如圖3-A所示，在霞多麗葡萄在成熟的過(guò)程中黃烷醇含量先下降后上升，在盛花后60 d，霞多麗96果皮中黃烷醇含量為11.09 mg/g，顯著高于霞多麗95和霞多麗277。霞多麗96果皮中黃烷醇含量在盛花后40、80、100 d及果實(shí)成熟期顯著高于其他3個(gè)營(yíng)養(yǎng)系。

A-果皮；B-果肉圖1 霞多麗葡萄營(yíng)養(yǎng)系盛花后不同時(shí)期果皮和 果肉中單寧含量Fig.1 Skins and flesh tannin content in clones of Chardonnay grape at different periods注：不同字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

A-果皮；B-果肉圖2 霞多麗葡萄營(yíng)養(yǎng)系盛花后不同時(shí)期果皮和 果肉中總類黃酮含量Fig.2 Skins and flesh total flavonoids content in clones of Chardonnay grape at different periods

霞多麗4個(gè)營(yíng)養(yǎng)系不同時(shí)期果肉中黃烷醇含量如圖3-B所示，霞多麗4個(gè)營(yíng)養(yǎng)系在盛花后40 d時(shí)，果肉中黃烷醇含量較高，在盛花后80～100 d時(shí)果肉中黃烷醇含量降到最低，在果實(shí)成熟期，霞多麗277果肉中黃烷醇含量為0.26 mg/g，分別比霞多麗76、霞多麗95、霞多麗96高73.83%(P<0.05)、171.47%(P<0.05)、35.38%(P<0.05)。

A-果皮；B-果肉圖3 霞多麗葡萄營(yíng)養(yǎng)系不同時(shí)期果皮、果肉中黃烷醇含量Fig.3 Skins and flesh flavanols content in clones of Chardonnay grape at different periods

2.3 霞多麗葡萄營(yíng)養(yǎng)系果實(shí)中香氣比較

2.3.1 霞多麗葡萄營(yíng)養(yǎng)系成熟果實(shí)中香氣物質(zhì)種類

霞多麗葡萄營(yíng)養(yǎng)系成熟期果實(shí)中香氣種類數(shù)如表2所示，霞多麗4個(gè)營(yíng)養(yǎng)系共檢測(cè)到96種香氣化合物，其中在霞多麗76果實(shí)中檢測(cè)到香氣種類最多，為95種。酯類物質(zhì)主要是呈現(xiàn)果香味，具有使葡萄酒中各種香氣物質(zhì)的平衡、融洽、協(xié)調(diào)的狀態(tài)的功能，酯類香氣物質(zhì)在4個(gè)營(yíng)養(yǎng)系果實(shí)中香氣種類最多，其中霞多麗76果實(shí)中酯類香氣種類最多為35種。萜烯類和降異戊二烯類大多具有怡人的果香、花香，是葡萄酒中品種香的主要組分，其對(duì)葡萄酒的香氣有著很大的奉獻(xiàn)，霞多麗76果實(shí)中萜烯及降異戊二烯類物質(zhì)物質(zhì)有17種。

表2 霞多麗葡萄營(yíng)養(yǎng)系成熟期果實(shí)中香氣種類數(shù)Table 2 Number of aroma species in grape clones of Chardonnay at mature stage

2.3.2 霞多麗營(yíng)養(yǎng)系成熟期果實(shí)不同香型香氣活力值(ordor active values，OAVs)比較

圖4所示為霞多麗4個(gè)營(yíng)養(yǎng)系果實(shí)中各香氣類別的OAVs，OAV是香氣成分含量與嗅覺(jué)閾值的比值，霞多麗76水果香OAVs為10.72，分別比霞多麗95、霞多麗96和霞多麗277高78.71%(P<0.05)、74.04%(P<0.05)、76.56%(P<0.05)。霞多麗76果實(shí)中花香值OAVs為28.39，顯著高于其他3個(gè)營(yíng)養(yǎng)系果實(shí)中花香OAVs(P<0.05)。霞多麗4個(gè)營(yíng)養(yǎng)系果實(shí)中植物香和脂肪香差異不顯著，4個(gè)營(yíng)養(yǎng)系植物香OAVs值均在26以上，而4個(gè)營(yíng)養(yǎng)系脂肪香OAVs均低于2。

A-果皮；B-果肉圖4 霞多麗營(yíng)養(yǎng)系成熟期果實(shí)中不同香氣類型香氣活力值Fig.4 Odor active values of different aroma types in Chardonnay clones at mature stage

