外用燙療藥對(duì)小鼠的抗炎鎮(zhèn)痛作用研究*

黃 蓓 陳 鋒△ 楊 柯 楊 磊 李潤(rùn)強(qiáng)

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院，廣西 南寧 530011；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530200）

炎性疼痛（inflammatorypain）系在無(wú)外部觸發(fā)因素下的自發(fā)性疼痛，是臨床常見(jiàn)的病理性疼痛，骨關(guān)節(jié)炎痛、跌打腫痛炎癥產(chǎn)生的疼痛則是骨組織、肌肉組織炎癥病變引起的疼痛，是慢性炎性痛的易發(fā)部位。目前，炎性疼痛治療臨床多用抑制疼痛的西藥，一類為麻醉性鎮(zhèn)痛藥物，鎮(zhèn)痛效果雖好，但抗炎作用并不理想，且長(zhǎng)期使用副作用較大［1］；另一類為非甾體類解熱鎮(zhèn)痛藥物，但主要用來(lái)治療輕中度疼痛，對(duì)炎性痛的緩解和治療效果并不好，且存在腎損害、抗血小板凝聚、水腫、誘發(fā)消化道潰瘍等諸多不良反應(yīng)［2］。傳統(tǒng)中藥復(fù)方有著多靶點(diǎn)、不良反應(yīng)少等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，為炎性疼痛的治療提供了新的選擇。近年來(lái)，運(yùn)用中藥熱熨治療骨傷科炎性疼痛特別是寒性炎痛有很多成功病例［3-9］。

“燙療藥”是由筆者所在醫(yī)院全國(guó)名老中醫(yī)、全國(guó)名老中醫(yī)藥專家第二批帶徒導(dǎo)師李桂文教授擬方的院內(nèi)中藥制劑，具有獨(dú)特的壯瑤醫(yī)特色。燙療藥屬于典型的中藥熱熨制劑，用時(shí)可反復(fù)蒸熱熨燙敷于患處，也可置熱跌打藥酒中反復(fù)燙洗。全方具活血化瘀、溫通經(jīng)脈、抗炎鎮(zhèn)痛止痹之功，可用于骨關(guān)節(jié)炎痛、風(fēng)濕骨痛、坐骨神經(jīng)痛、跌打腫痛、腰及頸椎增生引起的疼痛等［10-13］。本研究通過(guò)小鼠熱板法、小鼠扭體法、小鼠耳郭腫脹法、小鼠足跖腫脹法、小鼠棉球植入法［14］，研究燙療藥鎮(zhèn)痛和抗炎作用，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)KM小鼠，體質(zhì)量（20±2）g，雌雄兼用，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（湘）2019-0004。標(biāo)準(zhǔn)條件飼養(yǎng)1周，自由進(jìn)食、飲水，環(huán)境溫度（22±2）℃、相對(duì)濕度65%～70%，人工黑暗和光照交替，使用許可證號(hào)：SYXK（桂）2019-0001。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

燙療藥（寬筋藤、大黃、大駁骨、蘇木、桂枝、川烏、草烏、大羅傘、小羅傘、續(xù)斷、姜黃、骨碎補(bǔ)、艾葉、澤蘭、防風(fēng)），將藥材加適量蒸餾水煎煮20 min，過(guò)濾，濃縮得0.6 g/mL的棕黃色藥液，待藥液冷卻后置于4℃冰箱保存?zhèn)溆?。由廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院藥物研發(fā)中心自制，規(guī)格：150 g/包，批準(zhǔn)文號(hào)：桂藥制字Z01060103。生產(chǎn)批號(hào)：20201009）。雙氯芬酸二乙胺乳膠劑（扶他林，GSK Consumer Healthcare Schweiz AG，2X8C）。

