lbp基因敲除改善膿毒癥大鼠肝臟炎癥性損傷及其作用機(jī)制

馬文瀟，陳姝文，劉海峰，易昕睿，王 永，賀智翔，何茂章，薛 敏，唐云書，閆 妍，程文慧，朱亞玲

膿毒癥是由炎癥反應(yīng)引起宿主器官功能障礙的疾病，具有發(fā)病率高、病死率高等特點(diǎn)，是急危重癥醫(yī)學(xué)面臨的重要臨床問題[1]。脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)又稱內(nèi)毒素，是膿毒癥的主要致病因素之一[2]，而LPS結(jié)合蛋白(lipopolysaccharide-binding protein, LBP)是肝臟分泌的急性反應(yīng)期蛋白，可特異性結(jié)合LPS，并促進(jìn)形成脂多糖/Toll樣受體4/分化群14(lipopolysaccharide/toll-like receptor 4/ cluster of differentiation 14, LPS/TLR4/CD14)復(fù)合物，激活Toll樣受體4/髓樣分化蛋白88/核因子κB(toll-like receptor 4/myeloid differentiation-88/nuclear factor kappa-B, LR4/MyD88/NF-κB)信號(hào)通路[3]，引起炎癥反應(yīng)，并誘發(fā)肝臟損傷[4]。研究表明lbp基因敲除(lbp-/-)或可減輕LPS誘導(dǎo)的肝臟炎癥損傷[5]，然而其具體的調(diào)節(jié)機(jī)制并未闡明。該研究以lbp-/-大鼠為對(duì)象，通過注射LPS刺激誘導(dǎo)肝損傷為模型，基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序揭示lbp基因在膿毒癥相關(guān)肝臟炎癥損傷發(fā)生中的作用及其機(jī)制，為膿毒癥的防治提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 10只體質(zhì)量(230±20)g SPF級(jí)SD雄性大鼠，即野生型(wild type, WT)組，由北京生命河實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。委托南京大學(xué)-南京生物醫(yī)藥研究院構(gòu)建與WT大鼠具有相同的遺傳背景的lbp基因敲除(lbp-/-)大鼠10只，即lbp-/-組。

1.1.2主要試劑與儀器 亞致死性LPS注射液(大腸埃希菌O55 ∶B5)購(gòu)自美國(guó)圣路易斯西格瑪-奧爾德里奇公司；美洛昔康購(gòu)自美國(guó)TargetMol公司；5%異氟醚購(gòu)自上海雷門公司；TRIzol?Reagent購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；IL-6和TNF-α試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司。自動(dòng)化學(xué)分析儀(拜耳Advia 1650)購(gòu)自德國(guó)勒沃庫(kù)森公司；PCR儀(2506261)購(gòu)自德國(guó)Biometra公司；實(shí)時(shí)定量PCR儀(CF-X96TM)購(gòu)自上海伯樂技術(shù)有限公司；石蠟切片機(jī)(RM2235)購(gòu)自德國(guó)Lecia；電子顯微鏡(JEM1400)購(gòu)自日本電子株式會(huì)社。

1.2 方法

1.2.1急性肝臟炎癥損傷模型構(gòu)建 動(dòng)物環(huán)境符合標(biāo)準(zhǔn)的動(dòng)物護(hù)理?xiàng)l件，大鼠可以隨意飲水和進(jìn)食，在實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)7 d。對(duì)大鼠實(shí)施麻醉(混合有3%異氟醚的氧氣流量0.5 L/min)至大鼠不再有疼痛反射，注射亞致死性LPS注射液(2 mg/kg，靜脈注射)，美洛昔康(0.2 mg/kg，皮下注射)用于術(shù)后鎮(zhèn)痛。給予LPS 1 h后，用5%異氟醚處死大鼠，從其下腔靜脈采血并收集肝組織。

1.2.2測(cè)定肝酶和促炎因子水平 采用生化分析儀檢測(cè)血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase, ALT)和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase, AST)水平以評(píng)估肝損傷情況，通過RT-PCR檢測(cè)促炎因子腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)和白細(xì)胞介素-6(interleukin-6, IL-6)以評(píng)估炎癥水平。

1.2.3組織蘇木精-伊紅染色 取大鼠肝臟組織，置于4%多聚甲醛固定24 h后乙醇梯度脫水，后在二甲苯中進(jìn)行透明化處理，行浸蠟、包埋、切片、脫蠟與蘇木精-伊紅染色、漂洗、復(fù)染和封片等一系列常規(guī)處理后，制作組織切片。光學(xué)顯微鏡下觀察肝臟組織形態(tài)特點(diǎn)。

