堿蓬內生菌對西瓜幼苗鹽脅迫的緩解效應

陳 昆， 王紅軍， 周銀芝

(1.商丘市農林科學院，河南商丘 476000； 2.商丘職業(yè)技術學院，河南商丘 476000； 3.河南省柘城縣農業(yè)農村局，河南柘城 476000)

西瓜營養(yǎng)豐富和含水量較高，是人們消暑解渴的重要瓜果之一。2018年我國西瓜總產量約6 302萬t，約占世界西瓜總產量的3/5，可見西瓜已成為農民增收的主要經濟作物之一，在我國農業(yè)經濟發(fā)展中占有重要地位。早春保護地西瓜較露地西瓜提早20～40 d上市，同時同一品種在甜度、口感等品質上又優(yōu)于露地種植，這使得保護地西瓜能夠以較高的價格提前占有市場，為種植戶帶來較高的經濟效益。市場的巨大需求和可觀的經濟回報，使得保護地西瓜種植面積呈現逐年擴大的趨勢，但保護地西瓜產量和品質隨種植年限的增加表現出逐漸下降的趨勢。這其中一個主要原因是設施土壤鹽漬化，保護地因棚膜覆蓋常年得不到雨水淋洗，棚內蒸發(fā)量大，鹽分隨著土壤水分的蒸騰被傳送到地表。另外，西瓜是需肥量較高的作物，肥料的過量施用使鹽分在土壤中聚集，進一步加重設施土壤鹽漬化現象。鹽漬化產生的鹽脅迫通過滲透脅迫、離子毒害、活性氧積累、光合抑制等多種方式嚴重影響植物的生長發(fā)育進程，顯著降低作物的產量和品質。因此，改善作物根際微環(huán)境，提高保護地西瓜抗鹽脅迫能力，對西瓜優(yōu)質高產和可持續(xù)發(fā)展有著十分迫切的現實意義。

植物內生菌(endophyte)是指那些將其全部或部分生活史生活于健康植物各種組織和器官內部，又不引起植物明顯危害的一類微生物。植物內生菌具有豐富的多樣性，并在植物體內廣泛存在。有研究表明，在長期的進化過程中大多數內生菌與植物形成了較為穩(wěn)定的生態(tài)互惠共生關系，內生菌從植株體內獲取營養(yǎng)物質并得以延續(xù)，而植物則利用內生菌分泌的次生代謝物(細胞分裂素、生長素、胡椒堿等)或借助其信號轉導來增強抗鹽堿、抗干旱、抗病菌、殺蟲等抗逆境脅迫能力。另外，內生菌還能夠通過影響植物的基因表達、調節(jié)抗逆代謝途徑等增強植物抗逆性。Karthikeyan等研究發(fā)現，在鹽脅迫條件下，內生菌通過誘導抗氧化酶活性的提高，增強清除機體活性氧(ROS)能力。Waller等研究得出，在逆境脅迫條件下，內生菌通過激活植物機體ASA-GSH代謝途徑提高細胞抗氧化能力。Ghaffari等研究發(fā)現，內生菌可通過影響植株碳氮代謝水平和乙烯的合成來促進植物在鹽堿脅迫環(huán)境中生長。韓慶慶等研究指出，被內生菌GB03侵染后的紫花苜蓿種子在鹽脅迫處理后，株高和根長顯著高于鹽脅迫條件下未受GB03侵染的處理。Khan等研究得出，內生細菌 SAK1 侵染大豆植株后，其分泌的ACC脫氨酶、植株激素和抗氧化劑能增強植株耐鹽脅迫能力。可見，內生菌在抵御植株逆境脅迫、提高抗逆能力、促進作物生長方面有重要的研究和利用價值。然而，當前有關內生菌尤其是堿蓬內生菌在西瓜抵御鹽脅迫方面的應用研究尚未見詳細報道。鹽堿地堿蓬生活在逆境條件下，從中分離出來的內生菌因可以生活在這種極端逆境下而具有許多其他生物所沒有的重要生理特性，有著十分重要的利用價值和科研價值。本試驗通過堿蓬內生菌侵染西瓜幼苗植株，研究堿蓬內生菌液對鹽脅迫下西瓜根際土壤微生物群落結構、土壤酶活性、根際構型、礦質離子平衡及碳氮代謝的影響，探究堿蓬內生菌提高西瓜幼苗耐鹽性的機理，為設施西瓜的優(yōu)質高產可持續(xù)栽培提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

