絲瓜絡(luò)固定化米根霉催化光皮樹油制備生物柴油

紀(jì)淑蘭，李迅，王飛

（南京林業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，江蘇 南京 210037）

生物柴油（脂肪酸甲酯）作為一種清潔的柴油燃料，有望成為傳統(tǒng)化石燃料的替代品。目前制備生物柴油的主要方法為化學(xué)法，但化學(xué)法存在能耗高、產(chǎn)品純化復(fù)雜、對(duì)環(huán)境造成二次污染等缺點(diǎn)。生物法制備生物柴油不需要額外去除催化劑和鹽，純化費(fèi)用低，具有很大的應(yīng)用潛力，然而目前生物法中催化劑的高成本一直被認(rèn)為是生物法制備生物柴油產(chǎn)業(yè)化的一個(gè)重要障礙，利用固定化全細(xì)胞作為生物催化劑可以避免脂肪酶的復(fù)雜純化過(guò)程，有效降低生物催化劑的制備成本。全細(xì)胞催化劑具有更高的醇耐受性和熱穩(wěn)定性，具有更長(zhǎng)的使用壽命，能有效降低生物柴油的催化劑使用成本，越來(lái)越受到人們的重視。

米根霉在工業(yè)上是糖化酶、淀粉酶和乳酸脫氫酶產(chǎn)生菌種，在適宜的培養(yǎng)條件下米根霉還可產(chǎn)生大量的脂肪酶，目前固定化米根霉在制備生物柴油中已取得了一定的研究進(jìn)展。Ban 等將米根霉細(xì)胞固定在聚氨酯泡沫顆粒體上，催化大豆油甲酯化制備生物柴油。Athalye 等以聚乙烯塑料為載體，固定化米根霉，以此催化棉籽油制備生物柴油，脂肪酸甲酯（FAME）產(chǎn)率為27.9%（228.2g/L）。利用高分子產(chǎn)品（如聚氨酯和聚乙烯等）作為固定化材料，在細(xì)胞固定化中會(huì)遇到一系列問(wèn)題，如載體穩(wěn)定性欠佳和成本較高；合成聚合物的毒性和機(jī)械強(qiáng)度不足，從而會(huì)引起細(xì)胞破裂和酶活性下降，缺乏細(xì)胞生長(zhǎng)所需的足夠空間等。生物基材料除了具備作為細(xì)胞固定化載體材料的特質(zhì)之外，還具有物豐價(jià)廉、無(wú)毒害、可生物降解、生物相容性好等優(yōu)點(diǎn)，可以解決全細(xì)胞法制備生物柴油中細(xì)胞固定化載體的后期處理問(wèn)題，在理論上有很好的應(yīng)用前景。

原料來(lái)源是限制生物柴油產(chǎn)業(yè)發(fā)展的又一瓶頸，我國(guó)人口多，人均占有耕地面積較少，選擇植物原料油應(yīng)注意不能違背國(guó)家發(fā)展可再生能源“不與農(nóng)征地，不與人爭(zhēng)食”的方針，開發(fā)一些非食用植物油作為生物柴油的原料是一個(gè)重要方向。光皮樹的壽命可達(dá)200 年以上，平均每株光皮樹產(chǎn)油15kg/a，其果實(shí)所含脂肪酸組分優(yōu)于菜籽油，主要為油酸、亞油酸、棕櫚酸、硬脂酸和亞麻酸等，適合用來(lái)制備生物柴油。本研究選用光皮樹油作為原料，考察不同的廉價(jià)生物基固定化材料固定化米根霉制備全細(xì)胞催化劑，并探討固定化全細(xì)胞催化光皮樹油生產(chǎn)生物柴油的適宜條件。

1 材料和方法

1.1 材料和儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

米根霉LY6由本實(shí)驗(yàn)室保存；絲瓜絡(luò)海綿，中國(guó)鎮(zhèn)江洛康公司；胰蛋白胨、酵母提取物等，Oxoid（Hampshire，England）公司；系列脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品（色譜級(jí)），Sigma 公司，以上試劑均為分析純；光皮樹油由湖南林科院饋贈(zèng)。