1.2.4組織RNA測(cè)序及差異性分析 將凍存的組織經(jīng)液氮研磨成粉，加入1 ml TRIzol?Reagent室溫裂解細(xì)胞5 min，隨后按照TRIzol?試劑說(shuō)明書，提取細(xì)胞的總RNA，并將成功提取的RNA樣本送至諾禾致源測(cè)序公司進(jìn)行建庫(kù)測(cè)序。測(cè)序得到原始測(cè)序數(shù)據(jù)(raw reads)，去除接頭和低質(zhì)量數(shù)據(jù)，過濾后得到待分析數(shù)據(jù)(clean reads)，使用Fastqc軟件(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)對(duì)clean reads進(jìn)行質(zhì)控，檢查測(cè)序的整體質(zhì)量，并采用STAR-2.5.3a(https://github.com/alexdobin/STAR)軟件將clean reads比對(duì)到大鼠基因組上，利用DESeq2 R包軟件(http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html-/DESeq2.html)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，轉(zhuǎn)化為百萬(wàn)外顯子的堿基片段即基因的表達(dá)量值(FPKM)，并進(jìn)行差異分析，設(shè)定篩選差異表達(dá)基因(differential expressed genes,DEGs)閾值為P<0.05 & |log2(Fold Change)|≥1.5，其中Fold Change為lbp-/-組與WT組的差異倍數(shù)。

1.2.5差異基因注釋、GO和KEGG富集分析 針對(duì)WT組和lbp-/-組肝細(xì)胞的DEGs，利用DAVID(https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp#)和PANTHER(http://www.pantherdb.org/)進(jìn)行功能富集分析及通路分析，從而揭示差異基因影響的生物學(xué)過程。

1.2.6RT-PCR檢測(cè)mRNA表達(dá)水平 為進(jìn)一步驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)結(jié)果，選取4個(gè)代表性差異基因，利用qPCR技術(shù)進(jìn)行mRNA表達(dá)水平的定量分析。同1.2.4方法提取細(xì)胞內(nèi)總mRNA后進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。設(shè)計(jì)引物序列，將含有擴(kuò)增序列的cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件為：95 ℃初始變性3 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，70 ℃延伸30 s，擴(kuò)增40次循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后記錄各組結(jié)果，采用2-ΔΔCt的計(jì)算方式，以GADPH作為內(nèi)參記錄目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 LPS誘導(dǎo)對(duì)lbp-/-大鼠和WT大鼠肝臟損傷的影響使用生化分析儀檢測(cè)WT組和lbp-/-組大鼠血清ALT和AST。結(jié)果顯示，與WT組相比，lbp-/-大鼠血清中ALT、AST水平降低(P<0.05)，見圖1A。同時(shí)，利用RT-PCR檢測(cè)LPS注射后WT大鼠和lbp-/-大鼠促炎因子TNF-α、IL-6的表達(dá)水平，相比WT組，lbp-/-組大鼠血清IL-6降低(P<0.05)，但TNF-α差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1B)。此外，肝臟組織HE染色結(jié)果表明，lbp-/-組炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度低于WT組(圖1C、D)。綜上，該結(jié)果提示敲除lbp基因可減輕LPS引起的肝臟損傷，降低炎癥因子的表達(dá)水平。

圖1 LPS誘導(dǎo)對(duì)WT組和lbp-/-組肝臟損傷的影響 ×400A：肝酶水平差異；B：促炎因子水平差異；C：WT組HE染色切片；D：lbp-/-組HE染色切片；與WT組比較：*P<0.05

2.2 RNA-Seq測(cè)序統(tǒng)計(jì)分析LPS誘導(dǎo)后，對(duì)WT組與lbp-/-組肝臟RNA-Seq樣本進(jìn)行檢測(cè)(圖2)。通過對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估，得到總測(cè)序讀數(shù)約為65.1(56.2～87.8)M。利用STAR進(jìn)行比對(duì)后，唯一比對(duì)讀數(shù)約為49.7(43.7～66.2)M，總比對(duì)率約為93.0%，唯一比對(duì)率約為76.5%，表明測(cè)序組裝結(jié)果可用于進(jìn)一步分析,見表1。

表1 RNA-Seq測(cè)序樣本的唯一匹配數(shù)目[M，n(%)]