由商丘市農林科學院提供西瓜自交系親本材料HG-1。堿蓬內生菌JPE8-1由從山東省東營市鹽堿地采集的堿蓬植株內分離獲得。

1.2 NaCl脅迫濃度的選擇

經試驗測定，堿蓬內生菌菌株JPE8-1在NaCl濃度0.1～1.6 mol/L范圍內生長良好。因此，選擇既適宜JPE8-1生長且又對西瓜產生鹽脅迫的NaCl濃度進行本次試驗研究，NaCl濃度定為 0.14 mol/L。

1.3 試驗設計

選取長勢基本一致的2葉1心西瓜幼苗，移栽至高15 cm、直徑15 cm的塑料盆中，緩苗7 d后進行脅迫試驗。試驗時，對照處理只添加清水 200 mL/盆，NE0處理澆灌0.14 mol/L NaCl溶液 200 mL/盆，NE1、NE2分別澆灌相應的內生菌液 200 mL/盆，14 d后對相關指標進行測定。

1.4 指標測定與方法

利用平板稀釋計數法測定土壤微生物數量，用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基分離培養(yǎng)細菌、改良高氏1號合成培養(yǎng)基分離培養(yǎng)放線菌、馬丁氏培養(yǎng)基分離培養(yǎng)真菌。采用靛酚比色法測定脲酶活性，磷酸苯二鈉法測定磷酸酶活性，3，5-二硝基水楊酸比色法測定蔗糖酶活性，高錳酸鉀滴定法測定過氧化氫酶活性。使用由杭州萬深檢測科技有限公司提供的彩色平臺式掃描儀(產品型號：LA-S根系分析獨立版)測定根系生長指標。采用火焰分光光度計法測定植株鈉、鉀離子含量。用等離子光譜儀(ICP-OES-Optima 8x00)測定鈉、鉀、鈣離子含量。利用分光光度計法測定蔗糖磷酸合成酶(SPS)、蔗糖合成酶(SS)、 酸性蔗糖轉化酶(AI)活性，硝酸還原酶(NR)、谷氨酰胺合成酶(GS)、谷氨酸合成酶(GOGAT)和谷氨酸脫氫酶(GDH)活性均采用Solarbio公司生產的標準試劑盒進行測定。

1.5 數據處理

利用Microsoft Excel 2007進行數據圖表處理，用SPSS 25.0軟件對數據進行統(tǒng)計分析，運用Duncan’s 新復極差法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 堿蓬內生菌對西瓜幼苗根際土壤微生物群體結構的影響

由表1可知，NE0、NE1、NE2處理細菌數量均顯著低于對照，且以單純鹽脅迫NE0處理值最低，較對照降低56.71%；NE1、NE2處理細菌數量較NE0分別增加83.38%、100.80%，表明內生菌侵染西瓜根系后能夠提高根際土壤細菌數量，且以改良后的NE2處理效果較好。在NE0處理下細菌占比較對照顯著下降，NE1、NE2處理細菌占比較對照提高，說明鹽脅迫能夠降低微生物群落結構中細菌比例，而內生菌能夠提高細菌在微生物群落結構中的占比。放線菌數量以CK值最大，NE2處理次之，NE1處理第3，NE0處理值最小，而放線菌占比以NE0處理值最大，NE2處理值最小。NE0處理真菌數量和占比顯著高于對照和其他處理，NE1、NE2處理真菌數量均顯著低于NE0，但仍高于對照CK，表明鹽脅迫能提高微生物群落中真菌占比，而內生菌能消減鹽脅迫條件下真菌在微生物群落結構中的占比。