1.3 試劑與儀器

0.9%氯化鈉注射液（回音必集團(tuán)江西東亞制藥有限公司，2020060117）；75%酒精（武漢市雪環(huán)醫(yī)用消毒用品有限公司，20210101）；冰乙酸（成都市科隆化學(xué)品有限公司，2018071701）；二甲苯溶液（成都市科隆化學(xué)品有限公司，2020042101）；復(fù)方醋酸地塞米松乳膏（華潤(rùn)三九醫(yī)藥股份有限公司，2019016X）；注射用青霉素鈉（江西省科達(dá)動(dòng)物藥業(yè)有限公司，20210427）；水合氯醛（成都市科隆化學(xué)品有限公司，2018091101）。熱板儀（RB-200智能熱板儀）、BSA223S萬(wàn)分之一天平（賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司）、PV-200足跖容積測(cè)量?jī)x（成都泰盟軟件有限公司）、MLS-3781L-PC（高壓蒸汽滅菌器）、101-1型電熱鼓風(fēng)干燥箱恒溫干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.4 熱板實(shí)驗(yàn)

1.4.1 動(dòng)物篩選 將熱板儀調(diào)至（55±0.5）℃，將雌性小鼠置于熱板上，密切觀察小鼠反應(yīng)，以舔后足為痛覺(jué)敏感指標(biāo)。秒表記錄從將小鼠置于熱板上到出現(xiàn)舔后足的時(shí)間，共兩次，每次間隔5 min，取其均值為該小鼠的痛閾值。痛覺(jué)反應(yīng)過(guò)敏（跳躍、逃竄或痛閾值小于10 s）或痛反應(yīng)遲鈍（痛閾值大于30 s）的小鼠棄去不用，篩選出其他符合要求的動(dòng)物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.4.2 分組與給藥 將篩選合格的60只雌性KM小鼠按痛閾值分為5組，即空白對(duì)照組，陽(yáng)性對(duì)照組，燙療藥高、中、低劑量組，每組12只。空白對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組小鼠腳掌分別涂抹0.9%氯化鈉注射液0.1 mL、扶他林0.1 mg，每日1次，連續(xù)7 d給藥。燙療藥組用燙療藥藥液50 mL將醫(yī)用紗布浸潤(rùn)后平鋪于干凈飼養(yǎng)盒中，將動(dòng)物置于盒中自由活動(dòng)30 min，燙療藥低劑量組每天1次，中劑量組每天2次，高劑量組每天3次，連續(xù)7 d。分別在給藥后第2日、第4日、第7日，用熱板法依次測(cè)定各鼠痛閾值2次（每次間隔2 h），如小鼠60 s內(nèi)仍未產(chǎn)生疼痛反應(yīng)，應(yīng)立即取出不再刺激，痛閾值按60 s計(jì)算。鎮(zhèn)痛率（%）=（用藥組平均痛閾值-空白對(duì)照組平均痛閾值）÷空白對(duì)照組平均痛閾值×100%。

1.5 扭體實(shí)驗(yàn)

取健康KM小鼠60只，雌雄各半，隨機(jī)分為5組，分組及給藥方法同熱板法，末次給藥24 h后，每只小鼠注射0.6%冰醋酸0.2 mL/10 g，觀察10 min內(nèi)扭體反應(yīng)次數(shù)。鎮(zhèn)痛率（%）=（空白對(duì)照組扭體次數(shù)-給藥組扭體次數(shù)）÷空白對(duì)照組扭體次數(shù)×100%

1.6 耳郭腫脹實(shí)驗(yàn)

取健康KM小鼠70只，雌雄兼用，按體質(zhì)量隨機(jī)分為5組，即空白對(duì)照組，陽(yáng)性對(duì)照組，燙療藥高、中、低劑量組，每組14只（雌性6只，雄性8只）?？瞻讓?duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組小鼠右耳外耳郭中央分別涂抹0.9%氯化鈉注射液0.1 mL、復(fù)方醋酸地塞米松乳膏0.1 mg，每日1次，連續(xù)7 d。燙療藥組小鼠右耳外耳郭中央涂抹燙療藥藥液0.1 mL，低劑量組每天1次，中劑量組每天2次，高劑量組每天3次，連續(xù)7 d。末次給藥后24 h，在小鼠左右耳外耳郭的中央分別滴加二甲苯20 μL，1 h后將小鼠脫頸椎處死，剪下雙耳，用8 mm直徑打孔器在兩耳相同部位打下耳片并稱重。耳郭腫脹率（%）=（右耳耳片重-左耳耳片重）÷左耳耳片重×100%

1.7 足跖腫脹實(shí)驗(yàn)

