HPLC波長切換聯合梯度洗脫法同時測定舒肝顆粒(廣西標準)的活性成分含量

藍 遠1 梁 芳* 陽春苗 盤 涌 梁玉瓊

1.葫蘆娃藥業(yè)集團廣西維威制藥有限公司，廣西 南寧，530031；2.廣西中醫(yī)藥大學賽恩斯新醫(yī)藥學院，廣西 南寧，530222

舒肝顆粒(廣西標準)由夏枯草、虎杖、茵陳等九味藥材配伍而成，功效為疏肝開郁、清熱解毒、化濕健脾，臨床上主要用于治療黃疸型及非黃疸型急性肝炎，深受患者好評，在廣西有廣闊的市場前景。方中夏枯草、虎杖、茵陳、柴胡、蒲公英均有保肝作用[1-5]，在保護肝細胞、改善肝功能、減輕肝損傷、降低脂肪肝、抗肝纖維化方面具有良好的療效[6-10]。君藥夏枯草所含活性成分迷迭香酸能夠抑制肝星狀細胞的激活和增殖分化，緩解肝纖維化；臣藥虎杖所含活性成分虎杖苷通過降低TNF-α、肝脂質的過氧化和SREBP-1c介導的脂質生成來保護肝脂肪變性；虎杖所含另一活性成分大黃素等蒽醌類化合物可抑制乙型肝炎抗原陽性，多被用于治療急性黃疸型肝炎和慢性肝炎；臣藥茵陳所含活性成分綠原酸可以有效抑制四氯化碳誘導的急性肝損傷及肝纖維化、降低甲氨蝶呤誘導的肝毒性[11-14]，故本研究以迷迭香酸、虎杖苷、大黃素和綠原酸為檢測指標。由于4個活性成分分屬不同類化合物，它們的最大吸收波長不一樣，采用單一波長檢測就會造成有的成分吸收峰比較小甚至出現倒峰，故本實驗采用HPLC波長切換聯合梯度洗脫法進行含量測定，利用不同時間段的最佳檢測波長可以保證4個活性成分能夠同時出峰且響應值最大，分離效果佳，為提高原質量標準提供實驗依據。

1 材料

1.1 儀器 XS105DU十萬分之一分析天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；Agilent1200(DAD/ELSD)高效液相色譜儀及色譜工作站(美國安捷倫科技有限公司)；YH系列電熱套(江蘇近湖教學儀器廠)；RV-5A型旋轉蒸發(fā)儀(凱斯特生物化學儀器有限公司)；超聲波清洗機(上海比朗儀器有限公司)。

1.2 對照品與試劑 綠原酸對照品(批號：110753-201817，供含量測定用，含量以96.8%計)、虎杖苷對照品(批號：111575-201603，同上，含量以87.3%計)、迷迭香酸對照品(批號：111871-201706，同上，含量以90.5%計)、大黃素對照品(批號：110756-201512，同上，含量以98.7%計)，所有對照品均購自中國食品藥品檢定研究院。甲醇、乙腈購買于Fisher公司，液相用水使用娃哈哈純凈水。

1.3 藥材 夏枯草(批號：18102001)、茵陳(批號：18022701)、蒲公英(批號：18082202)、甘草(批號：18102801)、蒼術(批號：18092504)、北柴胡(批號：18102202)、虎杖(批號：18051501)來源于廣西寶正藥業(yè)有限公司。馬蘭草、白茅根購自廣西玉林藥市，經我院中藥鑒定教研室苑敏副教授鑒定為馬蘭草系菊科植物馬蘭頭Kalimerisindica(L.)的干燥全草，白茅根系禾本科植物白茅ImperatacylindricalBeauv.var.major(Nees)C.E.Hubb.的干燥根莖。