表1 堿蓬內生菌對西瓜幼苗根際土壤微生物群體結構的影響

2.2 堿蓬內生菌對西瓜幼苗根際土壤酶活性的影響

由表2可知，NE0、NE1、NE2處理下脲酶活性均顯著低于對照，但NE1、NE2處理脲酶活性顯著高于NE0處理，較NE0分別增加62.07%、82.76%，這說明內生菌能夠有效緩解高鹽脅迫對脲酶活性的抑制，促進有機碳的轉化和積累。磷酸酶在對照CK、NE0、NE1、NE2處理間差異均顯著，其中NE0磷酸酶活性最低，而NE1、NE2處理均顯著高于NE0處理，且以NE2處理磷酸酶活性最大，這表明改良后的堿蓬內生菌液能夠在高鹽逆境條件下顯著增加磷營養(yǎng)供應。蔗糖酶活性以對照CK最高，NE2處理次之，二者差異不顯著；蔗糖酶在NE1、NE2處理間差異不顯著，但均顯著高于NE0，較NE0分別增加24.92%、33.23%，這說明堿蓬內生菌侵染西瓜幼苗后能夠為西瓜幼苗提供較多的碳素。NE0處理下過氧化氫酶活性最低，較對照降低41.35%，與對照差異顯著(<0.05)；NE1、NE2處理過氧化氫酶活性均顯著高于NE0，較NE0增加52.46%、59.84%，這說明堿蓬內生菌能夠有效減輕活性氧對西瓜幼苗根系的傷害。

表2 堿蓬內生菌對西瓜幼苗根際土壤酶活性的影響

2.3 堿蓬內生菌對鹽脅迫下西瓜幼苗根系構型的影響

由表3可知，單純的NaCl高鹽脅迫NE0能夠顯著降低西瓜幼苗總根長、主根長、根尖數、根粗、根表面積和根總體積， 說明高鹽脅迫能夠抑制西瓜幼苗根系形態(tài)建成。添加有堿蓬內生菌液的NE1、NE2處理各形態(tài)指標雖然均低于對照，但均顯著高于NE0處理，表明堿蓬內生菌液能夠有效緩解NaCl對西瓜幼苗根系生長的逆境脅迫。NE2各生長指標均對應高于NE1處理，表明改良后的內生菌液效果更佳。NE2處理西瓜幼苗總根長、主根長、根尖數、根粗、根表面積和根總體積較NE0分別增加47.72%、59.44%、43.87%、96.30%、79.04%、74.70%，與NE0差異顯著(<0.05)。

表3 堿蓬內生菌對鹽脅迫下西瓜幼苗根系構型的影響

2.4 堿蓬內生菌對鹽脅迫下西瓜幼苗礦質元素平衡的影響

由表4可知，在單純高鹽脅迫NE0處理下，西瓜地下部、地上部K、Ca、K/Na、Ca/Na含量均顯著低于對照，而Na含量顯著高于對照，表明高鹽脅迫能夠使西瓜幼苗遭受離子毒害。NE1、NE2處理下的西瓜地下部、地上部K含量和K/Na、Ca/Na比值均低于對照，地下部Ca含量低于對照，但均顯著高于NE0處理，且NE2處理較好，表明堿蓬內生菌能夠促進西瓜根系對營養(yǎng)元素的吸收利用，使植株細胞維持較高的滲透勢，保證細胞正常的生理代謝活動。NE2處理地下部和地上部Na含量較NE0處理分別降低45.96%、54.33%，二者差異顯著(<0.05)；NE2處理地下部和地上部K、Ca含量較NE0處理分別增加48.77%、30.95%和35.29%、39.92%，二者差異顯著(<0.05)；NE2處理地下部和地上部K/Na、Ca/Na比值較NE0處理分別增加176.11%、142.86%和198.29%、206.73%，二者差異顯著(<0.05)。