1.1.2 培養(yǎng)基

采用液體搖瓶培養(yǎng)，探討培養(yǎng)基碳源、氮源培養(yǎng)條件對(duì)米根霉產(chǎn)脂肪酶及轉(zhuǎn)酯化的影響?；A(chǔ)培養(yǎng)基中含有7%的多聚蛋白胨、0.1%的NaNO、0.1%的KHPO、0.05%的MgSO·7H0 和3%的橄欖油。

1.1.3 主要儀器

低溫液相層析柜，德國(guó)Thermo 公司；氣相色譜儀，美國(guó)Aglilent公司；離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；超凈工作臺(tái)，蘇州安泰技術(shù)有限公司；恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海知楚有限公司。

1.2 米根霉細(xì)胞的固定化

將預(yù)處理的固定化材料稱取一定量加到裝有100mL 液體發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL 搖瓶中，于121℃高壓蒸汽滅菌20min，冷卻至室溫后，接種約10個(gè)米根霉孢子，在28℃、180r/min 條件下?lián)u瓶培養(yǎng)，過(guò)濾分離得到固定化全細(xì)胞，用去離子水洗滌數(shù)次，于-20℃下預(yù)冷凍24h，然后置于-40℃下真空冷凍干燥24h，取出后稱重，計(jì)算固載率。將樣品置于4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。本文所涉及?shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，誤差線為標(biāo)準(zhǔn)偏差的平均值。固定細(xì)胞干重按式(1)計(jì)算，固載率按式(2)計(jì)算。

1.3 固定化米根霉全細(xì)胞催化劑的交聯(lián)劑處理

將催化劑置入裝有100mL 0.1%交聯(lián)劑溶液的250mL 搖瓶中，在25℃、180r/min 搖床內(nèi)反應(yīng)1h，過(guò)濾，用去離子水洗滌催化劑數(shù)次，再置入裝有100mL 磷酸緩沖液（0.1mol/L，pH 6.8）的250mL搖瓶中，于4℃保溫5min，通過(guò)過(guò)濾固液分離后，用去離子水洗滌催化劑數(shù)次，于-20℃下預(yù)冷凍24h，然后置于-40℃下真空冷凍干燥24h。將樣品置于4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 固定化米根霉全細(xì)胞催化光皮樹油甲酯化反應(yīng)

在25mL 茄形瓶中，加入4.825g 光皮樹油和一定量的磷酸緩沖液（0.1mol/L，pH6.8）作反應(yīng)溶劑，再加入一定量的固定化全細(xì)胞催化劑，按醇油摩爾比1∶1在反應(yīng)0h、10h、24h、48h時(shí)各添加一次甲醇，于35℃、180r/min 條件下反應(yīng)一定時(shí)間，定期取100μL 反應(yīng)液進(jìn)行氣相色譜分析。反應(yīng)過(guò)后，過(guò)濾固液分離得到催化劑，用蒸餾水和正己烷洗滌數(shù)次，室溫干燥1天后重復(fù)使用。

1.5 甲酯化產(chǎn)物分析

采用內(nèi)標(biāo)法測(cè)定甲酯得率[式(3)]。反應(yīng)結(jié)束后，離心取上層產(chǎn)物，用正己烷稀釋成一定濃度，加入一定濃度的內(nèi)標(biāo)物（十七烷酸甲酯，正己烷配制），混勻后進(jìn)行氣相色譜（GC，Aglilent 7890A）分析。分析條件為：PEG-20M極性毛細(xì)管柱，F(xiàn)ID檢測(cè)器，載氣為高純氮?dú)?，流速?0mL/min。進(jìn)樣量1μL，分流比50∶1，進(jìn)樣口和檢測(cè)器溫度分別設(shè)為250℃和260℃，初始溫度180℃，保溫2min，然后以3℃/min升至240℃，保溫10min。

