野生薄皮木組培快繁體系優(yōu)化

郭 麗， 朱飛雪， 寇艷玲， 常介田(河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院， 鄭州 451450)

薄皮木(LeptodermisoblongaBunge)為茜草科(Rubiaceae)野丁香屬(Leptodermis)落葉小灌木，在我國主要分布在華北，西至陜西漢中，南至河南北部。薄皮木根系發(fā)育快，入土深度可達1～1.5 m，故其具有較強的抗旱耐寒能力，適應(yīng)能力強，一般生于海拔1 300 m以下的石質(zhì)山坡上。薄皮木花期6～9月，花繁枝多，花色鮮艷、花期長、花香四溢，是一種極具觀賞價值的野生鄉(xiāng)土植物，可作為觀賞、綠化、盆景等栽培。但野生薄皮木仍處于野生狀態(tài)，未能開發(fā)利用，限制了其推廣應(yīng)用的速度和地域范圍。

目前國內(nèi)外學(xué)者對于野生薄皮木的研究主要集中在其化學(xué)成分及抗炎活性的研究[1-2]，種子萌發(fā)特性[3-4]，葉表皮形態(tài)特征[5-6]等方面。由于薄皮木是一種野生觀賞植物，傳統(tǒng)的繁殖方法是采用種子繁殖和扦插繁殖，但是種子繁殖萌芽率低且不能穩(wěn)定保持母本性狀[4]，扦插和埋條繁殖率低[7]。組織培養(yǎng)技術(shù)具有后代遺傳穩(wěn)定、繁殖速度快和繁殖系數(shù)高等特點[8]，因此，運用組織培養(yǎng)技術(shù)可以快速繁育與母本性狀一致的良種，并且在短時間內(nèi)能得到大量無菌苗及種質(zhì)資源的保存。耿宵等[9]以野生觀賞植物薄皮木莖段為外植體，最適誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L，最適增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA 5.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L，初步建立野生薄皮木組培體系。但是原產(chǎn)地不同，不同品種間誘導(dǎo)率、增殖率和生根率不同，植物生長調(diào)節(jié)劑的種類、濃度配比不固定，從而導(dǎo)致不同品種快繁體系關(guān)鍵技術(shù)存在差異性。因此，針對不同野生植物優(yōu)良品種建立相應(yīng)的組培快繁體系是必要的。本研究以野生薄皮木帶芽莖段為外植體，以6-BA(6-芐氨基嘌呤)、NAA(萘乙酸)、IBA(吲哚丁酸)、ZT(玉米素)設(shè)置不同的濃度配比，研究其對不定芽誘導(dǎo)、增殖、生根的影響，確立野生薄皮木組培快繁過程中不同時期的最適培養(yǎng)條件，建立野生薄皮木組織培養(yǎng)再生體系，從而為其大規(guī)模繁育、引種馴化、栽培等提供一定的理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持，并為野生植物資源早日在園林中推廣應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料野生薄皮木采自太行山深處的林州石板巖地帶，種植于河南省農(nóng)業(yè)高新科技園區(qū)試驗基地，在河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院組織培養(yǎng)實驗室進行試驗。

1.2 外植體處理

采集生長良好的薄皮木帶腋芽莖段，去除葉片，將嫩枝剪成帶有2～4個腋芽的小段。將其放入燒杯中，加入少許洗潔精并在燒杯上面蓋一層紗布，自來水流水沖洗30 min，然后用無菌水沖洗3～4遍，將供試材料放入超凈工作臺備用。

1.3 外植體消毒與啟動培養(yǎng)

將清洗晾干的莖段分別用不同消毒劑組合進行消毒處理(表1)，再用無菌水沖洗5～6次后接入MS培養(yǎng)基上，接種時將莖段兩端剪掉，防止莖段兩端被消毒劑毒害，影響外植體的正常生長[10]。每個處理接種30瓶，每瓶接種1個莖段。20 d后統(tǒng)計成活率、污染率、死亡率。

表1 不同消毒劑處理時間Table 1 Different disinfectant treating time

1.4 增殖培養(yǎng)

