基于SSR標(biāo)記的我國(guó)主栽日本栗品種(系)遺傳結(jié)構(gòu)分析和指紋圖譜構(gòu)建

聶興華 劉 松 王碧瑤 李 琰 練蔓青 秦 嶺,2 鄭瑞杰 邢 宇,2,*

(1 北京農(nóng)學(xué)院植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 102206；2 林木分子設(shè)計(jì)育種高精尖創(chuàng)新中心，北京 102206；3 遼寧省經(jīng)濟(jì)林研究所，遼寧 大連 116000)

栗營(yíng)養(yǎng)含量高，脂肪含量低，富含核黃素和多種維生素，具有良好的可食用價(jià)值和藥用價(jià)值，是世界上重要的干果作物[1-2]?，F(xiàn)今公認(rèn)的栗屬植物共有7個(gè)種，分別為錐栗[Castaneahenryi(Skam)Rehd.et Wils.]、板栗(CastaneamollissimaBl.)、茅栗(CastaneaseguiniiDode)、歐洲栗(CastaneasativaMill.)、日本栗(CastaneacrenataS.et Z.)、美洲栗[Castaneadentata(Marsh.)Brokh.]和美洲榛果栗(CastaneapumilaMill.)[3-4]。日本栗，又稱(chēng)丹東栗，主要分布于日本、韓國(guó)、朝鮮以及我國(guó)遼寧和山東地區(qū)。我國(guó)現(xiàn)今分布和栽培的日本栗有兩個(gè)分支，其一為20世紀(jì)20年代由朝鮮傳入山東適應(yīng)暖濕環(huán)境的文登栗，其二為位于丹東市和遼南地區(qū)適應(yīng)干旱寒冷環(huán)境的丹東栗[3]。日本栗不僅具有堅(jiān)果大、適應(yīng)性強(qiáng)、耐寒、豐產(chǎn)性高等優(yōu)點(diǎn)，而且對(duì)栗疫病、墨水病等病害表現(xiàn)出較好的抗性，是世界各地栗屬植物獲取抗性基因的重要親本?，F(xiàn)階段育種者已培育出諸多抗性強(qiáng)、豐產(chǎn)性高的歐日、中日雜交品種[5-8]。近些年，隨著日本栗良種在我國(guó)東北部省區(qū)的不斷推廣，其經(jīng)濟(jì)效益與生態(tài)效益得到顯著提升，已發(fā)展成我國(guó)遼寧省山區(qū)的主要支柱產(chǎn)業(yè)[9]。中國(guó)板栗和日本栗在歷史上有著相互引種且部分生態(tài)區(qū)域重合，種間漸滲類(lèi)型較多，特別是日本栗品種選育譜系分類(lèi)不清，加上各產(chǎn)區(qū)使用沒(méi)有標(biāo)簽的接穗進(jìn)行繁殖，導(dǎo)致日本栗品種資源混亂的現(xiàn)象，資源鑒定的研究較為滯后。因此，探究科學(xué)有效的分子鑒定方法，對(duì)日本栗品種(系)資源保護(hù)利用具有重要意義。