將健康KM小鼠60只，雌雄各半，隨機(jī)分為5組，即空白對(duì)照組，陽(yáng)性對(duì)照組，燙療藥高、中、低劑量組，每組12只。分別在每只小鼠右后肢踝關(guān)節(jié)處畫(huà)上閉合的標(biāo)記線，用足跖容積測(cè)量?jī)x測(cè)得小鼠平齊標(biāo)記線下的足跖體積作為致炎前足跖容積?？瞻讓?duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組小鼠右后肢踝關(guān)節(jié)處涂抹0.9%氯化鈉注射液0.1 mL、復(fù)方醋酸地塞米松乳膏0.1 mg，每日1次，連續(xù)7 d。燙療藥組小鼠右后肢踝關(guān)節(jié)處涂抹燙療藥藥液0.1 mL，低劑量組每天1次，中劑量組每天2次，高劑量組每天3次，連續(xù)7 d。末次給藥后24 h，在每只小鼠右后足跖向腳掌處注射新鮮雞蛋清0.1 mL，分別于1、2、4、6 h同一部位測(cè)2次小鼠足跖容積，取平均值作為致炎后足跖容積。足跖腫脹率（%）=（致炎后足跖容積-致炎前足跖容積）÷致炎前足跖容積×100%

1.8 棉球植入實(shí)驗(yàn)

將脫脂棉制成約10 mg緊致的小棉球，高壓滅菌后置于恒溫干燥箱60℃干燥3 h后保存?zhèn)溆谩⒔】礙M小鼠60只，雌雄各半，隨機(jī)分為5組，即空白對(duì)照組，陽(yáng)性對(duì)照組，燙療藥高、中、低劑量組，每組12只。每只小鼠經(jīng)10%水合氯醛（0.1 mL/只）麻醉后，75%酒精消毒，在無(wú)菌條件下切開(kāi)小鼠背部皮膚，向左右腋下各植入棉球1個(gè)，縫合切口，術(shù)后每只小鼠連續(xù)3 d注射青霉素（0.2 mL/只，8萬(wàn)單位）?？瞻讓?duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組小鼠腳掌處分別涂抹0.9%氯化鈉注射液0.1 mL、復(fù)方醋酸地塞米松乳膏0.1 mg，每日1次，連續(xù)14 d；燙療藥組小鼠給藥方法同熱板法燙療藥組給藥方法，連續(xù)14 d。末次給藥24 h后，將小鼠脫頸椎處死，剪開(kāi)皮膚，剝?nèi)庋拷M織的棉球，于恒溫干燥箱60℃干燥1 h后稱重。肉芽腫凈量（mg）=干燥后棉球肉芽腫重量-原棉球重量。棉球肉芽抑制率（%）=（空白對(duì)照組肉芽腫凈量-給藥組肉芽腫凈重）÷空白對(duì)照組肉芽腫凈重×100%

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果以（）表示，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)作組間比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠痛閾值及鎮(zhèn)痛率的比較

見(jiàn)表1。與空白對(duì)照組相比，燙療藥高、中、低劑量組在給藥的第2、4、7日均可一定程度延長(zhǎng)小鼠痛閾值，且中劑量連續(xù)給藥7 d可明顯提高小鼠的痛閾值（P＜0.05），鎮(zhèn)痛率達(dá)79.73%，表明燙療藥對(duì)熱所致疼痛有鎮(zhèn)痛效果。燙療藥各劑量組間及與陽(yáng)性對(duì)照組間比較無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

表1 各組小鼠痛閾值及鎮(zhèn)痛率的比較（±s）

表1 各組小鼠痛閾值及鎮(zhèn)痛率的比較（±s）

注：與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

組 別n 給藥前痛閾值（s）給藥后第2日痛閾值（s） 鎮(zhèn)痛率（%）給藥后第4日痛閾值（s） 鎮(zhèn)痛率（%）給藥后第7日痛閾值（s） 鎮(zhèn)痛率（%）12 12 12 12 12空白對(duì)照組陽(yáng)性對(duì)照組燙療藥低劑量組燙療藥中劑量組燙療藥高劑量組21.05±5.63 24.05±6.16 22.10±5.89 20.99±6.15 23.10±5.69 15.85±3.09 20.17±5.87*17.19±5.47 16.82±5.28 19.16±8.48-27.29 8.50 6.15 20.92 14.52±6.24 15.53±5.18 14.89±4.02 13.30±2.75 18.89±9.41-6.96 2.52-8.43 30.09 14.22±4.16 14.82±5.70 16.71±6.59 25.55±15.11*15.14±6.20-4.29 17.56 79.73 6.52

