響應(yīng)面法優(yōu)化萱草花總黃酮提取工藝研究*

李 盈，楊新惠，馬志強，王 琪△

(1．石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，新疆 石河子 832002；2．新疆植物藥資源利用教育部重點實驗室/石河子大學(xué)藥學(xué)院，新疆 石河子 832002)

百合科萱草屬植物萱草(HemerocallisfulvaL.)為民間傳統(tǒng)常用的中藥，在我國各地均有種植，其根、莖、葉、花，均可用來入藥[1]。在民間傳統(tǒng)用藥中，萱草常被用來安神醒腦、美顏養(yǎng)血、去熱解毒、通乳等[2]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)萱草具有抗腫瘤、抗菌、抗吸血蟲病、鎮(zhèn)靜催眠作用、抗抑郁、肝保護等藥理作用[3-5]。萱草花中含有多種生物活性物質(zhì)包括內(nèi)酰胺、類胡蘿卜素、甾體皂苷、蒽醌、黃酮類等[6]。其中黃酮類化合物具有較好的藥理活性[7]。黃紅焰等[8]發(fā)現(xiàn)萱草黃酮類成分具有顯著的降低血糖、抑制脂質(zhì)過氧化、改善動脈粥樣硬化指數(shù)的作用。研究表明，萱草花總黃酮對大鼠肝纖維化具有改善作用，對乙醇所致小鼠急性酒精性肝損傷具有明顯的保護作用[9-10]。還有研究表明，萱草花總黃銅可以減輕肝纖維化過程中的氧化應(yīng)激反應(yīng)，減少氧自由基產(chǎn)生和脂質(zhì)過氧化物堆積進而緩解肝纖維化，保護肝功能[11]。

研究萱草花中總黃酮提取工藝和分析檢測抗氧化成分有利于開發(fā)萱草花中總黃酮資源，可提升萱草花經(jīng)濟價值，避免造成資源浪費[12]。目前，國內(nèi)外對黃酮類化合物提取的方法眾多，包括傳統(tǒng)的提取方法如浸漬法、煎煮法、回流法、索氏提取法等，以及新方法主要包括超臨界流體萃取、超聲輔助提取、微波輔助提取、加壓液體提取、酶輔助提取等方法[13]。

響應(yīng)面設(shè)計是一種有效的統(tǒng)計和優(yōu)化方法，與傳統(tǒng)的均勻設(shè)計與正交設(shè)計相比，響應(yīng)面法具有試驗精度高、試驗次數(shù)少、數(shù)學(xué)模型預(yù)測性好等優(yōu)點，且能反映各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系[14]。本研究分別運用加熱回流法和超聲輔助法提取總黃酮，在單因素的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法對萱草花總黃酮的提取工藝進行優(yōu)化，為該種植物的合理利用提供實驗理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1一般材料 萱草干燥花2 kg，購于新疆百草堂藥業(yè)集團；無水乙醇(天津市富宇精細化工有限公司)；蘆丁對照品(上海融禾醫(yī)藥科技有限公司，批號：081230)；其余化學(xué)試劑均為國藥集團的分析純；亞硝酸鈉(上海麥克林生化科技有限公司，批號：C11063391)；硝酸鋁(上海麥克林生化科技有限公司，批號：C10792299)；氫氧化鈉 (天津市鑫鉑特化工有限公司，批號：20200816)。

1.1.2器與試劑 FW-100型高速萬能粉碎機(北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司)；DZKW-0-2型電熱恒溫水浴鍋(北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司)；N-1300型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛朗儀器有限公司、東京理化器械株獨資工廠)；V-2401PC型紫外-可見分光光度計(日本島津公司)；Sartorius BS110s型萬分之一電子天平(北京賽多利斯天平有限公司)；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2方法

1.2.1對照品溶液配制[15]精密稱取2.5 mg干燥至恒重的蘆丁對照品，置于25 mL容量瓶中，用70%乙醇溶解，稀釋至刻度，搖勻，混成濃度為0.1 mg/mL的對照品溶液。