上世紀(jì)80年代以來(lái)，隨著分子標(biāo)記技術(shù)不斷發(fā)展，該技術(shù)被廣泛應(yīng)用于植物的遺傳多樣性、遺傳圖譜、指紋圖譜和數(shù)量性狀位點(diǎn)(quantitative trait locus, QTL)分析[10-13]，其中簡(jiǎn)單重復(fù)序列(simple sequence repeat，SSR)具有共顯性、穩(wěn)定性、可重復(fù)性和多態(tài)性等特點(diǎn)，是諸多分子標(biāo)記中應(yīng)用最為廣泛的標(biāo)記之一。在日本栗的最新研究中，SSR主要用于遺傳多樣性和性狀關(guān)聯(lián)分析等領(lǐng)域。2018年Nishio等[14]利用SSR和單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)對(duì)99份日本栗資源進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，挖掘了12個(gè)與堅(jiān)果性狀相關(guān)的分子標(biāo)記。2020年Nishio等[15]使用36個(gè)SSR分子標(biāo)記對(duì)230份日本栗品種資源和中國(guó)板栗品種資源進(jìn)行遺傳多樣性評(píng)估和親緣關(guān)系分析，闡明了日本栗和中國(guó)板栗品種之間具有很高雜交育種前景。2021年Terakami等[16]利用374個(gè)SSR分子標(biāo)記構(gòu)建了日本栗的遺傳圖譜，并定位到與垂枝性狀相關(guān)的標(biāo)記位點(diǎn)。日本栗雖然在世界栗屬種質(zhì)資源中發(fā)揮著非常重要的作用，但是目前有關(guān)日本栗與其他栗屬植物的親緣關(guān)系和日本栗主栽品種分子鑒定的研究卻鮮有報(bào)道?；诖?，本研究全面收集我國(guó)主栽日本栗品種，并利用熒光SSR分子標(biāo)記對(duì)124份栗屬植物資源進(jìn)行親緣關(guān)系分析，解析日本栗的分類(lèi)地位和日本栗品種的遺傳結(jié)構(gòu)，旨在為日本栗在栗屬植物中的分類(lèi)地位和應(yīng)用價(jià)值提供支撐；并構(gòu)建59份日本栗主栽品種的指紋圖譜，以期為日本栗在繁殖過(guò)程中品種的純度和品種的獨(dú)特性提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為今后日本栗的資源的鑒定和種質(zhì)創(chuàng)新提供參考，同時(shí)為日本栗品種知識(shí)產(chǎn)權(quán)的保護(hù)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究的供試材料采于2019—2021年，共計(jì)124份，詳細(xì)信息見(jiàn)表1，包括30份板栗資源、13份錐栗資源、22份茅栗資源和59份日本栗品種(系)資源，其中日本栗采自遼寧經(jīng)濟(jì)林研究所日本栗資源圃。每份供試材料采集嫩葉6片，液氮冷凍后，-20℃條件保存于低溫冰箱。

表1 124份供試材料信息表

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取 板栗基因組DNA提取采用改良的十六烷基三甲基溴化銨(cetyltrimethylammonium bromide, CTAB)方法[17]。提取DNA后，使用1%瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop One分光光度計(jì)(Thermo Fisher Scientific, 美國(guó))分別檢測(cè)DNA的質(zhì)量和濃度，并將每份DNA的濃度稀釋至20～50 ng·μL-1以備擴(kuò)增使用。

1.2.2 SSR分子標(biāo)記的來(lái)源 本試驗(yàn)使用的17對(duì)SSR引物由北京農(nóng)學(xué)院板栗分子發(fā)育生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室前期篩選所得[17]，詳細(xì)信息見(jiàn)表2。引物由北京擎科生物科技有限公司合成。

表2 17對(duì)SSR引物的信息

1.2.3 毛細(xì)管電泳SSR-PCR擴(kuò)增體系 擴(kuò)增體系20 μL：1 μL DNA底物、10 μL 2×Taq Plus PCR MasterMix(Biomed, 北京)、10 μmol·L-1正向引物(0.1 μL)、10 μmol·L-1反向引物(0.3 μL)、10 μmol·L-1含熒光標(biāo)記(FAM,HEX,ROX或TAMRA)的M13引物(0.2 μL)(擎科，天津)和8.4 μL ddH2O。使用T100 PCR儀(Bio-Rad, 美國(guó))進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，56℃退火 30 s，72℃延伸30 s，36個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。10℃條件下保存。

1.2.4 毛細(xì)管電泳位點(diǎn)信息檢測(cè) 將不同熒光的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物混合在一起，然后使用ABI 3730XL DNA測(cè)序儀(Applied Biosystems，美國(guó))進(jìn)行位點(diǎn)信息檢測(cè)，再使用Gene Marker v 2.2.0軟件(Soft Genetics LLC，美國(guó))精準(zhǔn)讀取片段大小。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用PowerMarker 3.25[18]和GenAlEx 6.51[19]軟件進(jìn)行計(jì)算，包括多態(tài)信息含量(polymorphism information content, PIC)、主要等位位點(diǎn)頻率(major allele frequency, MAF)、等位位點(diǎn)數(shù)量(number of alleles,Na)、遺傳多樣性(genetic diversity,GD)、期望雜合度(expected heterozygosity,He)、鑒別概率(probability of identification,PI)等遺傳多樣性指標(biāo)。使用PowerMarker 3.25評(píng)估各資源間的Nei’s遺傳距離，并使用FigTree v1.4.3構(gòu)建UPGMA聚類(lèi)樹(shù)。使用Structure 2.3.3[20]的貝葉斯模型進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)的分析，參數(shù)迭代次數(shù)(length of burnin period)設(shè)置為 10 000，馬爾可夫鏈重復(fù)次數(shù)(number of MCMC Reps after burnin)設(shè)置為100 000。使用GenAlEx 6.51對(duì)供試資源進(jìn)行主坐標(biāo)分析(principal co-ordinates analysis, PCoA)。使用Prism 9.0進(jìn)行指紋圖譜的圖像化處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 日本栗的親緣關(guān)系與聚類(lèi)特點(diǎn)