圖1為絲瓜絡(luò)固定化米根霉全細(xì)胞催化光皮樹油甲酯化反應(yīng)的氣相色譜圖。各甲酯的種類及含量和光皮樹油中的脂肪酸組成一致。

圖1 固定化米根霉催化光皮樹油的產(chǎn)物氣相色譜圖

2 結(jié)果與討論

2.1 米根霉固定化條件的優(yōu)化

2.1.1 固定化材料對(duì)米根霉固定化的影響

在相同培養(yǎng)條件下，選用絲瓜絡(luò)、納米纖維、水凝膠、椰殼活性炭作為固定化材料，研究不同生物基材料對(duì)米根霉固定化的影響。由圖2 可看出，水凝膠與納米纖維的固載率極低，分析是由于其孔隙為納米級(jí)，能進(jìn)入并被固定化的米根霉菌絲量較少，因此兩種材料并不適于絲狀真菌米根霉的固定化。活性炭在全細(xì)胞固定化如酵母以及酶的固定化中都有很多報(bào)道，但是在本實(shí)驗(yàn)中，椰殼活性炭的固載率也較低，原因?yàn)榛钚蕴康奈綑C(jī)理是依賴于分子之間相互吸附的“范德華力”或依靠自身獨(dú)特的孔隙結(jié)構(gòu)，在固定化米根霉過(guò)程中，活性炭的孔徑大約1.5nm，而米根霉的孢子囊直徑60～250mm，所以椰殼活性炭固定化的菌體只是纏繞在其表面的一層，并沒(méi)有發(fā)揮其吸附作用，后續(xù)甲酯化反應(yīng)發(fā)現(xiàn)椰殼活性炭固定的菌絲容易在震蕩過(guò)程中發(fā)生脫落現(xiàn)象。相比于納米纖維、水凝膠和椰殼活性炭，絲瓜絡(luò)的固載率達(dá)162%以上，甲酯得率更是90%以上，原因?yàn)榻z瓜絡(luò)是一種具有三維立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的多孔性生物質(zhì)材料,氣通量高達(dá)63546L/(m·s)，孔隙率達(dá)79%～93%，BET（Brunauer-Emmertt-Teller equation）比表面積平均值可達(dá)123m/g，本研究采用的絲瓜絡(luò)孔徑為2～4mm，主要成分是木質(zhì)纖維素，具有良好的生物親和性，有利于根霉菌絲的黏附生長(zhǎng)，在后續(xù)反應(yīng)中也證實(shí)固定的菌絲不易脫落。納米纖維、水凝膠和椰殼活性炭固定化米根霉不但固載率低，而且由于細(xì)胞只是纏繞在材料表面，在后續(xù)甲酯化反應(yīng)過(guò)程中菌體脫落，甲酯得率也極低，所以不適于米根霉的固定化實(shí)驗(yàn)。接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)都用絲瓜絡(luò)作為固定化材料。

圖2 不同固定化材料對(duì)米根霉固定化的影響

2.1.2 載體添加量對(duì)米根霉固定化的影響

絲瓜絡(luò)的孔隙發(fā)達(dá)，能夠?yàn)榧?xì)胞的黏附生長(zhǎng)提供充足的空間。為了研究在發(fā)酵過(guò)程中載體添加量對(duì)米根霉細(xì)胞固定化的影響，在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加不同量的絲瓜絡(luò)。由圖3可知，隨著絲瓜絡(luò)添加量的增加，固載率開始逐漸增加，當(dāng)每100mL 發(fā)酵液載體添加量為2.25g 時(shí)，固載率達(dá)到最高。當(dāng)載體添加量較少時(shí)（小于2.25g），培養(yǎng)基中有較多的菌絲球，說(shuō)明載體量不夠。而當(dāng)載體添加量為2.25g時(shí)，固載率達(dá)到最高，達(dá)到163%，且得到的固定化催化劑催化光皮樹油甲酯得率最高，達(dá)到91%。說(shuō)明在固定化培養(yǎng)過(guò)程中，適宜的載體添加量可以使米根霉菌絲幾乎全部固定在載體上，米根霉細(xì)胞優(yōu)先貼附于絲瓜絡(luò)載體生長(zhǎng)，進(jìn)一步驗(yàn)證了絲瓜絡(luò)具有良好的生物親和性，同時(shí)獲得的固定化細(xì)胞催化能力最強(qiáng)，獲得的生物柴油量最多。但是菌體的生長(zhǎng)量主要受到培養(yǎng)基成分的限制，當(dāng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)保持恒定時(shí)，菌體的生長(zhǎng)量也是一定的，因此當(dāng)載體添加量過(guò)多時(shí)（大于2.25g），單位載體的固載量明顯下降，且得到的固定化催化劑催化光皮樹油甲酯得率還有所下降，僅為88%（2.5g載體添加量）。所以基于以上原因，在固定化米根霉培養(yǎng)過(guò)程中，以每100mL 發(fā)酵液添加2.25g 絲瓜絡(luò)為最佳。