2.2 各組小鼠扭體次數(shù)的比較

見(jiàn)表2。與空白對(duì)照組相比，燙療藥各劑量組小鼠扭體次數(shù)均顯著降低（P＜0.05），且鎮(zhèn)痛率與給藥次數(shù)相關(guān)；與陽(yáng)性對(duì)照組相比，燙療藥高劑量組小鼠的扭體次數(shù)顯著減少（P＜0.01），且鎮(zhèn)痛率達(dá)77.78%，表明燙療藥對(duì)冰醋酸所致疼痛具有良好的鎮(zhèn)痛效果。各燙療組間比較無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

表2 各組小鼠扭體次數(shù)及鎮(zhèn)痛率的比較（±s）

表2 各組小鼠扭體次數(shù)及鎮(zhèn)痛率的比較（±s）

組 別n 扭體次數(shù)（次） 鎮(zhèn)痛率（%）空白對(duì)照組陽(yáng)性對(duì)照組燙療藥低劑量組燙療藥中劑量組燙療藥高劑量組12 12 12 12 12 18.75±6.70 12.42±5.68*12.18±7.15*9.83±6.07**4.17±5.08**△-33.78 35.11 47.56 77.78

2.3 各組小鼠耳郭腫脹情況比較

見(jiàn)表3。與空白對(duì)照組比較，燙療藥各劑量均能引起二甲苯致小鼠耳郭腫脹度、耳郭腫脹率明顯升高（P＜0.05或P＜0.01），提示燙療藥對(duì)二甲苯所致的小鼠耳郭腫脹沒(méi)有明顯的抑制作用。燙療藥各劑量組間及與陽(yáng)性對(duì)照組間比較無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

表3 各組小鼠耳郭腫脹情況比較（±s）

表3 各組小鼠耳郭腫脹情況比較（±s）

組別空白對(duì)照組陽(yáng)性對(duì)照組燙療藥低劑量組燙療藥中劑量組燙療藥高劑量組n 14 14 14 14 14耳郭腫脹度（mg）1.44±1.68 2.81±2.98 2.81±1.71*3.67±2.48*4.17±2.53**耳郭腫脹率（%）20.74 51.02 35.25 44.67 51.14

2.4 各組小鼠足跖腫脹情況比較

見(jiàn)表4。與空白對(duì)照組比較，給予燙療藥1 h后開(kāi)始顯著降低雞蛋清所致小鼠足跖容積和足跖腫脹率的升高（P＜0.05～0.01），高、中劑量藥效可維持4h，低劑量可維持2 h。燙療藥各組小鼠的足趾腫脹率與給藥次數(shù)呈量效關(guān)系，表明燙療藥對(duì)雞蛋清致炎作用具有明顯抑制作用。與陽(yáng)性對(duì)照組比較，燙療藥低劑量組給藥6 h后，小鼠足跖腫脹度升高有顯著差異（P＜0.01），燙療藥各劑量組間無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

表4 各組小鼠足趾腫脹情況的比較

2.5 各組小鼠肉芽組織增生的比較

見(jiàn)表5。與空白對(duì)照組相比，燙療藥中劑量組可顯著減少小鼠棉球肉芽腫組織增生（P＜0.01），抑制率達(dá)36.94%，高、低劑量有一定程度減少小鼠棉球肉芽腫組織增生作用，表明燙療藥對(duì)小鼠棉球肉芽腫增生具有明顯抑制作用。燙療藥各劑量組間及與陽(yáng)性對(duì)照組間比較無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