待初代培養(yǎng)的幼芽長至1～2 cm時，將其切下接種在添加6-BA(0.5、1、2、3、5 mg/L)、NAA 0.1 mg/L、ZT(0.5、1、2、3 mg/L)激素的MS培養(yǎng)基上進行增殖培養(yǎng)。每個處理接種30瓶，每瓶接種1個外植體，30 d后統(tǒng)計各處理芽的增殖率及幼芽生長狀況。

1.5 生根培養(yǎng)

當增殖培養(yǎng)基上的幼芽長至2～3 cm時，將其切至生根培養(yǎng)基進行生根誘導(dǎo)試驗，以1/2 MS為基本培養(yǎng)基，添加NAA 0.1 mg/L、NAA 0.5 mg/L、IBA 0.1 mg/L、IBA 0.5 mg/L、IBA 0.1 mg/L+NAA 0.05 mg/L、IBA 0.1 mg/L+NAA 0.1 mg/L不同濃度激素。每個處理接種15瓶，每瓶接種2個芽體。30 d后統(tǒng)計各處理的生根率及根的生長狀況。

1.6 煉苗移栽

選用生根培養(yǎng)60 d后生長健壯、根系發(fā)育良好的組培苗進行煉苗移栽。30 d后統(tǒng)計成活率。

1.7 培養(yǎng)條件

誘導(dǎo)和增殖培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，生根培養(yǎng)基以1/2 MS為基本培養(yǎng)基，其中添加瓊脂6 g/L，蔗糖30 g/L，pH=5.8，分別加入不同濃度激素配比。培養(yǎng)室溫度為(25±1)℃，光照時間16 h，光照強度2 500 lx。

污染率(%)=(污染的外植體數(shù)/接種的總外植體數(shù))×100%；

萌芽率(%)=(萌芽外植體數(shù)/接種的總外植體數(shù))×100%；

未萌芽率(%)=(腋芽未萌發(fā)的外植體數(shù)/接種外植體數(shù))×100%；

增殖系數(shù)=增殖芽數(shù)/接種芽數(shù)；

生根率(%)=(生根苗數(shù)/接種苗數(shù))×100%。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2007數(shù)據(jù)分析工具進行單因素方差分析， Duncan新復(fù)極差法(LSR)進行多重比較分析，所有測定結(jié)果用平均值和標準誤來表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 消毒劑種類和消毒時間對外植體萌芽的影響

消毒劑種類和消毒時間不同，對外植體萌芽效果不同。將外植體放入不同種類消毒劑，經(jīng)過不同消毒時間處理后，其萌芽率、污染率和未萌芽率存在顯著差異(表2、表3、表4)。

表2 不同酒精、HgCl2處理時間對野生薄皮木莖段萌芽的影響Table 2 Effects of different alcohol and HgCl2 treatment time on the growth of wild Leptodermis oblongaBunge. stem segment

表3 不同酒精、NaClO處理時間對野生薄皮木莖段萌芽的影響Table 3 Effects of different alcohol and NaClO treatment time on the growth of wild Leptodermis oblonga Bunge. stem segment

表4 不同酒精、H2O2處理時間對野生薄皮木莖段萌芽的影響Table 4 Effects of different alcohol and H2O2treatment time on the growth of wild Leptodermis oblongaBunge. stem segment

從表2可知，酒精和HgCl2消毒時間的長短對外植體萌芽都有顯著影響。隨著酒精和HgCl2消毒時間的延長，外植體萌芽率呈先升后降的趨勢，外植體的污染率呈下降趨勢，當酒精消毒時間為30 s時，外植體未萌芽率顯著高于酒精消毒時間10 s和20 s。表明酒精消毒可有效抑制外植體的污染，但消毒時間過長會對外植體造成毒害作用，酒精消毒相同時間下，HgCl2消毒時間過長會對外植體萌芽造成抑制作用。當酒精消毒時間為20 s和HgCl2消毒時間為10 min時，外植體萌芽率為90.74%，且此條件下污染率較低，為5.56%；當外植體酒精消毒30 s和HgCl2消毒10 min、12 min時，雖然污染率為0，但其萌芽率顯著低于A 5。因此，酒精消毒20 s和HgCl2消毒10 min為外植體消毒最佳組合。