1.2.2待測溶液制備 稱取2.5 g萱草花粉末，按照提取條件加熱回流，減壓濃縮，濃縮液定容至25 mL，作為后續(xù)實驗的供試品溶液。

1.2.3萱草花類黃酮提取含量的測定

對人性和人的能力的平等主義和樂觀主義的看法恰恰也是陸九淵心學(xué)的重要思想特征。陸九淵自認為傳承的是孟子的思想，孟子就曾說過人皆可以為堯舜，在可以成為圣人這一點上，每個人沒有不同，而且都可以成為連孔子都景仰并且自愧不如的最高等的圣人。關(guān)于這種樂觀主義，陸九淵的表達更多。他十幾歲寫讀書筆記的時候就曾寫道“宇宙便是吾心，吾心便是宇宙”[3]，即，我之心、人之心與宇宙是合一的。類似的表達還有“心只是一個心，某之心，吾友之心，上而千百載圣賢之心，下而千百載復(fù)有一圣賢，其心亦只如此，心之體甚大”。[3]

1.2.3.1測定波長的選擇 精確稱取5.34 mg蘆丁對照品于25 mL容量瓶中，70%乙醇溶解定容，吸取1.0 mL移入10 mL容量瓶中；加0.4 mL的5% NaNO2溶液，搖勻，靜置6 min，再加0.4 mL的10% AL(NO3)3溶液，搖勻，靜置6 min，最后加4 mL的4% NaOH溶液，70%乙醇溶液定容至刻度，搖勻，靜置15 min，用紫外-可見分光光度計在200～800 nm內(nèi)全波長掃描吸收曲線。觀察對照品溶液有最大吸收峰的地方，則以此作為測定波長。

1.2.3.2線性關(guān)系考察 精密吸取蘆丁對照品溶液2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL于10 mL容量瓶中，每個容量瓶中按照“1.2.3.1”項下方法加入顯色劑，以70%乙醇為空白，于最大吸收峰處測定其吸光度A，以蘆丁對照品溶液濃度C為橫坐標，以吸光度A為縱坐標繪制標準曲線，同時得到公式。

供試品溶液按照步驟“1.2.3.1”進行顯色反應(yīng)，測定其吸光度A，結(jié)合標準曲線方程，得濃度C，得出相應(yīng)的黃酮提取量。

1.2.3.3精密度試驗 精密吸取蘆丁標準液1.5 mL于10 mL容量瓶中，按照步驟“1.2.3.2”測定其吸光度A，重復(fù)在同一條件下測定6次，根據(jù)吸光度A計算相對標準偏差(RSD)值。

1.2.3.4穩(wěn)定性試驗 吸取總黃酮供試品溶液1 mL于10 mL容量瓶中，按照步驟“1.2.3.2”分別于0、15、30、45、60、90 min測定吸光值A(chǔ)，計算RSD值。

1.2.3.5重復(fù)性試驗 吸取6份總黃酮供試品溶液，各取0.5 mL于10 mL容量瓶中，按照步驟“1.2.3.2”測定吸光度A，計算RSD值。

1.2.3.6加樣回收率試驗 分別精確量取9份已知吸光度的提取液于10 mL容量瓶中，分為3組，依次按照比例每組分別加入濃度為0.1 mg/mL的蘆丁標準品溶液 2.0、3.0、4.0 mL，按標準曲線繪制的顯色方法，顯色定容，測定吸光度A，計算回收率與RSD值。

1.2.4.1提取溶劑濃度的篩選 精密稱取萱草花粉末5份，每份1.0 g，加入 20 mL不同濃度的乙醇(60%、 70%、80%、90%、100%)，每份樣品進行1 h的加熱回流提取，趁熱過濾，減壓濃縮，按“1.2.3.2” 項下方法測定總黃酮被提取出的含量。

1.2.4.2提取時間的篩選 精密稱取萱草花粉末5份，每份1.0 g，加入20 mL 70%乙醇，分別加熱回流提取 30 、60 、90 、120 、150 min，趁熱過濾，減壓濃縮，按“1.2.3.2”項下方法測定總黃酮被提取出的含量。

1.2.4.3物料比的篩選 精密稱取萱草花粉末5份，每份1.0 g，分別按1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70(g/mL)的物料比加入70%乙醇，水浴加熱回流提取，趁熱過濾，減壓濃縮，按“1.2.3.2”項下方法測定總黃酮被提取出的含量。