表4 堿蓬內生菌對鹽脅迫下西瓜幼苗礦質元素平衡的影響

2.5 堿蓬內生菌對西瓜葉片碳代謝的影響

由表5可知，鹽脅迫能夠顯著降低蔗糖磷酸合成酶、蔗糖合成酶活性，而堿蓬內生菌能夠緩解鹽脅迫對這2種酶的抑制作用。蔗糖磷酸合成酶、蔗糖合成酶活性在NE0處理下較對照分別降低30.67%、30.17%，與對照差異顯著(<0.05)；蔗糖磷酸合成酶、蔗糖合成酶在NE1、NE2處理下均顯著高于NE0，且以NE2處理下活性最大。3個處理酸性蔗糖轉化酶活性均顯著高于對照，且以NE0處理值最大，較對照增加29.59%。

2.6 堿蓬內生菌對西瓜葉片氮代謝的影響

由圖1可以看出，鹽脅迫(NE0)能夠顯著降低西瓜葉片硝酸還原酶(NR)、谷氨酰胺合成酶(GS)、谷氨酸合成酶(GOGAT)活性，顯著提升谷氨酸脫氫酶(GDH)活性，其中谷氨酸脫氫酶活性較對照提高27.32%。添加有內生菌液的NE1、NE2處理硝酸還原酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合成酶活性均低于對照，但均顯著高于NE0，說明堿蓬內生菌能夠有效消減鹽脅迫對氮代謝酶的抑制作用。NE2處理下硝酸還原酶(NR)、谷氨酰胺合成酶(GS)、谷氨酸合成酶(GOGAT)活性較NE0分別增加43.07%、36.29%、46.58%。NE0處理谷氨酸脫氫酶活性最大，較對照增加27.32%，與對照差異顯著(<0.05)；NE1、NE2處理亦高于對照，但NE1與對照差異不顯著(>0.05)。

表5 堿蓬內生菌對西瓜葉片碳代謝相關酶活性的影響

3 討論與結論

研究表明，土壤中細菌比例降低和真菌比例增加，容易出現土壤微生態(tài)失衡，誘發(fā)作物土傳真菌病害的流行，對作物長勢、產量和品質造成不利影響。本試驗結果表明，高鹽脅迫能夠顯著降低西瓜幼苗根際土壤細菌數量和細菌占比，顯著增加真菌數量和真菌占比，這意味著在鹽脅迫條件下西瓜幼苗根際微生物群落結構將由易于保持平衡且對作物生長有利的細菌主導型向易發(fā)土傳病害的真菌主導型轉變，不利于西瓜植株的形態(tài)建成和后期產量與品質的提高。NE1、NE2處理下西瓜根際土壤細菌數量和占比較NE0處理增加，而真菌數量和占比較NE0處理減小，這表明堿蓬內生菌能夠抑制土壤微生物群落結構由細菌型向真菌型轉變，維持土壤微生物群落結構的相對穩(wěn)定，為西瓜植株的生長創(chuàng)造相對適宜的根際環(huán)境。堿蓬內生菌侵染西瓜根系后維持了鹽脅迫條件下微生物群落結構的相對穩(wěn)定，其原因應該是植物內生菌可以在生態(tài)位上與土壤微生物進行競爭，通過產生有機酸、抗菌活性物質、降解酚類化感物質等影響微生物生長，進而調節(jié)微生物區(qū)系，如內生菌通過細胞壁降解酶幾丁質、-1，3-葡聚糖酶等降解真菌細胞壁以改變微生物區(qū)系，通過降解酚類等化感物質，解除其對土壤微生物和植物的毒害作用，為根系創(chuàng)造良好生長環(huán)境，進而增加植株根系分泌物的種類和數量，根系分泌物的增多又促進了微生物種類和數量的提高。