圖3 絲瓜絡(luò)添加時(shí)間對(duì)細(xì)胞固定化的影響

2.1.3 固定化時(shí)間對(duì)全細(xì)胞催化劑的影響

固定化時(shí)間影響載體對(duì)細(xì)胞的固載率和全細(xì)胞催化劑的催化效率，為獲得最經(jīng)濟(jì)的高固載率和高催化活性的固定化全細(xì)胞催化劑，本實(shí)驗(yàn)在載體加入24～96h 后分別取樣，探究固定化時(shí)間對(duì)全細(xì)胞催化劑的影響。結(jié)果如圖4所示，在米根霉加入固定化載體培養(yǎng)36h之后，固載率保持在163%左右，繼續(xù)增加培養(yǎng)時(shí)間，固載率沒(méi)有太大變化，而加入固定化載體培養(yǎng)到96h，固載率卻有所下降。分析其原因，是由米根霉的生長(zhǎng)期決定的，細(xì)胞接種后，24～36h 進(jìn)入快速生長(zhǎng)期，48～84h 進(jìn)入穩(wěn)定期，84h后培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)耗盡，代謝廢物含量呈上升趨勢(shì)，細(xì)胞的增殖和細(xì)胞胞內(nèi)脂肪酶的合成受阻。結(jié)合固定化全細(xì)胞催化劑的甲酯化效果，隨著固定化時(shí)間的增加，全細(xì)胞催化劑催化效果也呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，甲酯得率在72h 達(dá)到最高，為90%。繼續(xù)增加固定化時(shí)間，甲酯得率反而出現(xiàn)下降趨勢(shì)。因此，加入固定化載體絲瓜絡(luò)培養(yǎng)米根霉72h時(shí)即可收獲高固載率、高催化活性的固定化全細(xì)胞催化劑。究其原因，同樣是由米根霉的生長(zhǎng)期和產(chǎn)酶期決定的，72h的細(xì)胞處于生長(zhǎng)穩(wěn)定期，產(chǎn)酶量達(dá)最高，催化效率也是最高的。

圖4 絲瓜絡(luò)添加時(shí)間對(duì)細(xì)胞固定化的影響

2.1.4 培養(yǎng)基成分對(duì)米根霉固定化的影響

2.1.4.1 不同碳源對(duì)米根霉固定化的影響

不同的碳源對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和脂肪酶產(chǎn)生的影響不同，現(xiàn)有研究表明，以葡萄糖為碳源培養(yǎng)米根霉可以獲得更多的細(xì)胞生物量，但檢測(cè)到的脂肪酶活性很少，而用植物油，如橄欖油作為碳源，可以觀察到更高的脂肪酶活性。為了獲得更多的細(xì)胞生物量和脂肪酶活性，也有人提出將葡萄糖和油脂結(jié)合作為碳源。甚至有報(bào)道稱碳源不僅影響脂肪酶的產(chǎn)生，而且對(duì)細(xì)胞壁的組成也有一定的影響，進(jìn)而影響全細(xì)胞催化生產(chǎn)生物柴油的效率。本實(shí)驗(yàn)選用葡萄糖、橄欖油、50%葡萄糖和50%橄欖油的組合、大豆油、糊精、淀粉作為碳源（加入量均為3%），探究不同碳源對(duì)米根霉固定化細(xì)胞的影響。由圖5可知，葡萄糖、糊精和淀粉作為碳源時(shí)，菌體生長(zhǎng)較少，在相同的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，固載率較低，導(dǎo)致后期用相同質(zhì)量的催化劑做甲酯化反應(yīng)時(shí)，甲酯得率不高，因此在本研究中不適宜作為培養(yǎng)米根霉的碳源。大豆油與橄欖油相比，不飽和脂肪酸含量較低，而培養(yǎng)基含有較多不飽和脂肪酸是提高脂肪酶活性的一種重要方法。橄欖油作為碳源時(shí)，固載率較高，且在獲得的全細(xì)胞催化劑制備生物柴油的甲酯得率達(dá)到90%以上，見圖6。因此，選擇3%橄欖油作為誘導(dǎo)米根霉產(chǎn)脂肪酶的碳源。