2 舒肝顆粒的制備

按處方量稱取夏枯草100 g和虎杖75 g，加12倍量60%乙醇回流提取2次，每次80 min，濾過，合并醇提液，回收乙醇，濃縮至比重為1.26(80 ℃ 熱測)的清膏，備用。稱取茵陳、蒲公英、馬藍草、柴胡各75 g和蒼術、白茅根、甘草各 50 g，加入18倍量水,浸泡40 min后，煎煮2次，每次1.3 h，濾過，合并水提液，濃縮至比重為1.26(80 ℃熱測)的清膏，與上述醇提清膏合并，混勻。以清膏1份，加糖粉3份和糊精1.5份混勻，制成顆粒，干燥，即得。按上述方法制備三批舒肝顆粒，批號分別為：20200701、20200702、20200703。

3 含量測定

3.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 固定相為CAPCELL PAK C18(250 mm×4.6 mm，5μm)；流動相為乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)，設定梯度洗脫程序為：0～20 min，10%A；20～32 min，10%→20%A；32～40 min，20%→35%A；40～45 min，35%→70%A；45～55 min，70%→80%A；55～60 min，80%→90%A；檢測波長為0～20 min，327 nm，20～60 min，306 nm；流速為1.0 mL/min；進樣量為10 μL；柱溫為30 ℃。分別取供試品溶液和混合對照品溶液進樣分析，結果顯示，供試品溶液HPLC圖中綠原酸、虎杖苷、迷迭香酸、大黃素4個成分的保留時間與混合對照品溶液HPLC圖保留時間一致，分離度分別為18.74、15.77、3.36、22.70，理論塔板數分別為11246、398312、859974、1461240，結果如圖1、圖2所示。

3.2 混合對照品儲備液的制備 精密稱定綠原酸對照品3.2 mg、虎杖苷對照品5.3 mg、迷迭香酸對照品3.4 mg、大黃素對照品2.1 mg，置25 mL量瓶中，加60%乙醇適量，超聲使溶解，再加60%乙醇稀釋至刻度，搖勻，備用?；旌蠈φ掌穬湟簼舛葹榫G原酸123.9 μg/mL、虎杖苷 185.1 μg/mL、迷迭香酸123.1 μg/mL、大黃素80.64 μg /mL。

1.綠原酸；2.虎杖苷；3.迷迭香酸；4.大黃素

圖2 供試品溶液HPLC圖

3.3 供試品溶液的制備 取舒肝顆粒(批號：20200701)適量，研細，混勻，約取4 g，精密稱定，置50 mL量瓶中，加60%乙醇適量，超聲處理30 min，放冷，再用60%乙醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

3.4 線性關系考察 分別精密吸取混合對照品儲備液0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL置10 mL量瓶中，加60%乙醇稀釋至刻度，搖勻，制成6個梯度濃度的混合對照品溶液，進樣測定，記錄色譜圖。以對照品濃度μg·mL-1為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)，繪制標準曲線并計算回歸方程。結果見表1。

表1 線性關系考察結果

3.5 精密度試驗 精密吸取“3.2”項下的混合對照品儲備液2.0 mL，置10 mL量瓶中，加60%乙醇稀釋至刻度，搖勻，得混合對照品溶液，濃度為綠原酸24.78 μg /mL、虎杖苷37.02 μg /mL、迷迭香酸24.62 μg /mL、大黃素16.13 μg /mL。連續(xù)進樣6次，綠原酸、虎杖苷、迷迭香酸、大黃素的峰面積平均值分別為453.2、1220.0、285.7、177.4，RSD值分別為0.33%、0.14%、0.04%、0.08%。

3.6 穩(wěn)定性試驗 取同一份舒肝顆粒(批號：20200701)供試品溶液，室溫下放置，分別于 0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h進樣測定，4種成分峰面積平均值為583.7、1090.0、310.2、170.8，RSD值為0.08%、0.07%、0.21%、0.11%。

3.7 重復性試驗 取同一批次舒肝顆粒(批號：20200701)6份，每份4 g，精密稱定，依法制備成供試品溶液，進樣測定，得4種成分的含量平均值為0.3783 mg/g、0.4127 mg/g、0.3370 mg/g、0.1955 mg/g，RSD值為0.51%、0.25%、1.09%、1.20%。