從表3可知，除B 9外，隨著酒精和NaClO消毒時間的延長，萌芽率呈上升趨勢。隨著酒精和NaClO消毒時間延長至30 s和12 min時，雖然與酒精和NaClO消毒時間20 s和10 min的萌芽率差異不顯著，但從數(shù)據(jù)分析看，其萌芽率開始降低，且未萌芽率與其他處理存在顯著性差異。NaClO消毒時間8 min時，污染率高，萌芽率低。NaClO消毒12 min、酒精消毒20 s時，萌芽率達到90.74%，且此條件下污染率較低，為3.71%，未萌芽率5.56%。因此，NaClO 12 min和酒精20 s為消毒最佳組合。

從表4可知，酒精和H2O2處理對野生薄皮木莖段消毒效果不佳，整體萌芽率低，污染率和未萌芽率高，在野生薄皮木莖段消毒中不適合應(yīng)用。

2.2 不同生長調(diào)節(jié)劑對不定芽增殖的影響

將未污染、生長一致初代培養(yǎng)的莖段(圖1 A)接至添加不同濃度和不同生長調(diào)節(jié)劑的MS培養(yǎng)基上。由表5可知，不同培養(yǎng)組合上的不定芽長勢不同。當在培養(yǎng)基中加入0.5 mg/L 6-BA和0.1 mg/L NAA時，側(cè)芽生長慢，無增殖現(xiàn)象；當在培養(yǎng)基中加入1.0 mg/L 6-BA和0.1 mg/L NAA時，側(cè)芽生長較慢，基本無增殖現(xiàn)象；當6-BA濃度增大至2.0 mg/L時，側(cè)芽生長速度加快，第5天有側(cè)芽萌發(fā)；當6-BA濃度增大至5.0 mg/L時，側(cè)芽生長速度加快，莖段膨大，葉片黃綠色，且葉片玻璃化，再生芽生長勢差(圖1 D)，說明激素濃度過高，會對側(cè)芽產(chǎn)生一定的毒害作用，試驗發(fā)現(xiàn)，此濃度新發(fā)側(cè)芽葉片上還有愈傷發(fā)生。6-BA 3.0 mg/L增殖系數(shù)無6-BA 5.0 mg/L高，但它們之間無顯著差異，而且側(cè)芽生長正常，葉片綠色(圖1 B、C)。在6-BA和NAA生長調(diào)節(jié)劑組合中，以添加6-BA 3.0 mg/L和0.1 mg/L NAA的培養(yǎng)基(圖1 E)為理想增殖培養(yǎng)基。

表5 不同生長調(diào)節(jié)劑對增殖培養(yǎng)的影響Table 5 Effects of different plant growth regulators on the proliferation culture

在6-BA和NAA植物生長調(diào)節(jié)劑組合中發(fā)現(xiàn)，6-BA濃度低，增殖系數(shù)低，6-BA濃度高時又發(fā)生玻璃化和葉片生長不正?，F(xiàn)象，且增殖系數(shù)不高。預(yù)備試驗發(fā)現(xiàn)，ZT增殖系數(shù)較好，且單獨使用ZT增殖效果好。通過添加ZT試驗發(fā)現(xiàn)，側(cè)芽增殖系數(shù)高，隨著ZT濃度的增大，在ZT 2.0 mg/L時出現(xiàn)峰值，隨著ZT濃度加大，增殖系數(shù)呈下降趨勢。ZT 1.0 mg/L和2.0 mg/L增殖系數(shù)無顯著差異，使用不同濃度ZT的側(cè)芽生長勢均好。因此，從經(jīng)濟價值和使用效果綜合考慮，以MS+ZT 1.0 mg/L(圖1 F)為野生薄皮木最佳增殖培養(yǎng)基。