圖5 碳源對(duì)米根霉固載率的影響

圖6 碳源對(duì)米根霉全細(xì)胞催化劑催化光皮樹油制備生物柴油的影響

2.1.4.2 不同氮源對(duì)米根霉固定化的影響

不同氮源對(duì)微生物的生長(zhǎng)和酶的性質(zhì)也有著不同的影響。幾種有機(jī)氮源（胰蛋白胨、牛肉膏和酵母膏）和無(wú)機(jī)氮源（NaNO）對(duì)米根霉生長(zhǎng)的影響見圖7。結(jié)果表明，單純以NaNO為氮源時(shí)，米根霉基本不生長(zhǎng)。多聚蛋白胨作為氮源時(shí)，固載率最高，可達(dá)160.7%，且以此獲得的固定化全細(xì)胞催化油脂的甲酯化效果也最好，見圖8。牛肉膏作為氮源的全細(xì)胞固載率達(dá)到154.2%，但是催化劑甲酯化效果相對(duì)較差。酵母膏則相反，催化劑甲酯化效果較好，但是全細(xì)胞固載率相對(duì)于胰蛋白胨較低。胰蛋白胨的全細(xì)胞固載率和甲酯化效果在這幾種有機(jī)氮源中都處于中間水平。各種研究和生產(chǎn)實(shí)踐表明，復(fù)合氮源對(duì)微生物發(fā)酵和產(chǎn)酶比單一無(wú)機(jī)氮和有機(jī)氮更有效，所以結(jié)合對(duì)米根霉細(xì)胞生長(zhǎng)和后期轉(zhuǎn)酯化的效果，選擇多聚蛋白胨作為米根霉產(chǎn)酶的有機(jī)氮源，NaNO為無(wú)機(jī)氮源。