圖2 RNA-Seq建庫(kù)測(cè)序及數(shù)據(jù)處理流程

2.3 LPS誘導(dǎo)對(duì)lbp-/-大鼠和WT大鼠肝臟轉(zhuǎn)錄組水平的影響利用RNA-seq技術(shù)對(duì)比lbp-/-大鼠和WT大鼠肝臟轉(zhuǎn)錄水平，以P<0.05 & |log2(Fold Change)|≥1.5為閾值，共鑒定168個(gè)差異表達(dá)基因，包括lbp-/-組上調(diào)的101個(gè)基因和WT組上調(diào)的67個(gè)基因(圖3A)。為進(jìn)一步描述lbp-/-組和WT組差異基因表達(dá)圖譜，以P<0.01 & |log2(Fold Change)|≥1.5為條件，對(duì)所得差異基因進(jìn)行聚類分析，如圖3B所示，結(jié)果表明，Kat14、Gtf2i、Itih4、Rps6ka4、Gorasp2等基因在lbp-/-組顯著上調(diào)(P<0.01 & |log2(Fold Change)|≥1.5)，且這些基因參與免疫反應(yīng)和脂質(zhì)代謝過程，表明敲除lbp基因可能通過下游免疫反應(yīng)及脂質(zhì)代謝相關(guān)基因，調(diào)節(jié)LPS誘導(dǎo)的膿毒癥的炎癥反應(yīng)；而Vadc2、Pfn1、Ube2c、Tars等基因顯著下調(diào)(P<0.01 & |log2(Fold Change)|≥1.5)，這些基因主要作用于細(xì)胞凋亡、離子穩(wěn)態(tài)及氧化應(yīng)激過程，提示敲除lbp基因可能在LPS誘導(dǎo)的膿毒癥的細(xì)胞凋亡中起重要作用。見表2。

圖3 WT和lbp-/-大鼠肝臟的轉(zhuǎn)錄差異表達(dá)情況A：WT組和lbp-/-組差異基因的火山圖；藍(lán)色：下調(diào)；紅色：上調(diào)；B：WT組和lbp-/-組顯著差異表達(dá)基因的轉(zhuǎn)錄圖譜

表2 WT組和lbp-/-組標(biāo)記的顯著差異基因

2.4lbp-/-大鼠和WT大鼠差異基因的功能富集分析為闡明lbp-/-調(diào)節(jié)的下游DEGs的功能，利用GO富集分析列出富集到的20項(xiàng)生物學(xué)條目，WT組和lbp-/-組各10項(xiàng)，根據(jù)P值排列，見圖4A。結(jié)果表明，WT組高表達(dá)的DEGs(如Vadc2、Pfn1、Ube2c、Tars等)主要富集在脂質(zhì)結(jié)合和磷脂酰膽堿生物合成等過程，而lbp-/-組高表達(dá)的DEGs(如Kat14、Gtf2i、Itih4、Rps6ka4、Gorasp2等)主要富集到能量代謝和氧化還原等過程。此外，通過KEGG通路富集分析，結(jié)果顯示，lbp-/-組上調(diào)的DEGs主要富集到過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferators-activated receptor，PPAR)信號(hào)通路和類固醇激素生物合成信號(hào)通路，見圖4B。

圖4 LPS誘導(dǎo)后WT組與lbp-/-組差異基因的功能富集分析A：WT組與lbp-/-組差異基因富集的生物學(xué)過程；B：WT組與lbp-/-組差異基因富集的相關(guān)通路

2.5lbp-/-大鼠和WT大鼠差異基因的mRNA相對(duì)表達(dá)水平RT-PCR驗(yàn)證部分差異基因的mRNA相對(duì)表達(dá)水平，結(jié)果顯示，lbp-/-組肝臟組織中，與細(xì)胞凋亡及氧化應(yīng)激相關(guān)的下調(diào)基因Vdac2和Pfn1相對(duì)表達(dá)量低于WT組(P<0.05)，如圖5A、B所示；而與脂質(zhì)代謝及免疫反應(yīng)相關(guān)的上調(diào)基因Cyp7a1、Cyp4a2相對(duì)表達(dá)量高于WT組(P<0.05)，如圖5C、D所示。進(jìn)一步提示lbp-/-可通過調(diào)控下游的脂質(zhì)代謝和免疫反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)，從而減輕肝組織損傷。

圖5 LPS誘導(dǎo)后WT組和lbp-/-組差異基因的mRNA相對(duì)表達(dá)水平A：Vadc2 mRNA相對(duì)表達(dá)水平；B：Pfn1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平；C：Cyp7a1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平；D：Cyp4a2 mRNA相對(duì)表達(dá)水平；與WT組比較：*P<0.05，***P<0.001