2.3 不同植物生長調(diào)節(jié)劑濃度對組培苗生根的影響

生根培養(yǎng)以1/2 MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度IBA或NAA及二者組合。由表6可知，植物生長調(diào)節(jié)劑及濃度不同，對野生薄皮木組培苗生根效果不同。在添加NAA的培養(yǎng)基中，組培苗無生根現(xiàn)象，生根率0。在添加IBA的培養(yǎng)基中，生根組培苗根系細而長，有側(cè)根生成，在添加0.1 mg/L IBA的培養(yǎng)基中，其根長大約2 cm，莖基部形成塊狀愈傷時，無根形成，生根率60%(圖1 G)；當IBA濃度為0.5 mg/L時，其生根率降低，根少、細而長。在NAA和IBA組合試驗中發(fā)現(xiàn)，其生根效果比單獨使用一種植物生長調(diào)節(jié)劑生根率高，在IBA 0.1 mg/L和NAA 0.05 mg/L時，生根率100%，根系粗壯，根長適中，有側(cè)根，生長健壯(圖1 H)。當IBA濃度為0.1 mg/L和NAA濃度為0.1 mg/L時，隨著植物生長調(diào)節(jié)劑濃度的增加，生根率降低，根粗壯而短，生長慢。因此，野生薄皮木最佳生根培養(yǎng)基為1/2 MS+IBA 0.1 mg/L+NAA 0.05 mg/L。

注：A為初代培養(yǎng)；B～D為增殖培養(yǎng)初期；E～F為增殖培養(yǎng)中期；G～H為生根培養(yǎng)；I為移栽組培苗。圖1 野生薄皮木組織培養(yǎng)過程Fig.1 Tissue culture of wild Leptodermis oblonga Bunge.

表6 不同濃度NAA和IBA對組培苗生根的影響Table 6 Effects of different NAA and IBA concentrations on rooting culture

2.4 組培苗成活率

將野生薄皮木生根組培苗移至室溫、自然光下經(jīng)過5 d馴化煉苗后，將苗取出，取出時小心不要傷根，洗凈根部培養(yǎng)基，移栽至草炭∶蛭石∶珍珠巖=3∶1∶1消毒后的基質(zhì)中，栽好后先放在遮蔭的環(huán)境中，等緩苗后進行正常環(huán)境條件管理，60 d后植株生長良好，移栽成活率達90%以上(圖1 I)。

3 結(jié)論與討論

外植體消毒是獲得無菌材料的關(guān)鍵因素，選擇不同的消毒劑種類和消毒時間尤為重要[11-12]。目前，常用的消毒劑有酒精、0.1%HgCl2、NaClO(2%～5%)和10%H2O2等。由于酒精具有使植物材料表面浸濕的作用，常與其他消毒劑配合使用，但70%～75%的酒精穿透力強，也很易殺死植物細胞，所以酒精消毒浸泡時間不宜過長，因此，本試驗酒精消毒時間設(shè)置為10 s、20 s和30 s三個梯度，分別與HgCl2、NaClO和H2O2配合使用。選擇莖段作為外植體，應(yīng)選擇莖段達到中度木質(zhì)化[13]，木質(zhì)化程度高低都不利于芽的萌發(fā)，外植體采集時間以春秋季節(jié)污染率低于夏冬季節(jié)[14]。野生薄皮木外植體消毒試驗發(fā)現(xiàn)，5月份用75%酒精和5%NaClO溶液消毒外植體，75%酒精20 s和5%NaClO 12 min可以有效控制外植體污染率，而8月份和11月份用75%酒精30 s和5%NaClO 20～30 min進行外植體消毒，其污染率達到50%～60%。在三組消毒組合中，H2O2與酒精消毒外植體最高萌芽率為57.41%；75%酒精20 s與0.1%HgCl210 min消毒外植體莖段最高萌芽率為90.74%；75%酒精20 s與5%NaClO 12 min消毒外植體莖段最高萌芽率為90.74%。但由于HgCl2在消毒中會有殘留，對植物材料有毒害作用，且會污染環(huán)境[15]。因此，本試驗得出野生薄皮木莖段消毒最佳組合為75%酒精20 s+5%NaClO 12 min。此外，試驗發(fā)現(xiàn)，野生薄皮木莖段2%NaClO消毒效果不及5%NaClO，這可能是野生薄皮木莖段為木本，需要消毒劑濃度高的原因。

