新型生物催化劑催化合成植物甾醇酯工藝優(yōu)化

劉鑫龍，王立暉

（天津現(xiàn)代職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程學(xué)院，天津 300350）

心腦血管疾病威脅人類身體健康，而高膽固醇水平和高低密度脂蛋白膽固醇則是引發(fā)心血管疾病的最危險因素[1]。植物甾醇酯被認(rèn)為是“降低血脂、預(yù)防動脈硬化”的天然食品新原料，是國際營養(yǎng)學(xué)會推薦的未來十大功能性營養(yǎng)成分之一[2]。

目前植物甾醇酯的合成方法可分為化學(xué)合成法和生物酶法兩種。化學(xué)合成法多采用酸或堿性物質(zhì)作為催化劑，合成工藝條件簡單、易于操作。但是該方法副產(chǎn)物多、產(chǎn)物分離提純困難、廢液多、環(huán)境污染嚴(yán)重[1，3]。與此相反，生物酶法采用脂肪酶作為催化劑，其工藝不僅反應(yīng)條件溫和、能耗低、副產(chǎn)物少，而且無溶劑污染[4]。但是受限于游離脂肪酶穩(wěn)定性差和易團(tuán)聚等缺點(diǎn)，甾醇酯產(chǎn)率普遍較低，且無法回收再利用，導(dǎo)致生產(chǎn)成本高[5]。利用載體固定化酶是解決該問題的有效方法，該方法操控過程簡單、條件溫和、酶活回收率高、催化劑穩(wěn)定性好且極易與反應(yīng)體系分離，簡化了提純工藝，有利于產(chǎn)品收率和質(zhì)量的提升[6-7]。Zheng等[8]利用二氧化硅固定化脂肪酶并用于合成植物甾醇酯，當(dāng)反應(yīng)條件為植物甾醇100 μmol/mL、醇酸摩爾比1∶2、反應(yīng)溫度55℃、反應(yīng)時間24 h時植物甾醇轉(zhuǎn)化率為95.3%。固定化酶重復(fù)使用7次后，僅保留78.6%的初始活性，說明該固定化酶穩(wěn)定性仍較差，尚有改進(jìn)空間。

針對上述問題，采用Winsor III微乳液雙連續(xù)相體系構(gòu)建一種具有分級孔剖面的介孔有機(jī)二氧化硅材料作為固定化酶的載體，受益于其內(nèi)部數(shù)量眾多的多級孔隙結(jié)構(gòu)形成的高比表面積和強(qiáng)吸附能力，非常適合吸附各種分子物質(zhì)，促進(jìn)分子擴(kuò)散[6，9]。本文以介孔有機(jī)硅球?yàn)檩d體，通過吸附法固定化皺褶假絲酵母脂肪酶并用于植物甾醇酯的合成。利用單因素法和響應(yīng)面法探究催化劑的性能和底物類型、底物濃度、酶用量等條件對合成反應(yīng)的影響，并篩選獲得最佳合成條件，為植物甾醇酯的擴(kuò)大生產(chǎn)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

皺褶假絲酵母脂肪酶（15 U/mg）：杭州創(chuàng)科生物科技有限公司；植物甾醇（β-谷甾醇73.96%、菜籽甾醇17%、豆甾醇5%、菜油甾醇1%、甾醇總量95.19%）：西安藍(lán)天生物工程有限公司；油酸、亞油酸、亞麻酸、硬脂酸、棕櫚酸（均為分析純）：天津市大茂化學(xué)試劑廠；乙醇、異辛烷、磷酸一氫鈉、磷酸二氫鉀（均為分析純）：百靈威科技有限公司；4-硝基苯基棕櫚酸酯、三乙醇胺、正硅酸乙酯、1，2-二（三乙氧基硅基）乙烷（均為分析純）：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；十六烷基三甲基氯化銨（分析純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

水浴恒溫振蕩器（SHA-C）：金壇市城西崢嶸試驗(yàn)儀器廠；集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（DF-101S）：河南予華儀器有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9203A）：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；臺式高速離心機(jī)（TG18G）：鹽城凱特試驗(yàn)儀器有限公司；氣相色譜儀（SP-1000）：北京北分瑞利（集團(tuán)）色譜儀器中心；透射電子顯微鏡（Tecnai G2）：美國 FEI公司。