土壤酶是一種具有特殊催化能力的生物催化劑，其催化能力是無機催化劑的幾十倍乃至幾百倍，對土壤有機質的分解和土壤養(yǎng)分的轉化有極其重要的作用，與植物生長關系密切。脲酶在土壤中可促進尿素的分解，為植株生長提供氮素。磷酸酶能夠促進土壤有機磷的分解和轉化，為植物生長提供磷素。蔗糖酶是分解土壤碳水化合物的重要酶類，其活性高低常用于衡量土壤碳水化合物分解與轉化的速率，可為植物生長提供碳源。過氧化氫酶能夠防止過氧化氫對生物體的毒害，通過維持活性氧的平衡促進植株的健康生長。周德平等研究得出，土壤脲酶、過氧化氫酶、轉化酶和蛋白酶活性與鹽脅迫強度具有顯著的負相關關系，即鹽濃度越高酶的活性越低。本試驗結果表明，在單純高鹽脅迫NE0處理下，西瓜根際土壤酶活性均顯著低于對照，試驗結果與前人研究結論一致，說明高鹽脅迫產生的離子毒害能夠抑制土壤酶活性的提高。NE1、NE2處理下西瓜根際土壤脲酶活性雖然低于CK，但顯著高于NE0處理，說明堿蓬內生菌能夠提高西瓜根際土壤氮素循環(huán)，促使含氮化合物向有效態(tài)氮轉化，提高西瓜根系對氮素的利用率。NE1、NE2處理下西瓜根際土壤磷酸酶活性顯著高于NE0處理，說明堿蓬內生菌侵染西瓜后通過向外界分泌次生代謝物影響磷酸酶活性，促使土壤中難溶性磷向植物易吸收的速效磷轉化，提高土壤供磷水平。NE1、NE2處理下西瓜根際土壤蔗糖酶活性顯著高于NE0處理，說明堿蓬內生菌能夠通過提高蔗糖酶活性，加速土壤碳循環(huán)，為植物生長和微生物生命活動提供碳源。由此推斷，堿蓬內生菌JPE8-1對西瓜的促生作用，也可能與JPE8-1能夠改善西瓜根際土壤酶活性有關。試驗結果與王宏偉等的研究結論一致。

根系與土壤直接接觸，是最先感受到鹽分脅迫且對鹽脅迫反應又最為敏感的器官，在遭受鹽脅迫時根系滲透勢降低、根系對水分和礦質元素吸收能力下降、根系吸收面積減小，進而影響植株的生長發(fā)育。生長抑制是對鹽堿脅迫的直接響應，是評價植物耐鹽性強弱的重要指標。本試驗條件下，單純的NaCl高鹽脅迫NE0處理西瓜幼苗總根長、主根長、根尖數、根粗、根表面積和根總體積顯著低于對照，試驗結果與王素平等在黃瓜上的研究結果一致，這表明鹽脅迫不利于西瓜幼苗根系的正常生長發(fā)育，根系構型特征惡化。這是因為高鹽脅迫能夠降低根系細胞滲透勢，使細胞膜發(fā)生膜脂過氧化反映，破壞細胞膜結構，影響根系對礦質營養(yǎng)元素和水分的吸收，最終引起根系生長受到抑制。另外，鹽脅迫能夠提高葉綠素酶對葉綠素的降解速度，并使葉綠素的合成受阻，同時通過改變類囊體的膜結構來降低葉綠體對光能的捕獲的能力，致使光合能力減弱，光合產物合成減少，根系生長受到抑制。植物內生菌能夠分泌次生代謝產物，這些代謝產物不僅能夠顯著刺激宿主植物的生長發(fā)育，還能明顯提高宿主植物抵御生物和非生物逆境脅迫能力，增強植物抗逆性。本研究結果表明，與NE0相比，添加內生菌的NE1、NE2處理能夠顯著增加西瓜幼苗總根長、主根長、根尖數、根粗、根表面積和根總體積，且NE2處理更佳，試驗結果與付艷萍等在內生菌感染向日葵幼苗上的研究結論一致，這可能是因為內生菌能夠分泌生長素、細胞分裂素、赤霉素等植物生長所需的生長物質。生長素對植物細胞的伸長和生長有重要作用，細胞分裂素具有促進植物細胞分裂和生長尤其是根系細胞分裂和生長的作用，促進植株對外界營養(yǎng)物質的吸收利用。同時，內生菌分泌的胞外多糖可使土壤孔隙度等土壤結構發(fā)生改變，增強根系對土壤水分變化的適應能力，有利于根系的伸長生長。另外，內生菌侵染植株后有利于葉片光合色素含量的增加，光合能力增強、干物質積累的增加為根系生長提供了物質基礎。改良后NE2處理效果較NE1處理好，除與內生菌有關外，還應該與改良內生菌液中添加了植株生長所必須的N、K營養(yǎng)元素有關。