外植體的萌發(fā)受年齡、生理狀態(tài)、采集時期等多種因素有關(guān)[16]。試驗發(fā)現(xiàn)，春季外植體萌芽率高，這可能是處于萌動狀態(tài)的外植體容易誘導(dǎo)萌芽。植物生長調(diào)節(jié)劑種類及濃度對不定芽的誘導(dǎo)和增殖具有很大影響。離體培養(yǎng)常用的植物生長調(diào)節(jié)劑有6-BA、NAA、IAA、GA3等[17]，一般認為6-BA利于不定芽外植體的分化。因此，本試驗選用在MS培養(yǎng)基中加入6-BA和NAA兩種植物生長調(diào)節(jié)劑。通過5組不同植物生長調(diào)節(jié)劑濃度對比試驗發(fā)現(xiàn)，兩種植物生長調(diào)節(jié)劑的配比對不定芽的增殖系數(shù)不高，植物生長調(diào)節(jié)劑濃度低時，幾乎無增殖現(xiàn)象；植物生長調(diào)節(jié)劑濃度高時，增殖系數(shù)增高，當6-BA濃度達到5 mg/L時，增殖系數(shù)為2.26，但出現(xiàn)側(cè)芽葉片黃綠色，玻璃化現(xiàn)象嚴重，側(cè)芽葉片上有愈傷發(fā)生。在MS培養(yǎng)基中加入ZT進行預(yù)備試驗發(fā)現(xiàn)，ZT濃度0.1 mg/L和0.2 mg/L時芽的增殖效果不佳，因此設(shè)置ZT濃度梯度從0.5 mg/L開始，ZT 1 mg/L增殖系數(shù)為5.72，ZT 2 mg/L增殖系數(shù)為6.03，當ZT濃度增加至3 mg/L時，增殖系數(shù)降低，說明植物生長調(diào)節(jié)劑濃度過大時，對側(cè)芽的增殖有抑制作用。在添加ZT的增殖培養(yǎng)基中，側(cè)芽增殖效果顯著，葉片綠色，無玻璃化現(xiàn)象。由于ZT 1 mg/L 和ZT 2 mg/L增殖系數(shù)差異不顯著，綜合各種因素，野生薄皮木側(cè)芽增殖培養(yǎng)以MS+ZT 1 mg/L為 最佳培養(yǎng)基。這與肖海峻等[18]利用ZT對于藍莓莖段側(cè)芽增殖研究結(jié)果一致。

生根培養(yǎng)是組織培養(yǎng)的重要一步，只有能正常生根的幼苗才能最終形成完整的植株[19]。植物組織培養(yǎng)生根培養(yǎng)常以1/2 MS為基本培養(yǎng)基，NAA和IBA在生根誘導(dǎo)中應(yīng)用較多，通常較低濃度生長素利于外植體生根，濃度過高則抑制生根。本試驗以單獨使用NAA則無根系的生成，生長素IBA在多種植物不定根誘導(dǎo)中起到較好的作用[20]。試驗表明，IBA生根作用較強，但根系細而長，在轉(zhuǎn)接培養(yǎng)時，根系易脫落；NAA和IBA配合使用，則發(fā)根數(shù)量多且根系粗壯，這與黃烈健等[21]對馬大雜種相思生根研究結(jié)果一致。

半木質(zhì)化帶芽莖段是野生薄皮木再生體系的適宜外植體材料，誘導(dǎo)腋芽萌芽率為90.74%。帶芽莖段適宜的消毒方法為先用75%酒精消毒20 s，再用5%NaClO消毒12 min。野生薄皮木再生體系適宜增殖培養(yǎng)基為MS+ZT 1 mg/L，適宜生根培養(yǎng)基為1/2 MS+IBA 0.1 mg/L+NAA 0.05 mg/L。生根苗移栽煉苗后，適宜栽培基質(zhì)為草炭∶蛭石∶珍珠巖=3∶1∶1，能獲得90%以上的成活率。