通過式固相萃取-超高效合相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定保健食品中19 種性激素

楊光勇，梁秋艷，陽 勝，羅 巖，宋 敏，袁 輝

（新疆維吾爾自治區(qū)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院，新疆 烏魯木齊 830011）

性激素對于促進胎兒肝膽發(fā)育、維持人體正常的生理特性、調(diào)節(jié)人類的精神狀態(tài)和認知能力等至關(guān)重要。此外，適量的性激素治療對于延長癌癥患者存活期具有積極作用。但過度攝入性激素則會導致兒童性早熟、人體內(nèi)分泌紊亂，甚至危害生殖功能。隨著國內(nèi)人口老齡化以及國民保健意識的提高，保健食品逐步走入廣大家庭。但是，近年相關(guān)研究顯示，國內(nèi)保健食品中性激素的非法添加狀況不容樂觀。因此，監(jiān)測和評估保健食品中性激素的暴露風險對于保護消費者身心健康、維持正常的市場經(jīng)濟秩序等意義重大。

目前，性激素的檢測方法有膠體金法、免疫分析法、毛細管電泳法，這些方法分別存在定性分析能力差、定量分析結(jié)果不可靠等缺點。液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法和液相色譜-質(zhì)譜法也是分析性激素的常用方法。液相色譜法操作簡單、應用廣泛，但該方法定性能力不足，難以進行多組分同時分析。激素類化合物具有沸點高、揮發(fā)性低等特性，在使用氣相色譜-質(zhì)譜法進行檢測時，需將性激素衍生為低沸點化合物，該操作不僅繁瑣，還會影響定量結(jié)果的準確性。液相色譜-質(zhì)譜法可有效彌補上述方法的不足，已成為檢測性激素的重要方法之一，但該方法在進行正/負離子同時測定時，只能選擇促離子化能力較為折中的流動相添加劑，無法最大程度地提高每一類性激素的質(zhì)譜響應。

超高效合相色譜（ultra performance convergence chromatography，UPCC）以超臨界CO為主要流動相，具有分離效率高、傳質(zhì)速率快等優(yōu)點，較傳統(tǒng)超臨界流體色譜更易操作，已被成功應用于糖皮質(zhì)激素、神經(jīng)酰胺等多種生理活性化合物的分析。UPCC在性激素檢測領(lǐng)域的應用較少，龐道標等采用UPCC-二極管陣列檢測器對化妝品中違法添加的6 種性激素進行檢測，4 min內(nèi)即可實現(xiàn)基線分離，方法快速準確，但定性能力有待提高；Toit等采用UPCC-串聯(lián)質(zhì)譜測定了人體組織和血液中的11-羥基睪酮等3 種性激素，獲得滿意的分析結(jié)果；Quanson等采用UPCC-串聯(lián)質(zhì)譜對細胞培養(yǎng)液中的11-酮二氫睪酮等多種雄激素進行了分析，與反相超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法相比，靈敏度提高了5～50 倍，該方法靈敏度高、分離效果好，但需要使用多種氘代內(nèi)標物質(zhì)，這些內(nèi)標物質(zhì)價格昂貴且難以獲取，限制了方法的進一步推廣。本實驗采用通過式固相萃取法對樣品進行凈化，以期建立UPCC-串聯(lián)質(zhì)譜測定保健食品中19 種性激素含量的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

VE軟膠囊、膠原蛋白粉、蛋白粉均為客戶委托樣品。

19 種性激素標準品（純度≥96.3%）購自加拿大Toronto Research Chemicals公司、德國Dr.Ehrenstorfer公司、美國Sigma-Aldrich公司、美國Steraloids公司；正己烷、甲醇、乙腈（均為色譜純） 美國Thermo Fisher公司；氨水（=25%～28%）、甲酸（優(yōu)級純） 美國Sigma-Aldrich公司；層析硅膠（200～300 目） 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UPCC-TQS UPCC-三重四極桿質(zhì)譜儀（配有電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI）及MassLynx V 4.1 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)）、PRiME HLB 固相萃取柱（150 mg/3 mL） 美國Waters公司；Syncore Analyst平行蒸發(fā)定量濃縮儀 瑞士Büchi公司。