1.2.4.4提取次數(shù)的篩選 精密稱取萱草花粉末5份，每份1.0 g，分別加入70%乙醇，物料比1∶60(g/mL)，加熱回流提取60 min，并且分別提取1、2、3次，趁熱過濾，減壓濃縮，按“1.2.3.2”項下方法測定總黃酮被提取出的含量。

1.2.5響應(yīng)面法優(yōu)化萱草花總黃酮提取條件 根據(jù)前期的單因素試驗結(jié)果，固定提取次數(shù)，選取乙醇濃度(A)、提取時間(B)和物料比(C)為自變量，以萱草花總黃酮提取量(Y)為響應(yīng)值，利用Design-Expert 10軟件中的Box-Behnken進行響應(yīng)面中心組合設(shè)計，優(yōu)化萱草花中總黃酮提取工藝。因素水平及編碼見表1。

表1 響應(yīng)面分析法試驗因素水平及編碼表

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，采用Design Experet 10.0 軟件進行響應(yīng)面試驗。

2 結(jié) 果

2.1萱草花類黃酮提取含量測定結(jié)果

2.1.1測定波長選擇 對照品溶液在510 nm處有最大吸收峰，故選用510 nm為測定波長。

2.1.2線性關(guān)系考察 最終確定曲線回歸方程為A=15.234C+0.013 1，R2=0.999 1，結(jié)果表明蘆丁在0.02～0.04 mg/mL線性關(guān)系良好。

2.1.3精密度試驗 計算出RSD值為 0.852%，表明此試驗精密度良好。

2.1.4穩(wěn)定性試驗 計算出RSD值 為 1.571%，表明供試品溶液在1.5 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.5重復(fù)性試驗 計算出RSD值 為 0.388%，表明此方法重復(fù)性符合分析要求。

2.1.6加樣回收率試驗 平均加樣回收率為97.41%，RSD值為1.01%。

2.2單因素試驗 通過圖1可以明顯觀察出，當乙醇濃度為90%時，萱草花中總黃酮提取含量最高；如圖2所示，以70%乙醇提取，當提取時間為90 min時，總黃酮提取出的含量最高；通過圖3可以看出，物料比為1∶60(g/mL)時，總黃酮含量最高；由圖4可知，分別提取 1、2、3 次，其中提取2次的總黃酮含量最高。

圖1 乙醇濃度對總黃酮提取量的影響

圖2 提取時間對總黃酮提取量的影響

圖3 物料比對總黃酮提取量的影響

圖4 提取次數(shù)對總黃酮提取量的影響

2.3響應(yīng)面法優(yōu)化萱草花總黃酮提取工藝結(jié)果

2.3.1響應(yīng)面法實驗設(shè)計結(jié)果 提取次數(shù)固定為2次，試驗設(shè)計方案及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面設(shè)計方案與結(jié)果

將表2中數(shù)據(jù)用 Design-Expert 10軟件進行多元模擬擬合分析，得到以萱草花中總黃酮提取含量為目標函數(shù)的二次回歸方程：Y=14.77+0.46A+0.016B-0.31C-0.23AB-0.25AC+0.82BC-1.81A2-0.44B2-1.44C2，方差分析見表3。

2.3.2兩兩因素交互作用分析 利用響應(yīng)面曲面圖來反映各因素之間的兩兩交互對萱草花中總黃酮提取含量的影響，通過軟件做了3個關(guān)鍵影響因素對萱草花中總黃酮提取含量交互影響的等高線圖及其曲面圖(圖5、6、7)，響應(yīng)值受曲線走勢影響，即越陡的曲線走勢，對總黃酮的提取含量影響越大；越平滑的曲線走勢，對總黃酮提取含量的影響越小。從等高線圖可以直觀地反映出兩變量交互作用的顯著程度，圓形表示兩因素交互作用不顯著，橢圓形表示兩因素交互作用顯著。乙醇濃度對總黃酮提取含量的影響較大，因為其曲線趨勢較陡；物料比和提取時間對其影響較小，因為其曲線趨勢較平緩。