圖7 氮源對(duì)米根霉固載率的影響

圖8 氮源對(duì)米根霉全細(xì)胞催化劑催化光皮樹油制備生物柴油的影響

2.1.5 交聯(lián)劑對(duì)米根霉固定化的影響

為提高全細(xì)胞催化劑的催化穩(wěn)定性和重復(fù)使用性，以此降低生產(chǎn)成本并提高生產(chǎn)效率，研究了不同交聯(lián)劑對(duì)全制備細(xì)胞催化劑的影響。將固定化米根霉細(xì)胞分別用0.1% 戊二醛、雙醛淀粉、京尼平溶液進(jìn)行交聯(lián)處理。如圖9所示，未經(jīng)交聯(lián)劑處理的全細(xì)胞催化劑在第6批反應(yīng)的甲酯得率僅為66%，相比較之下，經(jīng)交聯(lián)劑處理后的全細(xì)胞催化劑在第6批反應(yīng)的甲酯化得率均高于未交聯(lián)處理的全細(xì)胞催化劑，特別是經(jīng)戊二醛交聯(lián)處理的全細(xì)胞催化劑，在第6批反應(yīng)的甲酯化得率能保持在80%以上，戊二醛處理使催化劑穩(wěn)定性提高歸因于較少的脂肪酶從固定化細(xì)胞中泄漏。用戊二醛處理的全細(xì)胞催化劑，無(wú)論是分子內(nèi)交聯(lián)結(jié)構(gòu)還是分子間交聯(lián)結(jié)構(gòu)都比較穩(wěn)定。雙醛淀粉雖然比戊二醛有更多醛基，但交聯(lián)效果比戊二醛稍差，這是因?yàn)椋阂环矫?，雙醛淀粉的分子量大，空間位阻明顯；另一方面，雙醛淀粉中兩個(gè)醛基的距離近，其內(nèi)部會(huì)發(fā)生交聯(lián)，具有反應(yīng)活性的醛基含量要比真實(shí)的醛基含量少些。且雙醛淀粉的生產(chǎn)成本高，不適于工業(yè)化使用。京尼平是梔子苷經(jīng)-葡萄糖苷酶水解后的產(chǎn)物，分子式為CHO，化學(xué)結(jié)構(gòu)具有羥基、羧基等多個(gè)活性基團(tuán)，具有自發(fā)與氨基酸或蛋白質(zhì)反應(yīng)的能力。然而京尼平的交聯(lián)反應(yīng)機(jī)理尚不明確，根據(jù)反應(yīng)觀察和檢測(cè)推測(cè)認(rèn)為京尼平自發(fā)與氨基酸反應(yīng)生成一個(gè)環(huán)烯醚萜的氮化物，再經(jīng)過(guò)一個(gè)脫水作用形成一個(gè)芳香族單體，最后該單體可能由于自由基反應(yīng)的二聚作用而形成環(huán)狀的分子間和分子內(nèi)交聯(lián)結(jié)構(gòu)。與其他交聯(lián)劑相比，京尼平的最大優(yōu)勢(shì)在于其極低的細(xì)胞毒性，但是在本實(shí)驗(yàn)中，京尼平交聯(lián)處理的全細(xì)胞催化劑效果一般，且其價(jià)格更昂貴，因此選擇戊二醛為米根霉全細(xì)胞催化劑的交聯(lián)劑。

圖9 （未）經(jīng)不同交聯(lián)劑交聯(lián)處理的全細(xì)胞催化劑的重復(fù)使用次數(shù)

2.2 米根霉全細(xì)胞催化劑催化光皮樹油制備生物柴油條件優(yōu)化

2.2.1 溫度對(duì)生物柴油得率的影響

溫度是影響脂肪酶催化反應(yīng)的一個(gè)重要參數(shù)，與一般化學(xué)反應(yīng)一樣，提高溫度可以增加酶促反應(yīng)的速度，而酶是一種活性蛋白質(zhì)，在化學(xué)鍵的維持下具有高度的立體結(jié)構(gòu)，溫度過(guò)高將導(dǎo)致化學(xué)鍵的斷裂，引起蛋白質(zhì)變性，從而導(dǎo)致酶的失活。因此，每一種脂肪酶都有自身的最適反應(yīng)溫度。如圖10 所示，當(dāng)溫度從25℃逐漸升高時(shí)，米根霉全細(xì)胞催化劑的轉(zhuǎn)酯化效果越來(lái)越好，在35℃時(shí)甲酯得率達(dá)到最大值，進(jìn)一步升高反應(yīng)溫度，導(dǎo)致脂肪酶蛋白變性，甲酯得率下降，說(shuō)明米根霉全細(xì)胞催化劑的最適催化溫度為35℃。

圖10 溫度對(duì)全細(xì)胞催化光皮樹油甲醇分解的影響

2.2.2 含水量對(duì)生物柴油得率的影響

脂肪酶催化反應(yīng)主要發(fā)生在油水界面上，適當(dāng)?shù)暮靠梢詾橹久阜磻?yīng)提供反應(yīng)場(chǎng)所，進(jìn)而提高甲酯化產(chǎn)率；此外，甲醇是一種親水化合物，易溶于水，適當(dāng)?shù)暮靠梢苑乐辜状紝?duì)整個(gè)細(xì)胞的抑制。如圖11所示，當(dāng)反應(yīng)的含水量從0逐漸提高時(shí)，甲酯得率也迅速上升，在10%時(shí)達(dá)到最高，隨后進(jìn)一步提高含水量到15%時(shí)，甲酯化得率反而下降。因?yàn)樵谥久干锎呋w系中，酯化反應(yīng)是一個(gè)可逆過(guò)程，水是油脂酯化反應(yīng)第二步酯化反應(yīng)的副產(chǎn)物，過(guò)多的含水量會(huì)阻礙反應(yīng)向正向進(jìn)行，從而降低甲酯化產(chǎn)率。此外，大量的水會(huì)阻礙傳質(zhì)，從而降低反應(yīng)效率。所以，含水量以10%最為適宜。