為了了解日本栗在東亞栗屬的分類(lèi)地位及其與其他栗屬植物的親緣關(guān)系，本試驗(yàn)加入了13份錐栗、22份茅栗和30份板栗資源進(jìn)行聚類(lèi)和群體結(jié)構(gòu)分析。結(jié)果顯示(圖1-A、C)，整個(gè)東亞栗屬植物為單系群，存在明顯的種間界限。錐栗位于所有資源的基部位置，板栗位于次基部位置，隨后日本栗和茅栗組成了一個(gè)姊妹系。說(shuō)明日本栗與茅栗具有較近的親緣關(guān)系。同時(shí)在聚類(lèi)分析中發(fā)現(xiàn)，板栗資源CM-18聚于茅栗資源，結(jié)合群體結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示，CM-18資源中11.8%遺傳成分來(lái)之茅栗，判定其為種間雜種。

日本栗品種資源單獨(dú)聚類(lèi)結(jié)果顯示(圖1-D)，所有資源主要分為2個(gè)分支，其中資源CC-12(遼栗23號(hào))、CC-14(08-3)、CC-18(208)、CC-22(寬優(yōu)9113)、CC-27(927)、CC-43(遼丹58)、CC-44(9912)、CC-45(遼栗15號(hào))、CC-55(包營(yíng)獨(dú)果)和CC-58(遼丹61)等10份來(lái)源于我國(guó)的日本品種(系)資源組成了簇1(Cluster 1)；其余日本栗品種資源獨(dú)立一支組成簇2(Cluster 2)，包括25個(gè)日本本土品種資源、8個(gè)朝鮮半島品種資源和16個(gè)中國(guó)品種資源且均為已知中日雜交品種(系)，其中5個(gè)朝鮮半島品種位于Cluster 2的基部位置。

注：A：124份栗屬植物的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)；青色部分為日本栗，紫色為茅栗，粉色為板栗，綠色為錐栗；B：不同K值的ΔK分布；C：124份供試材料的群體結(jié)構(gòu)；D：日本栗品種的種內(nèi)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)；藍(lán)色部分為Cluster 1，紅色部分為Cluster 2。

2.2 日本栗品種資源的遺傳多樣性

對(duì)59個(gè)日本栗品種進(jìn)行熒光毛細(xì)管電泳檢測(cè)，在17對(duì)SSR引物中共獲得131個(gè)等位位點(diǎn)(表3)。每個(gè)基因座上的等位位點(diǎn)(Na)為5～13，平均值7.706個(gè)；主效等位位點(diǎn)頻率(MAF)為0.194～0.732，平均值為0.442；觀察雜合度(Ho)為0.068～0.831，平均值為0.568；期望雜合度(He)為0.370～0.875，平均值為0.689；多態(tài)信息含量(PIC)為0.373～0.815，平均值約為0.605；香農(nóng)指數(shù)(I)為0.733～2.233，平均值為1.459。以上數(shù)據(jù)表明，選用的SSR標(biāo)記具有豐富的多態(tài)性，供試日本栗品種(系)資源具有較高雜合度且遺傳多樣性豐富。