1.3 方法

1.3.1 標準品溶液的制備

稱取適量各性激素標準品，用甲醇溶解并稀釋成質(zhì)量濃度為1 g/L的單標儲備液；再準確吸取適量各單標儲備液，用甲醇稀釋成質(zhì)量濃度為1 mg/L的混合標準使用液。將上述溶液置于-22 ℃冰箱保存。

1.3.2 樣品溶液的制備

將軟膠囊剖開，取油狀內(nèi)容物充分混勻；蛋白粉樣品直接取用。稱取2 g（精確至0.001 g）樣品至15 mL具塞玻璃離心管中。在裝有油狀樣品的離心管中加入10 mL正己烷，渦旋使樣品溶解，加入2.0 g硅膠粉，渦旋混合2 min，5 000 r/min離心5 min，棄去正己烷溶液，在沉淀物中加入10 mL甲醇，渦旋混合2 min，5 000 r/min離心5 min，取甲醇溶液待凈化。在裝有固體樣品的離心管中加入少量純水，靜置15 min使樣品充分潤濕，加入10 mL甲醇（含體積分數(shù)1%甲酸），渦旋混勻1 min，超聲提取15 min，加入1.0 g無水硫酸鎂，渦旋混合1 min，5 000 r/min離心5 min，取甲醇溶液待凈化。將5 mL甲醇提取液轉(zhuǎn)移至PRiME HLB固相萃取柱（150 mg/3 mL），收集流出液，待溶液流盡后加入4 mL乙腈洗脫，收集、合并流出液和洗脫液，45 ℃真空定量濃縮至1 mL，過0.22 μm濾膜。

1.3.3 儀器條件

（2）合理設(shè)置施工段數(shù)。以滿足正常的專業(yè)工種能力為基礎(chǔ)，施工段數(shù)如果設(shè)置過多，施工人員和施工設(shè)施會有所增加，施工難度也會有所增加，阻礙正常的施工組織開展。施工段數(shù)如果設(shè)置過少，也會對整個工程的進度產(chǎn)生嚴重的影響。

色譜條件：UPCC Torus 2-PIC 色譜柱（3.0 mm×100 mm，1.7 μm）；柱溫為45 ℃；流動相：A為超臨界CO，B為甲醇（含體積分數(shù)0.1%甲酸）；流速為1.25 mL/min。洗脫梯度程序：0～2.0 min，97.5% A、2.5% B；2.0～8.0 min，97.5%～88% A、2.5%～12% B；9.0～10.0 min，88%～97.5% A、12%～2.5% B。系統(tǒng)背壓13.79 MPa；補償液C和D分別為97%甲醇溶液（含體積分數(shù)0.2%甲酸）、98%乙腈溶液（含體積分數(shù)0.2%氨水），補償液切換時間為1.9～2.4 min，100% D，5.0～5.5 min，100% D，其余時間段為100% C；補償液流速為0.3 mL/min；進樣體積為2 μL。

質(zhì)譜參數(shù)：ESI源，雄激素、孕激素采用正離子電離模式，雌激素采用負離子電離模式；采集方式為多反應監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）模式；離子源溫度150 ℃；去溶劑氣流量750 L/h；去溶劑氣溫度400 ℃；毛細管電壓3.0 kV。

19 種性激素的基本信息見表1。

表1 19 種性激素的保留時間、CAS號、相對分子質(zhì)量、母離子及子離子Table 1 Retention times,CAS numbers,relative molecular masses (Mr),parent ions,daughter ions of 19 sex hormones

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜和質(zhì)譜條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜柱的選擇

19 種性激素均為環(huán)戊烷多氫菲衍生物，其中有4 組共12 種化合物互為同分異構(gòu)體，甚至差向異構(gòu)體，實驗需選用合適的色譜柱，以實現(xiàn)上述化合物的基線分離，避免具有相同/的母離子和子離子相互干擾。為此，實驗分別考察Torus 2-PIC（3.0 mm×100 mm，1.7 μm）、HSS CSB（2.1 mm×150 mm，1.8 μm）、BEH（3.0 mm×100 mm，1.8 μm）3 種色譜柱對分離效果的影響。結(jié)果表明，選用HSS CSB色譜柱和BEH色譜柱均無法實現(xiàn)11-羥孕酮和11-羥孕酮、雄酮和表雄酮等差向異構(gòu)體的基線分離；選用Torus 2-PIC色譜柱時，各目標化合物分離效果最好，可能由于該色譜柱填料提供的偶極-偶極、電子轉(zhuǎn)移、π-π等多重作用可有效識別出目標物空間結(jié)構(gòu)的微小差異。但選用Torus 2-PIC色譜柱時，雌激素色譜峰略有拖尾，仍需進一步優(yōu)化其他色譜條件。