3 討論

釀酒葡萄果實(shí)的基本品質(zhì)、酚類物質(zhì)、香氣物質(zhì)等指標(biāo)決定釀造葡萄酒的好壞。魏烈權(quán)等[12]通過(guò)測(cè)定葡萄果實(shí)中可溶性糖含量、可滴定酸含量、總酚含量、單寧含量等9項(xiàng)常規(guī)指標(biāo)評(píng)價(jià)嘉峪關(guān)10個(gè)釀酒葡萄品種，測(cè)出黑比諾、佳美、美樂(lè)這3個(gè)品種在嘉峪關(guān)地區(qū)品質(zhì)優(yōu)于其他品種。譚偉等[13]研究發(fā)現(xiàn)白色品種小白玫瑰455在果實(shí)中種果皮的單寧含量高于果肉的單寧含量，這與霞多麗4個(gè)營(yíng)養(yǎng)系在果皮中酚類物質(zhì)高于果肉中酚類物質(zhì)含量結(jié)論相符。不同發(fā)育時(shí)期，果實(shí)中單寧含量差異明顯[14]，霞多麗4個(gè)營(yíng)養(yǎng)系果皮和果肉中單寧含量呈先下降后升高的趨勢(shì)，在后期形成更多的縮合單寧，霞多麗96和霞多麗277在果實(shí)完全成熟時(shí)單寧含量最高，含有不同聚體的單寧分子多，使得釀造的葡萄酒苦澀感更豐富。釀酒葡萄果實(shí)中酚類物質(zhì)含量受品種、環(huán)境等因素影響，品種是其影響果實(shí)中酚類物質(zhì)的主要內(nèi)在因素[15]。張娟等[6]以多種紅色釀酒品種為試材分析了酚類物質(zhì)含量，發(fā)現(xiàn)不同品種間果實(shí)中酚類物質(zhì)含量差異顯著，其中葡萄皮中總酚含量為12～125 mg/100g，果肉中總酚含量為1.24～3.24 mg/100g。本研究表明霞多麗4個(gè)營(yíng)養(yǎng)系果實(shí)酚類物質(zhì)含量存在顯著差異。代紅軍等[16]研究水楊酸對(duì)赤霞珠葡萄白藜蘆醇、總類黃酮含量影響，研究表明，赤霞珠葡萄果皮中總類黃酮含量在幼果期和完熟期較高。本研究中霞多麗4個(gè)營(yíng)養(yǎng)系果皮中總類黃酮含量在盛花后40 d和果實(shí)成熟期含量較高結(jié)論相似。胡麗等[17]在歐亞種和山歐雜種中檢測(cè)到12種黃酮醇物質(zhì)，在雙豐葡萄中只檢測(cè)到4種黃酮醇物質(zhì)，不同品種品系間黃酮醇種類和含量有明顯差異，霞多麗96果皮中和霞多麗277果肉中總類黃酮含量顯著最高，可能存在黃酮種類高于其他2個(gè)營(yíng)養(yǎng)系。溫鵬飛等[18]以赤霞珠為試材研究土壤干旱對(duì)釀酒葡萄果肉中黃烷醇類多酚含量的影響，研究發(fā)現(xiàn)在果實(shí)發(fā)育過(guò)程中果肉中黃烷醇類多酚的積累模式并未受土壤干旱的影響而改變，并且在果實(shí)發(fā)育過(guò)程中黃烷醇類多酚的積累為幼果期含量最高，隨著果實(shí)的發(fā)育而逐漸下降，在果實(shí)成熟期時(shí)略有回升。這與本實(shí)驗(yàn)霞多麗葡萄4個(gè)營(yíng)養(yǎng)系在盛花后果肉中黃烷醇含量逐漸下降又有回升的研究結(jié)果基本一致。

同一產(chǎn)地釀酒葡萄品種不同，香氣組成的種類、含量及比例均存在明顯差異。秦歡等[19]以重慶3個(gè)白葡萄品種成熟果實(shí)研究材料，研究發(fā)現(xiàn)不同品種白葡萄果實(shí)香氣成分及含量、種類差異明顯。ROCHA等[20]以4種白葡萄品種為試材通過(guò)檢測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)不同品種間關(guān)于香氣物質(zhì)的濃度和種類有顯著差異。香氣物質(zhì)的濃度和種類不同使得霞多麗4個(gè)營(yíng)養(yǎng)系同一類香氣OAV不同，從而導(dǎo)致其香氣特征的差異。以意大利釀酒葡萄品種果實(shí)為材料，分析果實(shí)酚類物質(zhì)含量和揮發(fā)性香氣成分，研究發(fā)現(xiàn)7個(gè)品種果實(shí)干果香、脂肪味/奶油味、烘烤味、橡木味和香料味OAV均低于1[21]，這與本實(shí)驗(yàn)中霞多麗4個(gè)營(yíng)養(yǎng)系脂肪香含量較低研究結(jié)果相似。

在果實(shí)成熟期，霞多麗96在果皮中單寧、總類黃酮、黃烷醇的含量?jī)?yōu)于其他營(yíng)養(yǎng)系。霞多麗96果肉中單寧優(yōu)于其他營(yíng)養(yǎng)系。在霞多麗葡萄4個(gè)營(yíng)養(yǎng)系中共測(cè)得96種揮發(fā)性香氣物質(zhì)種類，其中霞多麗76醇類物質(zhì)種類最多，且是檢測(cè)到的香氣種類最為豐富的營(yíng)養(yǎng)系。霞多麗76營(yíng)養(yǎng)系的水果香、花香OAVs均顯著高于其他3個(gè)營(yíng)養(yǎng)系。在黃土高區(qū)產(chǎn)區(qū)，霞多麗96和霞多麗277可作為高酚類物質(zhì)含量的霞多麗營(yíng)養(yǎng)系，霞多麗76可作為具有豐富香氣物質(zhì)種類和含量的營(yíng)養(yǎng)系進(jìn)行栽培。