1.3 方法

1.3.1 介孔有機(jī)硅球和生物催化劑的制備

利用三乙醇胺作為堿源，通過硅前驅(qū)體的水解制備具有三維纏繞特征的介孔有機(jī)硅球，具體過程如下。首先將13 mL去離子水與1.0 mL 95%乙醇混合，再加入2.0 mL 25%十六烷基三甲基氯化銨水溶液和0.9 mL三乙醇胺，并于室溫25℃下攪拌30 min，然后加入1.5 mL正硅酸乙酯和1，2-二（三乙氧基硅基）乙烷的混合液。攪拌均勻后將混合物置于60℃的電熱鼓風(fēng)干燥箱中恒溫靜置2 h。向上述混合物中加入10 mL 乙醇，攪拌均勻后離心（5 000 r/min）3 min，獲得不透明的沉淀，即為三維纏繞的介孔有機(jī)硅球（mesoporous organicsilica spheres，MOSs）。

生物催化劑的制備：稱取15 mg介孔有機(jī)硅球MOSs于10 mL離心管中，加入一定量的皺褶假絲酵母脂肪酶溶液（Candida rugosa lipase，CRL），并補(bǔ)充pH7.0 50 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）至5mL，室溫 25℃下置于搖床中振蕩（170r/min），2.5 h后離心分離，利用PBS洗滌3次，冷凍干燥獲得固定化酶CRL@MOSs。在水解4-硝基苯基棕櫚酸酯的試驗(yàn)中測定CRL@MOSs的活力為4 000 U/g（每分鐘生成1 nmol對硝基苯酚所需的酶量為1 U）[10-11]。

1.3.2 植物甾醇酯的合成

植物甾醇酯的合成與檢測：由于植物甾醇的溶解性較差，在耐壓瓶中預(yù)先以異辛烷為溶劑配制10 mmol/L的植物甾醇溶液，并恒溫（55℃）保存?zhèn)溆肹12]。取2 mL的植物甾醇溶液，加入100 μL的蒸餾水和雙倍摩爾量的脂肪酸，于55℃水浴鍋中加熱5 min形成均相溶液。向其中加入10 U CRL@MOSs后將混合物置于35℃的水浴恒溫振蕩器（120 r/min）中開始合成反應(yīng)。每隔一段反應(yīng)時間取10 μL樣品通過氣相色譜分析計算植物甾醇的轉(zhuǎn)化率[13]。每個樣品檢測3次。轉(zhuǎn)化率計算公式如下。

式中：A為植物甾醇峰面積總和；B為植物甾醇酯峰面積總和；1.63為植物甾醇酯分子質(zhì)量均值與植物甾醇分子質(zhì)量均值的比值。

氣相色譜條件：毛細(xì)管柱長30 m，內(nèi)徑0.25 mm。程序升溫：初始溫度為160℃并保持2 min，然后以速率15.0℃/min升溫到220℃保持1 min。以8℃/min從220℃升溫到260℃，并保持10 min。進(jìn)樣器溫度240℃，檢測室溫度280℃，尾氣氣速20 mL/min，進(jìn)樣量0.4μL。

1.3.3 植物甾醇酯的合成過程優(yōu)化

1.3.3.1 單因素試驗(yàn)優(yōu)化

為了獲得植物甾醇酯的最大產(chǎn)率，首先利用單因素試驗(yàn)分析在異辛烷/水兩相條件下底物類型（油酸、亞油酸、硬脂酸、棕櫚酸）、反應(yīng)溫度（30、35、40、45、50、55 ℃）、酶用量（5、10、15、20、25、30 U）、底物濃度（5、10、20、30、40、50 mmol/L）和反應(yīng)時間（6、8、10、12、14 h）對植物甾醇轉(zhuǎn)化率的影響并以植物甾醇轉(zhuǎn)化率作為評價指標(biāo)，確定各因素的最適取值區(qū)間用于響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化[14]。