2.1.2 色譜柱溫度及系統(tǒng)背壓的選擇

超臨界CO的洗脫能力會隨色譜柱溫度和系統(tǒng)背壓的改變而變化，當柱溫升高、背壓減小時，流動相密度變小，洗脫能力降低，化合物保留時間延長。實驗分別考察不同柱溫（25、35、45、55 ℃）、不同背壓（12.07、13.10、13.79、14.48 MPa）對分離效果的影響。結(jié)果表明，化合物的分離效果并未隨背壓的改變而出現(xiàn)明顯變化；柱溫升高時，分離趨勢增加，當柱溫超過45 ℃后，分離度反而減小，可能因為升高柱溫加劇了分子的熱運動，從而改變了化合物在色譜柱中的保留特性。綜合考慮分離度、系統(tǒng)壓力極限等因素，選取45 ℃色譜柱溫度、13.79 MPa系統(tǒng)背壓為測定條件。

2.1.3 助溶劑的選擇

實驗在優(yōu)化的色譜條件下對19 種性激素混合標準溶液（20 μg/L）進行測定，其提取離子流色譜圖見圖1。經(jīng)計算，圖1中個別性激素色譜峰的理論塔板數(shù)高達10，由此表明，UPCC具有出色的分離效率。

圖1 19 種性激素混合標準溶液（20 μg/L）的提取離子流色譜圖Fig.1 Extracted ion current chromatograms of mixed standard solution of 19 sex hormones

2.1.4 質(zhì)譜采集參數(shù)的確定

將稀釋后的標準品儲備溶液直接注入離子源，分別在正、負兩種電離模式下優(yōu)化質(zhì)譜條件。結(jié)果表明，在正離子模式下，雄激素和孕激素分子結(jié)構(gòu)中的羰基、共軛雙鍵等結(jié)構(gòu)更易于獲得氫離子，從而生成較高豐度的[M+H]母離子；雄酮、表雄酮、脫氫表雄酮在獲得氫離子后，經(jīng)過開環(huán)、重排等復雜的反應，使[M+HHO]母離子豐度高于其他加合物形式；在負離子模式下，雌激素則更易于失去酚羥基上的氫，生成較高豐度的[M-H]母離子。確定母離子后，開啟IntelliStart自動調(diào)諧功能，采用自動調(diào)諧所得的多反應監(jiān)測參數(shù)。

2.1.5 補償液組成及流速的優(yōu)化

在ESI源的金屬毛細管中，超臨界CO因失去壓力控制而轉(zhuǎn)化為氣態(tài)，從而失去溶解能力。為使分析物能夠順利傳輸至離子源并發(fā)生電離，需在色譜柱后端引入適宜的補償液。補償液不參與色譜分離，但其組成和流速對化合物的色譜峰形和離子化效率具有重要影響。Sun Ping等的研究表明，使用甲酸酸化后的質(zhì)子性溶劑作為補償液更有利于提高分析物在正離子模式下的質(zhì)譜響應，且流動相pH值至少低于樣品p值2 個單位；使用堿化后的非質(zhì)子性溶劑作為補償液更有利于待測物[M-H]分子離子峰的形成，且流動相pH值至少高于樣品p值2 個單位。因此，實驗分別考察不同體積分數(shù)97%甲醇溶液（含體積分數(shù)0.1%、0.2%、0.3%甲酸）和不同體積分數(shù)98%乙腈溶液（含體積分數(shù)0.1%、0.2%、0.3%氨水）作為補償液，以及補償液在不同流速（0.1、0.2、0.3、0.4 mL/min）時對測定結(jié)果的影響。結(jié)果表明，選用97%甲醇溶液（含體積分數(shù)0.2%甲酸）和98%乙腈溶液（含體積分數(shù)0.2%氨水）分別作為正、負離子模式下的補償液，可獲得較好的色譜峰形和響應強度；補償液流速為0.3 mL/min時，各性激素響應值最高（圖2a）；繼續(xù)增加流速，則系統(tǒng)壓力超過設(shè)定值，迫使背壓閥開啟排放功能，分流了部分性激素，使質(zhì)譜響應值降低。