高鹽脅迫能夠擾亂植株體內的離子平衡，減少細胞K和Ca含量。本試驗條件下，單純鹽脅迫NE0處理K離子含量顯著低于對照，這可能是因為高鹽脅迫下被植株吸收的K離子通過韌皮部傳導至根部后被外滲出來，也可能是因為高濃度的Na抑制K的吸收。NE0處理西瓜幼苗地上部和地下部Ca含量均顯著低于對照，說明高鹽脅迫使西瓜幼苗遭受離子毒害，離子平衡被打破，其原因應該是Na與Ca的離子半徑相似，Na能夠取代質膜上的Ca，降低膜的選擇通透性，鹽離子的大量涌入打破機體原有的離子平衡。接種內生菌的鹽脅迫處理NE1、NE2的西瓜幼苗地下部和地上部K、Ca含量均高于NE0，說明內生菌能夠緩解鹽脅迫對根系吸收營養(yǎng)元素的抑制作用，使植株保持較高的滲透勢以適應外界的鹽脅迫環(huán)境。這應該是因為植物在遭受逆境脅迫時會刺激機體代謝產生乙烯，而乙烯對植株根系的生長發(fā)育有嚴重的抑制作用，進而影響根系對外界營養(yǎng)元素的吸收利用。內生菌在逆境條件下，可通過調控氨基環(huán)丙烷羧酸脫氨酶來抑制乙烯的合成，減少機體乙烯含量，降低非生物脅迫對植物生長的影響，提高根系對營養(yǎng)元素的吸收利用率，促進植株生長發(fā)育。另外，磷鉀肥施入土壤后往往以磷酸鹽和含鉀硅酸鹽的形式存在于土壤中，肥料利用率較低，而內生菌通過調節(jié)根系微環(huán)境pH值，分泌酸性磷酸酶礦化有機磷，溶解磷酸鹽，螯合礦質元素，參與離子交換，提高根系對P、K等營養(yǎng)元素的吸收利用率。在鹽脅迫條件下，鹽分離子與其他礦質元素間的交互作用可以影響植株的長勢狀況，鹽脅迫造成的離子代謝失衡是植株長勢減弱的重要原因之一。鹽脅迫下細胞內離子代謝失衡的一個重要參考指標是K/Na比值下降。在鹽脅迫條件下，耐鹽植株通過多種方式限制Na的吸收，保持較高的K濃度，保持較高的K/Na比值，降低離子毒害作用。另外，K與氣孔開閉有關，維持較高的K/Na比值是植株在鹽脅迫環(huán)境下保證氣孔正常功能和許多代謝正常進行的前提。本試驗條件下，NE1、NE2處理K/Na比值均顯著高于單純鹽脅迫NE0，說明西瓜幼苗接種堿蓬內生菌后能夠增強機體耐鹽水平，同時為西瓜后期品質的提高提供了物質基礎。