1.3.3.2 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗(yàn)分析結(jié)果，選擇酶用量（10 U～30 U）、底物濃度（10 mmol/L～50 mmol/L）、反應(yīng)溫度（35℃～55℃）、反應(yīng)時間（6 h～14 h）為自變量，植物甾醇轉(zhuǎn)化率為響應(yīng)變量，采用響應(yīng)面分析法的中心組合設(shè)計法（central complex design，CCD），利用軟件 Desigh Expert 8.0.6設(shè)計四因素五水平試驗(yàn)，因素及水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Response surface experimental factors and levels

1.3.4 CRL@MOSs的重復(fù)使用性分析

每輪反應(yīng)結(jié)束后，離心分離CRL@MOSs（4 000 r/min、5 min），并用乙醇快速洗滌3次去除殘留底物，靜置干燥0.5 h。完成催化劑的再生后，重復(fù)上述反應(yīng)步驟開展下一輪催化反應(yīng)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

選用Desgin-Expert 8.0.6和Origin 2017軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 MOSs的表征

MOSs的透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）圖見圖 1。

圖1 MOSs的TEM圖Fig.1 TEM image of MOSs

由圖1所示，MOSs的TEM圖像展示了三維纏繞的不規(guī)則介孔有機(jī)硅球的形態(tài)，該材料枝杈眾多且彼此交織成三維網(wǎng)絡(luò)，形成了豐富的開放孔道。單一MOSs直徑約1.5 μm，其中每一個枝杈的直徑約28.73 nm，長徑比為 3 ∶1～2 ∶1。

2.2 植物甾醇酯合成工藝單因素試驗(yàn)

2.2.1 底物類型對植物甾醇轉(zhuǎn)化率的影響

底物類型對植物甾醇轉(zhuǎn)化率的影響見圖2。

圖2 底物類型對植物甾醇轉(zhuǎn)化率的影響Fig.2 The effect of type of substrate on the conversion of phytosterol

由圖2可知，以棕櫚酸為底物時的植物甾醇轉(zhuǎn)化率最高，隨著底物碳鏈長度和不飽和度的增加，轉(zhuǎn)化率逐漸降低，可能是不同脂肪酸三維結(jié)構(gòu)的差異導(dǎo)致。棕櫚酸和硬脂酸的直鏈分別由16個和18個碳原子組成，而油酸和亞油酸分子是不飽和的18碳酸，由于其結(jié)構(gòu)中的不同位置存在不同數(shù)量的雙鍵而發(fā)生不同程度地折疊，導(dǎo)致其更加難以接近酶的催化中心[15]。此外，碳鏈較長和不飽和度更高的脂肪酸在擴(kuò)散過程中會遇到更大的空間位阻，這也是造成轉(zhuǎn)化率較低的原因之一[12]。綜上，選用棕櫚酸作為底物，展開后續(xù)優(yōu)化工作。

2.2.2 底物濃度對植物甾醇轉(zhuǎn)化率的影響

底物濃度對植物甾醇轉(zhuǎn)化率的影響見圖3。

圖3 底物濃度對植物甾醇轉(zhuǎn)化率的影響Fig.3 The effect of substrate concentration on the conversion of phytosterol

由圖3可知，底物濃度為5 mmol/L～30 mmol/L時，酯化反應(yīng)速度迅速提升，植物甾醇轉(zhuǎn)化率呈現(xiàn)快速增長趨勢；當(dāng)?shù)孜餄舛瘸^30 mmol/L時，反應(yīng)速度和甾醇轉(zhuǎn)化率均開始降低。這是因?yàn)樵陔p底物酯化反應(yīng)中，過量的底物（棕櫚酸）有利于植物甾醇酯的合成，但也會導(dǎo)致反應(yīng)體系黏度增大，抑制底物分子擴(kuò)散，導(dǎo)致植物甾醇轉(zhuǎn)化率降低。綜合考慮生產(chǎn)成本和反應(yīng)效率，選擇30 mmol/L作為后續(xù)反應(yīng)的底物濃度。

2.2.3 酶用量對植物甾醇轉(zhuǎn)化率的影響

酶用量對植物甾醇轉(zhuǎn)化率的影響見圖4。

圖4 酶用量對植物甾醇轉(zhuǎn)化率的影響Fig.4 The effect of enzyme dosage on the conversion of phytosterol

