基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的玄參-麥冬藥對治療糖尿病作用機(jī)制研究

陳燦燦，黃柳倩，王晨曦

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第四臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 深圳 518033；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第五臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510405）

糖尿?。―iabetes Mellitus, DM）是一組由胰島素分泌異常所引起的，以慢性高血糖、口渴多飲、易饑多食為特征的代謝性疾病[1]。《中國2 型糖尿病防治指南2017 版》中指出，我國≥18 歲人群中2 型糖尿病發(fā)病率已達(dá)10.4%，其中男性11.1%，女性9.6%[2]。隨著我國經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展和居民生活水平的提升，我國DM 患病率呈爆發(fā)式增長，目前患病總?cè)藬?shù)居世界首位[3]。本病的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為其主要是由于胰島素抵抗和胰島素分泌不足引起的，現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)長期睡眠不足與生理時鐘紊亂也會對提高發(fā)病率產(chǎn)生一定影響[4]。祖國醫(yī)學(xué)現(xiàn)在多將DM 歸為“消渴”范疇，“消渴”之名首次記載于《素問·奇病論》。其屬本虛標(biāo)實(shí)證，與稟賦不足、飲食失節(jié)、情志失調(diào)、勞欲過度等因素有關(guān)。本病以陰虛為本, 燥熱為標(biāo)，兩者互為因果，而陰虧是發(fā)生DM的關(guān)鍵。

玄參、麥冬是一對消渴病常用藥對。玄參甘苦寒而質(zhì)潤，歸心、腎、肺、胃經(jīng)，具有清熱涼血、養(yǎng)陰生津的功用?！侗静菡x》中記載道：“玄參，稟至陰之性，專主熱病……直走血分而通血瘀。”現(xiàn)代研究表明玄參有效成分有抗糖尿病作用[5]，其有效成分能降低糖尿病大鼠血糖水平與肝腎的脂質(zhì)過氧化水平,增加抗氧化酶活性，同時降低糖尿病小鼠血糖、胰島素和甘油三酯的水平[6]。麥冬甘微苦寒，歸心、肺、胃經(jīng)，有養(yǎng)胃陰、生津液之效?，F(xiàn)代研究表明麥冬有效成分可改善微循環(huán)，對降低血糖有較好的促進(jìn)作用，同時具有增強(qiáng)免疫的作用[7]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可通過從系統(tǒng)層次和生物網(wǎng)絡(luò)的整體角度出發(fā)，解析藥物及治療對象、疾病之間的分子關(guān)聯(lián)規(guī)律，突破傳統(tǒng)理念，為中藥復(fù)方體系研究提供新思路[8]。本研究主要是運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)從整體角度闡釋玄參-麥冬藥對治療DM 的協(xié)同機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 玄參、麥冬成分及對應(yīng)靶點(diǎn)的收集

在BATMAN-TCM 數(shù)據(jù)庫(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/) 中, 分別以“麥冬”和“玄參”為關(guān)鍵詞, 設(shè)置“Score cutoff ≥20”和“P≤0.05”的標(biāo)準(zhǔn) ，構(gòu)建“藥物-靶點(diǎn)”的模型閾值, 并分別檢索篩選麥冬和玄參成分及符合標(biāo)準(zhǔn)的靶點(diǎn)。

1.2 DM 相關(guān)靶點(diǎn)的收集

通過Gene Card 數(shù)據(jù)庫(http://www.genecards.org/)、OMIM 數(shù) 據(jù) 庫(https://omim.org/) 檢 索DM 相關(guān)靶點(diǎn), 檢索詞為“diabetes”, 并進(jìn)行靶點(diǎn)匯總。利用VENY2.1 網(wǎng) 站（http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）篩選疾病與中藥的共同靶點(diǎn)，繪制Venn 圖。