圖11 含水量對(duì)全細(xì)胞催化光皮樹油甲醇分解的影響

2.2.3 催化劑用量對(duì)生物柴油得率的影響

在含水率10%（占油重）的反應(yīng)體系中，分別加入占光皮樹油重8%、10%、12%、15%和18%的全細(xì)胞催化劑，對(duì)催化劑的用量進(jìn)行了探索。在反應(yīng)體系一定的情況下，隨著催化劑用量的增加，反應(yīng)速率和最終甲酯化得率均有所提升，但是在增加到一定量之后，過(guò)多的催化劑不僅不利于反應(yīng)的進(jìn)行，反而會(huì)因?yàn)檫^(guò)多的催化劑影響反應(yīng)的傳質(zhì)傳熱，造成催化效率的下降，所以圖12的結(jié)果表明，全細(xì)胞催化劑用量以12%最佳，甲酯得率可達(dá)94%以上。

圖12 催化劑量對(duì)全細(xì)胞催化光皮樹油甲醇分解的影響

2.2.4 甲醇添加時(shí)間對(duì)生物柴油得率的影響

本研究中甲醇與光皮樹油的總摩爾比為4∶1，因?yàn)榧状紝?duì)酶有抑制作用，所以添加甲醇的方式必須考慮避免這種抑制作用。分步加入甲醇已被廣泛用于防止甲醇對(duì)酶活性的抑制，并被證明是成功的方法。本研究通過(guò)優(yōu)化甲醇分步加入方式，不僅獲得了更高轉(zhuǎn)化率的生物柴油，而且有效縮短了催化時(shí)間。

先前的研究結(jié)果表明，在反應(yīng)0h、12h、24h、48h時(shí)添加甲醇，生物柴油的初始轉(zhuǎn)化率和最終轉(zhuǎn)化率較佳，72h 的甲酯得率達(dá)90%以上。以此為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)了不同的甲醇添加時(shí)間，如圖13 所示，每隔12h 和10h 添加甲醇，反應(yīng)60h 后的最終轉(zhuǎn)化率分別為75.6%和72.5%，說(shuō)明簡(jiǎn)單縮短添加甲醇時(shí)間間隔會(huì)導(dǎo)致甲醇過(guò)量累積。根據(jù)甲酯化時(shí)間曲線，發(fā)現(xiàn)36h后甲酯得率增長(zhǎng)趨勢(shì)放緩，所以進(jìn)一步改進(jìn)添加甲醇的時(shí)間間隔分別為0h、10h、24h、48h 和0h、10h、20h、48h 和0h、10h、24h、40h，反應(yīng)60h最高甲酯化得率分別為85.5%、94.15%和84.8%。因此，最佳的添加甲醇方式是以醇油摩爾比4∶1，等摩爾的甲醇分別在0h、10h、24h、40h時(shí)添加，不僅獲得了最高的甲酯化得率，且把催化時(shí)間由72h縮短為52h。