3 討論

由創(chuàng)傷膿毒癥或多器官衰竭引起的死亡占創(chuàng)傷后遲發(fā)性死亡病例的80%[6]，當(dāng)高濃度LPS持續(xù)刺激時(shí)可導(dǎo)致膿毒性休克的發(fā)生。LBP可與LPS結(jié)合誘發(fā)炎癥反應(yīng)，越來(lái)越多研究表明lbp基因在膿毒癥發(fā)生發(fā)展中起到重要作用，Song et al[5]發(fā)現(xiàn)lbp基因能通過PPAR-CYP4A2通路減輕膿毒癥時(shí)肝線粒體的損傷；崔峰 等[7]研究表明lbp基因位點(diǎn)的多態(tài)性與膿毒癥易感性存在必然關(guān)聯(lián)，然而關(guān)于lbp基因在膿毒癥中的發(fā)生機(jī)制及其敲除后對(duì)機(jī)體下游其他基因的影響并未明確。

本研究以lbp-/-大鼠為對(duì)象，采用LPS刺激誘導(dǎo)膿毒癥大鼠模型，基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)揭示lbp-/-在膿毒癥相關(guān)肝臟炎癥損傷發(fā)生中的作用及其機(jī)制。其中，lbp-/-大鼠的肝酶ALT和AST水平顯著降低，促炎因子TNF-α、IL-6也相對(duì)減少，提示lbp-/-降低肝臟炎癥水平，對(duì)肝臟損傷起保護(hù)作用。轉(zhuǎn)錄組差異分析結(jié)果進(jìn)一步揭示lbp-/-組上調(diào)的DEGs主要富集在與脂質(zhì)代謝和免疫反應(yīng)密切相關(guān)的PPAR信號(hào)通路上，與Boeckmans et al[8-9]研究一致。

研究報(bào)道，PPAR通路與中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)(neutrophil extracellular traps,NETs)的形成密切相關(guān)，可參與細(xì)菌清除等過程[10]。根據(jù)上述結(jié)果和文獻(xiàn)，本研究構(gòu)建了lbp-/-改善膿毒癥可能的分子機(jī)制模型(圖6)：在WT大鼠中，LPS可結(jié)合LBP刺激TLR4，上調(diào)氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡相關(guān)基因(如Vdac2、Pfn1、Ube2c、Tars等)，觸發(fā)NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)途徑，調(diào)節(jié)免疫、急性期炎癥反應(yīng)和細(xì)胞活性[11]，促進(jìn)促炎因子如IL-6、IL-8和TNF-α等大量分泌，從而誘導(dǎo)肝組織發(fā)生炎癥反應(yīng)及組織損傷；而lbp-/-顯著影響大鼠脂質(zhì)代謝及免疫反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)水平，其中Cyp7a1、Cyp4a2、Cyp8b1和Acox2等與膽汁酸的合成代謝有關(guān)，可通過法尼酯衍生物X受體(FXR)參與機(jī)體代謝，降低脂蛋白水平，抑制游離脂肪酸攝取和三酰甘油合成，加快脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)[12-14]，同時(shí)，還通過PPAR信號(hào)通路加快脂質(zhì)分解代謝，并形成NETs參與細(xì)菌清除，從而減輕機(jī)體的炎癥反應(yīng)及肝組織損傷。其中，PPARs是包含三種同種型(PPAR-α，PPAR-β和PPAR-γ)超家族的核受體，參與代謝調(diào)節(jié)等過程：①PPAR-γ在激活信號(hào)通路過程中抑制TNF-α、IL-6等促炎因子的表達(dá)，在LPS誘導(dǎo)的膿毒癥中，與致病性因素抗炎黏附分子協(xié)同，使入侵的LPS與LBP不能相互作用，抑制NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)途徑，從而抑制炎癥反應(yīng)[15]；②中性粒細(xì)胞吞噬細(xì)菌可產(chǎn)生活性氧(ROS)，并通過脫顆粒釋放抗菌因子，形成NETs，加快細(xì)菌清除速率[16]。

圖6 lbp基因敲除改善膿毒癥可能的分子機(jī)制模型

綜上，本研究以lbp-/-大鼠為對(duì)象，通過注射LPS刺激誘導(dǎo)膿毒癥為模型，比較WT組與lbp-/-組肝酶含量和促炎因子水平，基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)對(duì)比組間DEGs表達(dá)情況、生物學(xué)功能及通路富集分析等，研究表明lbp基因影響脂質(zhì)代謝過程和免疫相關(guān)基因表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞色素家族成員Cyp7a1、Cyp4a2等表達(dá)水平上調(diào)，且DEGs主要富集于PPAR信號(hào)通路，形成NETs參與細(xì)菌清除和加快脂質(zhì)代謝分解等生物學(xué)過程，從而減輕炎癥反應(yīng)及肝臟損傷，減緩膿毒癥的發(fā)生發(fā)展。然而，lbp基因在膿毒癥的具體調(diào)節(jié)機(jī)制及其作用的信號(hào)通路仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。該研究為膿毒癥治療提供了新的思路。