3.8 加樣回收率試驗 精密稱定已知含量的舒肝顆粒(批號：20200701)6份，每份2 g，置 50 mL 量瓶中，分別精密加入混合對照品溶液 0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL，按“3.3”項下方法制備成供試品溶液，進樣分析，計算平均回收率和RSD，結果均符合要求。詳見表2。

表2 加樣回收率試驗結果

表2(續(xù))

3.9 樣品測定 取舒肝顆粒三批(批號：20200701、20200702、20200703)各4 g，精密稱定，依法操作，進樣分析。結果見表3。

表3 含量測定結果 (mg/g，n=3)

4 討論

4.1 指標成分的選擇 舒肝顆粒(廣西標準)由九味藥材配伍而成，夏枯草為君藥，清肝瀉火、散結消腫，配以茵陳、虎杖為臣，輔以清肝膽濕熱，退黃疸之效。柴胡疏肝解郁退熱，馬藍草、蒲公英清熱解毒抗炎、消腫散結，蒼術健脾燥濕，白茅根涼血清熱利尿，使得濕熱從小便去，作為使藥的甘草養(yǎng)陰生津、益氣和胃，與諸藥合用，共奏疏肝開郁、清熱解毒、健脾化濕之功效。本研究參考《中國藥典》2015年版一部藥材質量標準[15]，選取處方中的君藥夏枯草活性成分迷迭香酸，臣藥茵陳活性成分綠原酸及虎杖活性成分虎杖苷、大黃素，采用HPLC法建立該藥品的定量方法，以期更加全面地評價舒肝顆粒的內在質量。

4.2 供試品溶液提取方法考察 根據待測成分的理化性質及溶解度，分別考察超聲提取法和回流提取法兩種提取方式，HPLC色譜圖顯示回流提取法產生的雜質峰較多，會干擾到待測成分的分離，故選擇產生雜質峰較少的超聲提取法。再分別考察提取時間20 min、30 min、40 min、60 min下的提取率，實驗結果表明超聲提取30 min時提取率較高且時間較短，故供試品溶液的提取方法選擇超聲提取30 min。

4.3 檢測波長的選擇 切換波長法是高效液相色譜法中同時檢測多組分含量測定時常用的一種方法。本研究測定綠原酸、虎杖苷、迷迭香酸、大黃素4個組分的最大吸收波長分別為327 nm、306 nm、330 nm、254 nm，采用單波長檢測時不能使待測組分的響應值達到最大，甚至在檢測波長為254 nm時虎杖苷峰和迷迭香酸峰呈現倒峰，在檢測波長為330 nm時大黃素峰呈現倒峰，因此必須采用切換波長法才能保證4個組分能同時出峰。經過預實驗多次摸索，最終確定在0～20 min檢測波長為327 nm，20～60 min檢測波長為306 nm，可以使4個組分在高靈敏度下被檢出，同時還可以使不需要檢出的成分或干擾成分出峰較小，甚至不出峰，從而有效提高檢測結果。

4.4 流動相的選擇 舒肝顆粒所含藥材成分多且化學性質多樣，采用HPLC恒流測定無法將待測成分有效分離，故選擇梯度洗脫法同時測定4個成分的含量。本研究先后考察不同的流動相系統(tǒng)對待測成分的分離效果，比較色譜峰峰形、分離度、分析時間長短、基線漂移及雜質峰干擾等情況后，最終確定用乙腈-0.1%磷酸溶液梯度洗脫60 min作為HPLC梯度洗脫法，得到的色譜圖符合系統(tǒng)適用性試驗要求。

5 小結

舒肝顆粒(廣西標準)原名為舒肝沖劑，收載于廣西藥品標準(一九八四年版)，標準編號為桂Q/WS-1-380-84。原質量標準因受到歷史條件局限無法進行含量測定檢測項目，不利于控制其內在質量，本研究是在原質量標準基礎上增加了該藥品的定量方法，保障了臨床用藥安全，可用于舒肝顆粒(廣西標準)的質量控制，預期舒肝顆粒(廣西標準)能夠進一步被《中國藥典》收載。提升原質量標準為開發(fā)利用具有廣西特色民族中藥制劑提供新思路。