圖13 甲醇添加時(shí)間對(duì)全細(xì)胞催化劑催化光皮樹油甲酯得率的影響

3 結(jié)論

嘗試絲瓜絡(luò)、納米纖維、水凝膠、椰殼活性炭生物基材料作為米根霉的固定化材料，通過(guò)比較其固載率和甲酯化效果，選定絲瓜絡(luò)作為米根霉的最適宜固定化材料，其固載率達(dá)到162%±6%。絲瓜絡(luò)是一種天然高分子材料，不但具有高孔隙率（79%～93%）和低密度（0.02～0.04g/cm）的纖維血管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)利于米根霉菌絲的黏附，而且具有優(yōu)良的力學(xué)性能和堅(jiān)韌的質(zhì)地，可以在后期應(yīng)用過(guò)程中承受較大的剪切力。在100mL 米根霉發(fā)酵培養(yǎng)基中加入2.25g 絲瓜絡(luò)作為固定化載體，培養(yǎng)72h 即可收獲效果最佳的固定化米根霉全細(xì)胞催化劑。為了提高絲瓜絡(luò)固定化米根霉的催化效率，研究了培養(yǎng)基成分對(duì)其影響。橄欖油含有較多的不飽和脂肪酸，作為碳源具有一定的誘導(dǎo)作用，可有效提高米根霉中的脂肪酶表達(dá)量，以此獲得的固定化米根霉催化光皮樹油的甲酯得率達(dá)到93%以上。通過(guò)評(píng)價(jià)固載率和甲酯得率，選擇多聚蛋白胨為有機(jī)氮源、NaNO為無(wú)機(jī)氮源的復(fù)合氮源來(lái)培養(yǎng)及固定化米根霉細(xì)胞。同時(shí)為了提高固定化細(xì)胞的使用壽命和重復(fù)使用次數(shù)，研究了用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的戊二醛、雙醛淀粉、京尼平溶液進(jìn)行交聯(lián)處理的可行性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在戊二醛處理的固定化細(xì)胞中脂肪酶活性損失較少，在重復(fù)使用6次后，轉(zhuǎn)酯化效果依然保持在80%以上。本研究獲得的全細(xì)胞催化劑具有制備簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性良好、可重復(fù)利用等優(yōu)點(diǎn)，通過(guò)優(yōu)化的培養(yǎng)基組成也具有價(jià)格較低廉的特點(diǎn)，有效控制了全細(xì)胞催化劑的制備成本。有關(guān)全細(xì)胞催化劑的后續(xù)工作將圍繞絲瓜絡(luò)的改性及機(jī)理研究，通過(guò)探討其表面基團(tuán)、粒徑、比表面積、孔徑和機(jī)械強(qiáng)度等參數(shù)和催化性能的比較，進(jìn)一步提升全細(xì)胞催化劑的催化性能和穩(wěn)定性，加大其在生物柴油的工業(yè)化應(yīng)用潛力。

米根霉脂肪酶催化的油脂轉(zhuǎn)酯化生產(chǎn)生物柴油過(guò)程中的酰基遷移，發(fā)現(xiàn)隨著水含量在一定范圍內(nèi)的增加，可以促進(jìn)?；D(zhuǎn)移，并以此可有效提高生物柴油的產(chǎn)量。當(dāng)反應(yīng)體系中含水量是光皮樹油質(zhì)量的10%、催化劑用量是12%時(shí)，最終催化光皮樹油的甲酯得率達(dá)到94%以上。此外，甲醇對(duì)脂肪酶的抑制也是限制生物柴油得率的原因之一，本實(shí)驗(yàn)嘗試了不同的甲醇添加方式，發(fā)現(xiàn)以總醇油摩爾比4∶1，在反應(yīng)0h、10h、24h、40h 時(shí)逐步添加，能在52h獲得85%以上的甲酯得率，有效縮短了催化時(shí)間。與現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道中用米根霉脂肪酶法制備生物柴油相比，本文研究結(jié)果在簡(jiǎn)化催化劑制備操作步驟、降低其制備成本之外，更是進(jìn)一步提高了催化效率，縮短了反應(yīng)時(shí)間。而且在后期使用過(guò)程中，絲瓜絡(luò)固定化米根霉更容易從反應(yīng)混合物中分離出來(lái)以重復(fù)使用。有關(guān)利用全細(xì)胞催化劑制備生物柴油的后續(xù)工作將繼續(xù)圍繞縮短催化時(shí)間進(jìn)行研究，通過(guò)篩選耐甲醇米根霉、混合菌催化和優(yōu)化反應(yīng)器等方法，進(jìn)一步提升全細(xì)胞催化劑在生物柴油的工業(yè)化應(yīng)用潛力。