圖2 補償液流速（a）和補償液中純水體積分數(shù)（b）對3 種性激素峰高的影響Fig.2 Effects of flow rate (a) and water volume fraction (b) of compensation solution on the peak heights of three sex hormone

此外，在補償液中加入適量純水，可改變離子源中的氣氛，有助于提高化合物的質(zhì)譜響應。通過比較補償液中添加不同體積分數(shù)（1%、2%、3%、4%、5%、6%）純水時化合物的峰高（圖2b），可知正、負離子模式下純水的最佳體積分數(shù)分別為3%和2%；當超過5%后，系統(tǒng)壓力波動超過儀器告警閾值，儀器始終無法進入就緒狀態(tài)，可能因為此時流動相管路內(nèi)難以形成穩(wěn)定的超臨界流體。

2.2 樣品提取和凈化條件的優(yōu)化

性激素極性較弱，可選用甲醇、乙腈、丙酮等作為提取液。實驗參考饒雅琨等的研究，選用甲醇提取固體樣品中的性激素。李雙等研究表明，在蛋白粉中加入適量純水，可使樣品產(chǎn)生溶脹，提高提取液的穿透性；酸性環(huán)境能有效降低雌激素在水中的溶解度，從而提高有機溶劑的提取效率。因此，實驗以蛋白粉陰性加標樣品（20 μg/kg）為對象，考察直接提取和加水潤濕后提取、提取液中含不同體積分數(shù)（0%、1%、2%，圖3a）甲酸，以及不同超聲提取時間（5、10、15、20 min，圖3b）對回收率的影響。結(jié)果顯示，將樣品潤濕后，以1%甲酸-甲醇溶液超聲提取15 min時各性激素回收率最高。

圖3 不同體積分數(shù)甲酸（a）和超聲提取時間（b）對19 種性激素回收率的影響Fig.3 Effects of different volume fractions of formic acid (a) and ultrasonic extraction time (b) on recoveries of 19 sex hormone

一些研究采用凝膠制備色譜法提取和凈化油狀樣品中的性激素，但該方法效率低下，成本高昂且污染嚴重。因此，實驗改進了黃百芬等的研究，先將樣品溶解于正己烷中，再用硅膠粉末吸附溶液中的性激素，甘油酯、VE等非極性雜質(zhì)則隨正己烷一同棄去，最后用甲醇洗脫硅膠上吸附的性激素。該方法可除去樣品中的大部分雜質(zhì)，降低后續(xù)凈化的難度，并且操作簡單、成本低廉。實驗以19 種性激素的正己烷溶液（10.0 μg/L）為模擬物進行驗證，結(jié)果顯示，經(jīng)硅膠粉末吸附后的正己烷溶液中未檢出性激素，而甲醇洗脫液中各性激素質(zhì)量濃度均不小于9.7 μg/L。

以上樣品提取液中仍含有大量雜質(zhì)，需采取有效的凈化手段進一步減小基質(zhì)干擾。為提高分析通量，實驗采用通過式固相萃取法凈化樣品提取液。張再永等的研究表明，PRiME HLB通過式反相固相萃取柱能有效保留甘油酯、磷脂、蛋白質(zhì)等化合物，且使用前無需活化和平衡，可極大的提高工作效率。甲醇、乙腈均是反相固相萃取法常用的洗脫液，乙腈的洗脫能力更強，有利于減少試劑消耗并縮短濃縮時間。因此，實驗以PRiME HLB固相萃取柱為凈化柱，乙腈為洗脫液凈化樣品提取液。通過比較不同洗脫體積（0、1、2、3、4、5 mL）下各性激素的回收率可知，最佳洗脫體積為4 mL；超過4 mL后，回收率不再變化，但一級質(zhì)譜掃描圖譜中雜質(zhì)峰簇明顯增多。因此，實驗最終采用4 mL乙腈進行洗脫。