表5 各組小鼠肉芽腫情況的比較

3 討論

在鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)熱板法可知燙療藥各劑量組在給藥的第2、4、7日均可延長(zhǎng)小鼠痛閾值，其中燙療藥中劑量組在給藥的第7日明顯提高了小鼠的痛閾值；通過(guò)扭體法可知燙療藥各劑量組均不同程度地顯著減少小鼠的扭體次數(shù)，鎮(zhèn)痛率與給藥次數(shù)呈正相關(guān)?？寡讓?shí)驗(yàn)中，燙療藥各劑量組對(duì)二甲苯致小鼠耳郭腫脹度均有明顯升高；燙療藥各劑量給藥后1 h對(duì)新鮮雞蛋清所致小鼠足跖容積和足跖腫脹率明顯降低，高、中劑量藥效可維持4 h，低劑量可維持2 h；燙療藥各劑量組小鼠棉球肉芽腫凈量明顯降低，其中燙療藥中劑量組效果最顯著。以上結(jié)果表明燙療藥在鎮(zhèn)痛方面，對(duì)冰醋酸誘發(fā)的炎性疼痛具有較好的鎮(zhèn)痛效果；在抗炎作用方面，燙療藥對(duì)急性滲出性炎性水腫無(wú)明顯抑制作用，對(duì)雞蛋清所致小鼠急性足趾腫脹具有較好的抑制作用，對(duì)炎癥后期肉芽組織增生具有明顯抑制作用。

燙療藥抗炎鎮(zhèn)痛作用可能與熱敏通道TRP有關(guān)。TRP介導(dǎo)多種急慢性炎癥疼痛，除了溫度和機(jī)械刺激，多種辛味中藥如吳茱萸、白芥子、生姜、肉桂、大蒜、白芷等的活性成分，以及內(nèi)源性H+及炎癥介質(zhì)都能夠激活熱敏通道［15］。當(dāng)組織受損傷時(shí)，受損傷細(xì)胞會(huì)釋放大量的炎性介質(zhì)，如H+、K+、緩激肽、組胺、ATP、5-HT和NO等，內(nèi)源性炎性介質(zhì)通過(guò)多種信號(hào)通路進(jìn)一步激活熱敏通道而引起疼痛［16］，這種情況稱為區(qū)域敏化。在激動(dòng)劑、溫度和炎癥等相關(guān)因素的綜合作用下，熱敏通道致敏，產(chǎn)生炎癥病理證候。有學(xué)者的相關(guān)研究也證實(shí)了關(guān)節(jié)炎性小鼠在后期表現(xiàn)出機(jī)械性痛覺(jué)過(guò)敏減輕與TRPV1通道缺失有關(guān)［17］。燙療藥可能正是應(yīng)用TRPV1、TRPA1作用機(jī)制，通過(guò)減少炎性介質(zhì)的產(chǎn)生，抑制TRP激動(dòng)劑炎性因子的活性，脫敏TRP通道，起到抗炎鎮(zhèn)痛的作用，另外處方里溫?zé)崴幈旧硭腡RPV1激動(dòng)劑和燙療藥熱熨時(shí)的較高溫度激活TRPV1通道，產(chǎn)生熱感；達(dá)到一定條件后，抑制低溫及炎性因子等TRPA1激動(dòng)劑的活性，交叉脫敏TRPA1通道，從而消除低溫及炎癥誘發(fā)的冷痛，發(fā)揮散寒止痛的作用，關(guān)于燙療藥抗炎鎮(zhèn)痛的作用分子機(jī)理還有待進(jìn)一步的研究。

燙療藥以瑤藥寬筋藤（青坐翁）、大駁骨祛風(fēng)止痛、舒筋活絡(luò)為君，臣以壯藥大羅傘、小羅傘祛風(fēng)濕、止痹痛；佐以川烏、草烏、防風(fēng)祛風(fēng)濕，溫經(jīng)止痛；艾葉溫經(jīng)散寒止痛；骨碎補(bǔ)、續(xù)斷續(xù)筋接骨、補(bǔ)腎強(qiáng)骨；大黃、蘇木、澤蘭、姜黃活血化瘀止痛，體現(xiàn)“治風(fēng)先治血，血行風(fēng)自滅”的治療理念，活血化瘀藥與溫經(jīng)散寒藥合用，使血得溫則行，血行瘀消，諸癥自愈。全方共奏活血祛瘀、解痙止痛之功。中藥燙療經(jīng)過(guò)加熱外熨敷于患收，藥力經(jīng)皮入肉、從筋至骨、從外到內(nèi)，起到溫經(jīng)通絡(luò)、祛風(fēng)散寒的功效，從而更好地發(fā)揮其活血化瘀、舒筋活絡(luò)、消腫止痛的作用。