由圖4可知，隨著酶用量的增加（5 U～20 U），植物甾醇轉(zhuǎn)化率也迅速上升。脂肪酶作為催化劑，可以明顯提高反應(yīng)速度；增加酶用量可以提高單位反應(yīng)時間內(nèi)的底物轉(zhuǎn)化率。然而，繼續(xù)增加酶用量，卻會導(dǎo)致轉(zhuǎn)化率降低。這是因?yàn)镃RL@MOSs具有非常豐富的孔道結(jié)構(gòu)，因此能夠持續(xù)吸附大量底物分子堆積于顆粒內(nèi)部，明顯增大自由擴(kuò)散阻力和與酶活性中心結(jié)合的難度，而且該現(xiàn)象隨著CRL@MOSs用量的增加而加強(qiáng)。因此，選擇20 U作為后續(xù)反應(yīng)的酶用量。

2.2.4 反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間對植物甾醇轉(zhuǎn)化率的影響

反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間對植物甾醇轉(zhuǎn)化率的影響見圖5。

圖5 反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間對植物甾醇轉(zhuǎn)化率的影響Fig.5 The effect of reaction temperature and reaction time on the conversion of phytosterol

由圖5可知，同一溫度轉(zhuǎn)化率整體呈上升的趨勢。隨著溫度的升高（30℃～45℃），植物甾醇轉(zhuǎn)化率逐漸增加；在45℃（反應(yīng)時間12 h）時，轉(zhuǎn)化率達(dá)到最大值94.89%；此后繼續(xù)提高溫度，轉(zhuǎn)化率開始下降，而且溫度越高，轉(zhuǎn)化率下降越明顯。這是因?yàn)榈蜏丨h(huán)境不利于底物分子擴(kuò)散及與酶活性中心的結(jié)合，進(jìn)而限制酶活性；而升高反應(yīng)溫度，不僅能釋放生物酶的催化性能還能提高底物溶解度和促進(jìn)分子擴(kuò)散，但是太高的溫度會促使酶空間結(jié)構(gòu)變化，嚴(yán)重時導(dǎo)致酶蛋白變性失活。因此，選擇45℃為最佳反應(yīng)溫度。

圖5同樣描述了45℃條件下植物甾醇酯合成的進(jìn)程曲線。隨著反應(yīng)時間的推移，植物甾醇轉(zhuǎn)化率逐漸提高。酯化反應(yīng)時間為10h時，植物甾醇轉(zhuǎn)化率達(dá)到94.28%；繼續(xù)反應(yīng)2 h，轉(zhuǎn)化率（95.39%）增長不明顯?？紤]成本因素，選擇10h作為后續(xù)工藝優(yōu)化的反應(yīng)時間。

2.3 植物甾醇酯合成條件的響應(yīng)面優(yōu)化

響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果Table 2 Response surface experimental scheme and results

續(xù)表2 響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果Continue table 2 Response surface experimental scheme and results

表3 回歸模型及方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model

由表2可知，甾醇最低轉(zhuǎn)化率為59.0%，最大轉(zhuǎn)化率為95.4%。利用3D響應(yīng)面更細(xì)致地研究各因素水平對甾醇轉(zhuǎn)化率的影響，構(gòu)建多項(xiàng)式方程：轉(zhuǎn)化率=611.68358+6.670 16A+3.789 87B+20.147 62C+17.755D+0.018 175AB-0.067 375AC+0.012 25AD+0.006 75BC+0.08075BD+0.0835CD-0.073137A2-0.12905B2-0.20535C2-1.042 79D2。