2.3 日本栗品種資源的群體結(jié)構(gòu)與主坐標(biāo)分析

為了進(jìn)一步評(píng)估日本栗品種資源的遺傳特征，本試驗(yàn)利用structure 2.3.3和GenAlEx 6.51進(jìn)行了群體結(jié)構(gòu)和主坐標(biāo)分析(圖2)。結(jié)果顯示，當(dāng)K=2時(shí)，ΔK有最大值，表明59份日本栗品種(系)資源最佳可為兩個(gè)類(lèi)群。大部分資源為混合類(lèi)型，說(shuō)明兩個(gè)分群之間存在著廣泛的雜交現(xiàn)象，其中組1中Q值大于0.8的資源分別是CC-12(遼栗23號(hào))、CC-14(08-3)、CC-18(208)、CC-22(寬優(yōu)9113)、CC-27(927)、CC-34(山大)、CC-35(1401)、CC-43(遼丹58號(hào))、CC-44(9912)、CC-45(遼栗15號(hào))、CC-55(包營(yíng)獨(dú)果)和CC-58(遼丹6號(hào))，這些品種與聚類(lèi)樹(shù)Cluster 1的資源一致，分別是中國(guó)境內(nèi)的日本栗品種(系)，同時(shí)也與主坐標(biāo)分析中組1聚類(lèi)資源一致。組2 Q值大于0.8的資源共13個(gè)，分別是CC-1(有磨)、CC-3(1903)、CC-7(紫峰)、CC-8(芳養(yǎng)玉)、CC-11(遼栗10號(hào))、CC-13(伊吹)、CC-19(武藏)、CC-20(國(guó)見(jiàn))、CC-21(石槌)、CC-25(出云)、CC-26(兔山9號(hào))、CC-31(大丹波)和CC-32(1703)，其中日本本土品種9個(gè)，中國(guó)品種3個(gè)、朝鮮半島品種1個(gè)。當(dāng)K=3時(shí)，CC-8(芳養(yǎng)玉)、CC-25(出云)、CC-53(大國(guó))、CC-3(1903)、CC-37(玉光)、CC-49(農(nóng)林8號(hào))、CC-9(黃豐)和CC-15(燒鍋8號(hào))等組成了新的分群。綜上可知，中國(guó)境內(nèi)的日本栗品種與日本本土的日本栗品種存在一定程度的分化，且各資源間存在著頻繁的基因交流。

注：A：利用structure 2.3.3計(jì)算不同K值的ΔK分布，K代表樣品分群個(gè)數(shù)，ΔK值越大支持所對(duì)應(yīng)的K值越合理；B：品種資源的群體結(jié)構(gòu)；C：品種資源的主坐標(biāo)分析(PCoA)。紅色圈為部分中國(guó)境內(nèi)的資源，藍(lán)色圈主要是日本和朝鮮半島的資源，其中綠色主要是日本本土的資源。

2.4 日本栗品種的指紋圖譜構(gòu)建

通過(guò)17個(gè)SSR分子標(biāo)記的位點(diǎn)檢測(cè)，共獲得多態(tài)性和可重復(fù)等位位點(diǎn)組成的232個(gè)基因型。基于基因分型數(shù)據(jù)在GenAlex 6.51中對(duì)59個(gè)日本栗品種進(jìn)行了多基因座匹配分析，未檢測(cè)到基因型完全一致的兩個(gè)品種，表明在59個(gè)日本栗品種都有其獨(dú)特的SSR多位點(diǎn)基因型組合。為了評(píng)估17個(gè)分子標(biāo)記的指紋識(shí)別能力，計(jì)算了兩個(gè)關(guān)鍵統(tǒng)計(jì)值PI和PIsibs(表3)。結(jié)果表明，每個(gè)引物的PI值范圍為0.028(CmSI0922)～0.424(CmSI0614)，平均值為0.151。假設(shè)所有標(biāo)記位點(diǎn)獨(dú)立分離，兩個(gè)隨機(jī)個(gè)體在所有17個(gè)引物中存在完全相同多位點(diǎn)基因型的概率估算為3.471×10-16。PIsibs被定義為PI上限，17個(gè)SSR標(biāo)記的PIsibs在0.319(CmSI0922)～0.574(CmSI0396和CmSI0561)之間，平均每個(gè)位點(diǎn)為0.443，組合的PIsibs為7.764×10-7。

表3 17對(duì)SSR分子標(biāo)記在59個(gè)日本栗資源的遺傳數(shù)據(jù)

根據(jù)位點(diǎn)組合數(shù)據(jù)，計(jì)算了17個(gè)SSR標(biāo)記在不同標(biāo)記數(shù)量隨機(jī)組合下的識(shí)別能力，以評(píng)估能完全區(qū)分所收集的日本栗品種需要的標(biāo)記數(shù)量。結(jié)果顯示，當(dāng)3個(gè)SSR標(biāo)記相結(jié)合時(shí)，PI值接近0，說(shuō)明在標(biāo)記數(shù)為3時(shí)，所有收集日本栗品種可以被獨(dú)立鑒定(圖3)。根據(jù)核心標(biāo)記選擇原則和基因型數(shù)據(jù)結(jié)果，本試驗(yàn)篩選出3個(gè)SSR分子標(biāo)記作為核心標(biāo)記。首先選擇具有較高PIC值和較低PI值的CmSI0922，該引物將59個(gè)品種獨(dú)立分為32組，從所有品種中獨(dú)立分離出14個(gè)品種。當(dāng)添加第二個(gè)標(biāo)記(CmSI0702)進(jìn)行進(jìn)一步分析時(shí)，可以唯一識(shí)別59個(gè)品種中的48個(gè)，占所有品種資源的81.36%。添加第三個(gè)(CmSI0658)標(biāo)記進(jìn)行分析時(shí)可以完全區(qū)分59個(gè)日本栗品種，而3個(gè)核心標(biāo)記的PI和PIsibs組合分別為2.256×10-4和5.184×10-2，隨后總結(jié)了這些核心標(biāo)記的等位基因大小和頻率(圖4)。由此，本研究使用這3個(gè)核心標(biāo)記以熱圖的形式構(gòu)建了59個(gè)日本栗品種的指紋圖譜(圖5)，其中每個(gè)標(biāo)記有兩個(gè)等位位點(diǎn)組成，每列中的一個(gè)顏色代表一個(gè)變異位點(diǎn)信息。