圖5 乙醇濃度與提取時間對萱草花總黃酮提取含量的響應(yīng)曲面及等高線圖

2.3.3驗證實驗 通過Design-Expert 10軟件分析計算得出的最佳提取條件為：乙醇濃度90%，提取時間90 min，物料比1∶60(g/mL)；選擇上述提取工藝，以相同方法提取3批樣品進行驗證，測定從萱草花中提取出來的總黃酮提取量為14.87 mg/g。驗證實驗結(jié)果表明優(yōu)選的提取工藝穩(wěn)定可控。

3 討 論

總黃酮類化合物極性較小，易溶于極性較小的有機溶劑，如甲醇、乙醇等，本實驗先采用加熱回流法對乙醇濃度、提取時間、物料比及提取次數(shù)進行單因素試驗，如圖1所示，隨著乙醇濃度的持續(xù)增大，萱草花中提取的總黃酮的含量增多，當乙醇濃度為90%時，萱草花中總黃酮提取含量最高，所以90%乙醇濃度為最佳濃度。如圖2所示，當提取時間為90 min時，總黃酮提取出的含量最高，故選定90 min為最佳提取時間；通過圖3可以看出，物料比為1∶60(g/mL)時，總黃酮含量最高，因此1∶60(g/mL)為最佳物料比；由圖4可知，提取2次的總黃酮含量最高，因此選擇提取次數(shù)2次為最佳提取次數(shù)。

與其他分析方法相比，Box-Behnken 設(shè)計可以評價指標和因素間的非線性關(guān)系，操作方便，條件預(yù)測性好，對實驗影響因素研究更全面，可靠性高。建立的模型能夠很好地預(yù)測出萱草花總黃酮提取量，預(yù)測值與實際提取量差異較小，可以應(yīng)用到其他藥材總黃酮提取工藝中。本實驗采用紫外-分光光度法建立了萱草花總黃酮的提取量測定方法，在單因素試驗基礎(chǔ)上，進行響應(yīng)面法實驗。表3結(jié)果顯示，模型的擬合度值為0.000 6(P<0.01)，證明模型擬合度極顯著，可以理想地擬合各因素對萱草花總黃酮提取量的影響結(jié)果，模型的失擬項為0.223 3(P>0.05)，代表失擬項不顯著，說明此模型的實驗誤差相對較小。各因素影響強弱依次為：A>C>B。兩兩因素交互作用分析對其提取工藝進行了優(yōu)化，如圖5、6、7所示，隨著溶劑濃度的持續(xù)增加，萱草花中總黃酮提取含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，當乙醇濃度為90%，提取時間為90 min時，總黃酮被提取出的含量達到最大值。圖5響應(yīng)面的坡度趨勢較陡，等高線為橢圓形，結(jié)果表明，乙醇濃度與提取時間有很強的交互作用，乙醇濃度曲線比提取時間曲線更陡，說明乙醇濃度對總黃酮提取量的影響大于提取時間(A>B)；圖6等高線近似圓形，說明乙醇濃度與物料比交互作用較弱。圖7響應(yīng)面的坡度趨勢較陡，等高線為橢圓形，結(jié)果表明，提取時間與物料配比的交互作用較強。因此從響應(yīng)面的走勢程度可以看出，乙醇濃度對提取的總黃酮含量的影響最顯著，其次是物料比，最后是提取時間(A>C>B)，與方差分析結(jié)果一致。

圖6 乙醇濃度與物料比對萱草花總黃酮提取含量的響應(yīng)曲面及等高線圖

圖7 提取時間與物料比對萱草花總黃酮提取含量的響應(yīng)曲面及等高線圖

通過以上分析，認為實驗方法可靠，最終總黃酮最優(yōu)提取工藝條件為：乙醇濃度 90%、提取時間 90 min、物料比 1∶60 (g/mL)、提取2次，在此條件下，萱草花總黃酮提取量為14.87 mg/g，驗證實驗的結(jié)果與理論預(yù)測值相符良好。本研究確定了萱草花總黃酮的提取工藝，并為企業(yè)進一步有效開發(fā)萱草的提取利用、提高效率奠定了實驗基礎(chǔ)。