由表3可知，模型P＜0.000 1，失擬項(xiàng)P=0.065 1說明模型極顯著，失擬項(xiàng)不顯著，模型方程誤差小，可以用于數(shù)據(jù)分析和結(jié)果預(yù)測[16]。底物濃度、酶用量、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間的P值均小于0.01，表明對轉(zhuǎn)化率均有極顯著影響；此外，底物濃度和酶用量、底物濃度和反應(yīng)溫度、酶用量和反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間的交互作用對轉(zhuǎn)化率同樣具有顯著或極顯著影響[16]。校正決定系數(shù)R2Adj數(shù)值為0.985 5，表明某產(chǎn)量98.55%的變異分布在方程的因子中；與相關(guān)系數(shù)R2（0.992 5）數(shù)值接近，表明產(chǎn)量的實(shí)測值與預(yù)測值之間具有較好的擬合度，該模型可用于預(yù)測植物甾醇的實(shí)際轉(zhuǎn)化率[17]。Adeq-Precision為檢測到的噪音信號的比率，其值通常大于4，本試驗(yàn)數(shù)值為36.669，進(jìn)一步說明本模型能真實(shí)地反映試驗(yàn)結(jié)果[18]。

各因素交互作用及對植物甾醇轉(zhuǎn)化率影響的響應(yīng)面見圖6。

圖6 各因素交互作用對植物甾醇轉(zhuǎn)化率影響的響應(yīng)面Fig.6 Response surface plots showing effect of the interaction of various factors on phytosterol conversion efficiency

由圖6可知，A（底物濃度）與B（酶用量）、A（底物濃度）與C（反應(yīng)溫度）、B（酶用量）與D（反應(yīng)時間）、C（反應(yīng)溫度）與D（反應(yīng)時間）的響應(yīng)面較陡峭，形似“傘狀”，說明因素間交互作用對植物甾醇轉(zhuǎn)化率的影響顯著，而A（底物濃度）與D（反應(yīng)時間）、B（酶用量）與C（反應(yīng)溫度）的曲面較為平緩，說明交互作用不顯著，這與表3方差分析的結(jié)果一致。

2.4 優(yōu)化工藝驗(yàn)證

響應(yīng)面分析結(jié)果表明，植物甾醇酯最佳合成條件為以棕櫚酸作為底物，底物濃度27.47 mmol/L，酶用量21.42 U，反應(yīng)溫度47.226℃，反應(yīng)時間11.393 h，此條件下多項(xiàng)式預(yù)測轉(zhuǎn)化率為97.346%。為了確定預(yù)測結(jié)果的可靠性，開展3次平行試驗(yàn)加以驗(yàn)證?？紤]試驗(yàn)的便利性，將反應(yīng)條件調(diào)整為底物濃度27.5 mmol/L、酶用量21.4 U、反應(yīng)溫度47.2℃、反應(yīng)時間11.4 h，最終植物甾醇的實(shí)際轉(zhuǎn)化率為（96.8±0.7）%，與預(yù)測結(jié)果接近。

2.5 CRL@MOSs的重復(fù)使用性

催化劑的重復(fù)使用性能是衡量催化劑應(yīng)用價值的一個重要參數(shù)，性能優(yōu)異的催化劑能有效降低工藝成本。CRL@MOSs的重復(fù)使用性見圖7。

圖7 CRL@MOSs的重復(fù)使用性Fig.7 The reusability of CRL@MOSs

由圖7可知，CRL@MOSs第一次用作催化劑時，植物甾醇轉(zhuǎn)化率為97.16%；重復(fù)使用10次后，轉(zhuǎn)化率為97.11%，衰減并不明顯。由此可見，CRL@MOSs具有良好的重復(fù)使用性。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以介孔有機(jī)硅球作為載體，利用其3D開放孔隙特征吸附脂肪酶CRL構(gòu)建性能優(yōu)異的生物催化劑CRL@MOSs，并用于催化合成植物甾醇酯。通過單因素試驗(yàn)分析不同碳鏈長度和飽和度的脂肪酸、底物濃度、酶用量、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間對植物甾醇轉(zhuǎn)化率的影響，確定最佳的底物類型等反應(yīng)條件。借助響應(yīng)面分析法，篩選并獲得植物甾醇酯的最優(yōu)合成條件：棕櫚酸作為底物，底物濃度為27.5 mmol/L、酶用量21.4 U、反應(yīng)溫度47.2℃和反應(yīng)時間11.4 h，植物甾醇的最大轉(zhuǎn)化率為（96.8±0.7）%。同時，CRL@MOSs在重復(fù)使用10次后，植物甾醇的轉(zhuǎn)化率未見明顯降低，為97.11%，說明其具有優(yōu)秀的穩(wěn)定性。