注：PI為兩個(gè)隨機(jī)個(gè)體具有相同基因型的平均概率，PIsibs為從一個(gè)種群中隨機(jī)發(fā)現(xiàn)具有相同基因型的兩個(gè)個(gè)體的概率。

圖4 核心引物的位點(diǎn)頻率

注：每種顏色框代表一個(gè)等位位點(diǎn)，其中白色框代表缺失位點(diǎn)；縱坐標(biāo)為品種編號(hào)，橫坐標(biāo)為核心標(biāo)記號(hào)。

3 討論

3.1 日本栗品種的遺傳多樣性與群體結(jié)構(gòu)

SSR分子標(biāo)記作為第二代分子標(biāo)記技術(shù)，隨著基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)的普及，其開(kāi)發(fā)利用也得到前所未有的發(fā)展，現(xiàn)階段已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物資源鑒定、物種遺傳多樣性以及遺傳圖譜構(gòu)建等各種遺傳相關(guān)領(lǐng)域[15，17]。國(guó)際植物新品種保護(hù)聯(lián)盟(International union for the protection of new varieties of plants, UPOV)建議使用SSR分子標(biāo)記作為構(gòu)建植物DNA指紋圖譜的首選方法[21]。SSR分子標(biāo)記的多態(tài)性、穩(wěn)定性和可重復(fù)性的好壞程度決定著相關(guān)遺傳研究的有效性和成功與否[22-23]。本研究為了獲得更有效的基因分型，使用了前期篩選的17對(duì)高效SSR引物[17]。17對(duì)SSR引物在59份日本栗資源中共檢測(cè)到131個(gè)等位位點(diǎn)，每個(gè)標(biāo)記平均有7.706個(gè)等位位點(diǎn)，位點(diǎn)數(shù)量高于Muller等[24]、Jiang等[25]和Terakami等[16]關(guān)于栗屬植物SSR位點(diǎn)的報(bào)道；各基因座的PIC變幅為0.375～0.815，平均值為0.605。所有標(biāo)記中有4個(gè)標(biāo)記的PIC在0.25～0.50之間，表現(xiàn)出中等多態(tài)性；13個(gè)標(biāo)記的PIC大于0.50，說(shuō)明選用的SSR引物表現(xiàn)出高多態(tài)性，能夠準(zhǔn)確地評(píng)估供試日本栗品種的遺傳特點(diǎn)。59份日本栗品種資源的雜合度變幅為0.389～0.857，平均值為0.685，與Nishio等[26]關(guān)于日本栗雜合度的計(jì)算結(jié)果一致，表現(xiàn)出較高的雜合度。這一現(xiàn)象是栗屬植物的典型特征，究其原因是由于栗屬植物為自交不親和植物，同域內(nèi)的栗屬植物僅有通過(guò)雜交才能繁衍所致[17,27]。同時(shí)，日本栗雜合度略高于板栗品種的0.652[17]，說(shuō)明日本栗品種資源間存在較高頻率的雜交事件，這一特點(diǎn)在日本栗群體結(jié)構(gòu)的分析中也得到了驗(yàn)證：各個(gè)資源可以觀察到有來(lái)自不同分群不同程度的遺傳成分。與中國(guó)板栗品種的PIC值和香農(nóng)指數(shù)(I)[17]相比可知，日本栗品種的多樣性略低于中國(guó)板栗，推測(cè)有兩方面的原因：其一為本試驗(yàn)的供試品種資源數(shù)量相比板栗品種較少；其二為日本栗進(jìn)化地位較低，物種本身的多樣性較低。