2.3 方法學驗證結(jié)果

2.3.1 基質(zhì)效應

實驗配制并測定了系列基質(zhì)匹配標準溶液和系列空白溶劑標準溶液，基質(zhì)效應=基質(zhì)匹配標準曲線斜率/空白溶劑標準曲線斜率-1。結(jié)果表明，3 種樣品的基質(zhì)效應均在-0.51～0.20范圍內(nèi)，其中蛋白粉基質(zhì)對雌激素具有較強的基質(zhì)抑制效應，可能是在離子化過程中，溶液中殘留的蛋白質(zhì)、多肽等強極性雜質(zhì)與雌激素共同競爭液滴表面，導致雌激素離子化效率降低；VE軟膠囊基質(zhì)中，各性激素的基質(zhì)效應普遍較弱，這與張虹艷等的研究結(jié)論一致。為減小基質(zhì)效應對定量分析準確性的影響，實驗采用空白基質(zhì)匹配標準溶液繪制標準曲線。

2.3.2 線性范圍、檢出限（limits of detection，LOD）和定量限（limits of quantitation，LOQ）

以陰性樣品提取液配制各性激素質(zhì)量濃度均為0.10～100 μg/L的基質(zhì)匹配標準溶液，采用本方法進行分析，以目標物定量離子峰面積為縱坐標，對應質(zhì)量濃度為橫坐標繪制標準曲線。結(jié)果表明，19 種性激素在各自的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（）不小于0.997 1（表2）。再以各目標化合物3 倍信噪比（＝3）確定LOD，以10 倍信噪比（＝10）確定LOQ。如表2所示，各性激素的LOD和LOQ分別為0.03～0.85 μg/kg和0.10～2.5 μg/kg，與Toit、Quanson等報道的數(shù)值水平相當，優(yōu)于李雙、饒雅琨、羅文靜等的報道。

表2 19 種性激素的線性范圍、線性方程、R2、LOD及LOQTable 2 Linear ranges,R2,LODs,and LOQs of 19 sex hormones

2.3.3 回收率、精密度實驗結(jié)果

以陰性樣品進行加標回收實驗，加標量分別為0.5、2 mg/kg和10 mg/kg，每個加標水平制備3 份，按1.3.1和1.3.2節(jié)方法處理后進行測定，得到樣品的平均回收率（=9）為77.8%～111.7%，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為1.1%～8.4%（表3）。與李雙、饒雅琨、羅文靜等的研究相比，回收率和精密度均能滿足保健食品中性激素非法添加檢測的要求。

表3 陰性樣品的加標回收率和RSDTable 3 Recoveries of spiked blank samples and precision RSDs

2.3.4 實際樣品的測定

按照建立的方法對2 份VE軟膠囊樣品、2 份膠原蛋白粉樣品和4 份蛋白粉樣品進行測定。其中1 份膠原蛋白粉樣品中檢出孕酮和雌三醇，含量分別為1.42、0.88 mg/kg；1 份蛋白粉樣品檢出諾龍、睪酮和雌三醇，含量分別為11.05、2.21 mg/kg和0.40 mg/kg；1 份蛋白粉樣品檢出諾龍、睪酮和甲睪酮（圖4），含量分別為7.39、1.53 mg/kg和0.59 mg/kg，其他樣品均未檢出這19 種性激素。蛋白粉類樣品的總體檢出率為50%，與李雙等的研究基本一致。

圖4 陽性蛋白粉樣品（6號樣品）的總離子流色譜圖Fig.4 Total ion current chromatograms of positive protein powder sample

3 結(jié)論

建立UPCC-串聯(lián)質(zhì)譜測定保健食品中19 種性激素含量的方法，采用優(yōu)化的樣品前處理方式，有效減小了基質(zhì)干擾，并提高了檢測靈敏度。方法快速準確、靈敏度高、專屬性好、綠色環(huán)保，可在8 min內(nèi)有效分離包括2 組4 種差向異構(gòu)體在內(nèi)的4 組共12 種同分異構(gòu)體。采用建立的方法對實際樣品進行檢測，結(jié)果能滿足一般化學分析的要求，對于保健食品中性激素的測定和暴露風險評估提供了可靠的技術(shù)支持。