3.2 日本栗的分類(lèi)地位與日本栗品種的聚類(lèi)特征

栗屬植物系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的結(jié)果顯示，日本栗和茅栗具有較近的種間親緣關(guān)系，這一結(jié)果與聶興華等[28]的研究結(jié)果一致；而Lang等[6]和Kang等[2]利用葉綠體序列聚類(lèi)分析的結(jié)果則顯示日本栗位于栗屬植物的基部位置，出現(xiàn)了明顯的核質(zhì)沖突現(xiàn)象。核質(zhì)沖突現(xiàn)象通常認(rèn)為是由趨同進(jìn)化、譜系分選不完全和雜交或基因漸滲三方面因素造成的[29]。栗屬植物屬內(nèi)共7個(gè)種，其譜系分選明確，本研究推測(cè)日本栗在漫長(zhǎng)的歷史演化過(guò)程中可能保留著栗屬植物祖先種的葉綠體信息，由于日本栗與其他栗屬植物在歷史上發(fā)生過(guò)多世代的基因漸滲，進(jìn)而導(dǎo)致現(xiàn)今的日本栗核信息與日本栗祖先種已經(jīng)發(fā)生了顯著分化。

日本栗品種的種內(nèi)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)、群體結(jié)構(gòu)和主坐標(biāo)分析一致支持中國(guó)境內(nèi)的部分日本栗品種獨(dú)立形成一個(gè)分支。日本栗品種間存在著較為豐富的基因交流，尤其是朝鮮半島的品種資源大多為混合類(lèi)型，這與其所在的地理位置密切相關(guān)。

3.3 引物的鑒別能力與日本栗栽培品種(系)的指紋圖譜

傳統(tǒng)園藝果樹(shù)和經(jīng)濟(jì)林木鑒別主要以形態(tài)分類(lèi)法為主，而種內(nèi)家系、雜交系、無(wú)性系等形態(tài)上較難區(qū)別，利用分子標(biāo)記構(gòu)建的指紋圖譜能夠檢測(cè)到的在分子水平上的位點(diǎn)變異，實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)單、快速和有效的資源鑒別[30]。本研究在基因分型后，對(duì)PI和PIsibs這兩個(gè)指紋識(shí)別的重要指標(biāo)進(jìn)行計(jì)算，使用17個(gè)SSR分子標(biāo)記進(jìn)行多位點(diǎn)匹配計(jì)算后，其值分別為3.471×10-16和7.764×10-7。Waits等[31]認(rèn)為當(dāng)PI約為1×10-4～1×10-2時(shí)，便可以鑒定出隨機(jī)出現(xiàn)的大多數(shù)自然個(gè)體，表明本研究選用的SSR分子標(biāo)記識(shí)別具有巨大潛力。為了快速鑒定日本栗資源，本研究根據(jù)多位點(diǎn)匹配分析的結(jié)果，確定了至少需要3個(gè)核心引物才能完全匹配到有唯一對(duì)應(yīng)的指紋信息，并利用PIC和PI兩個(gè)參數(shù)對(duì)17個(gè)SSR標(biāo)記進(jìn)行評(píng)估篩選，最終確定CmSI0922、CmSI00702和CmSI0658作為核心引物，3個(gè)核心引物的PI為2.256×10-4，也在Waits等[31]建議的范圍之內(nèi)。隨后本研究利用3個(gè)核心引物構(gòu)建了日本栗品種(系)資源的圖像化指紋圖譜，該圖譜能夠完全區(qū)分59份日本栗品種?，F(xiàn)階段中國(guó)板栗品種的指紋圖譜已經(jīng)構(gòu)建完成[14]，日本栗品種指紋圖譜的補(bǔ)充為栗屬植物的資源鑒定和保護(hù)利用提供了有力支撐。

4 結(jié)論

日本栗與中國(guó)的茅栗具有較近的種間親緣關(guān)系，相比其他栗屬植物,日本栗栽培資源分布范圍較狹窄，但是其具有較為豐富的遺傳多樣性。此外，通過(guò)遺傳分析發(fā)現(xiàn)中國(guó)境內(nèi)的部分日本栗品種(系)相對(duì)獨(dú)立，且各品種(系)間存在較為廣泛的基因交流。本研究利用3個(gè)核心引物構(gòu)建完成了能夠完全區(qū)分59份日本栗品種(系)的指紋圖譜，為今后日本栗資源的保護(hù)與利用提供了理論參考。