1.3 玄參、麥冬活性成分及DM 相關(guān)靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

1.3.1 玄參、麥冬活性成分網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將玄參、麥冬的化合物和相關(guān)蛋白質(zhì)靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 軟件中，構(gòu)建玄參、麥冬的藥物- 活性成分- 作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，使化合物和靶點(diǎn)的關(guān)系可視化，并使用Network Analyzer 插件對此進(jìn)行拓?fù)浞治?，其中以degree 與betweenness centrality 為主要參量，得到主要活性成分和靶點(diǎn)。這些作用于數(shù)量較多蛋白靶點(diǎn)的活性分子，將會是接下來研究中密切關(guān)注的重點(diǎn)。

1.3.2 DM 相關(guān)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 采用在線Venn 圖選取玄參、麥冬活性成分作用靶點(diǎn)與DM 相關(guān)基因的交集，導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫(http://string-db.org/)，構(gòu)建DM 相關(guān)靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。同時得到交集蛋白之間的PPI 數(shù)據(jù)，導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 軟件，進(jìn)行可視化分析，構(gòu)建蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)。運(yùn)用插件MCODE 對 PPI 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行進(jìn)一步的分析，得到潛在的蛋白質(zhì)功能模塊。再次運(yùn)用Network Analyzer 插件進(jìn)行拓?fù)浞治?，得到核心蛋白靶點(diǎn)。

1.4 基因功能富集分析

根據(jù)上述結(jié)果， 采用ClusterProfiler 數(shù)據(jù)庫（https://yulab-smu.github.io/clusterProfiler-book/index.html）將玄參、麥冬治療DM 的靶點(diǎn)基因錄入，設(shè)置P＜0.05，進(jìn)行GO 生物學(xué)過程富集分析和KEGG 通路富集分析。

2 結(jié)果

2.1 玄參、麥冬藥對主要活性成分篩選

通過BATMAN-TCM 數(shù)據(jù)庫篩選得到玄參-麥冬藥對中的23 個活性成分，其中玄參的活性成分5 個，麥冬的活性成分18 個，見表1。

表1 玄參、麥冬化合物集合

2.2 玄參、麥冬治療DM 潛在靶點(diǎn)的預(yù)測

根據(jù)篩選標(biāo)準(zhǔn), 通過BATMAN-TCM 數(shù)據(jù)庫檢索中藥活性成分, 并利用該平臺獲得玄參、麥冬藥對的活性成分所對應(yīng)的靶點(diǎn)蛋白。在去除無效和重復(fù)的靶點(diǎn)后, 得到玄參、麥冬活性成分的靶點(diǎn)基因535個。通過GeneCard 數(shù)據(jù)庫平臺, 根據(jù)篩選標(biāo)準(zhǔn), 篩選出DM 的潛在靶點(diǎn)1141 個。繪制Venn 圖，得到疾病和中藥成分的共同基因靶點(diǎn)118 個, 如ACADM、AKT1、ALDH2、AVP、DNMT1、ESR1、NOS2、TPO、SLC25A13 等。

2.3 玄參、麥冬與DM 的交集基因

通過在線Venn 圖得出麥冬、玄參與DM 的共有基因118 個，玄參與DM 的共有基因76 個，麥冬與DM 的共有基因52 個。即說明玄參- 麥冬藥對與DM的相關(guān)潛在作用靶點(diǎn)共有118 個交集，其中玄參76個（占玄參預(yù)測總靶點(diǎn)的64.4%），麥冬52 個（占麥冬預(yù)測總靶點(diǎn)的44.1%）。見圖1。

圖1 玄參、麥冬與DM 相關(guān)靶點(diǎn)交集圖

2.4 網(wǎng)絡(luò)可視化

2.4.1 玄參、麥冬化合物- 靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò) 將上述數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 后，構(gòu)建化合物- 靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。在網(wǎng)絡(luò)中化合物由紅色節(jié)點(diǎn)（23 個）表示，靶點(diǎn)蛋白由藍(lán)色節(jié)點(diǎn)表示，一共有708 個節(jié)點(diǎn)，847 條邊，見圖2。以網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的度值和中介中心度等拓?fù)鋵W(xué)性質(zhì)為標(biāo)準(zhǔn)，篩選出核心節(jié)點(diǎn)，見表2。其中排名靠前的是L- 天冬酰胺（L-Asparagine）、對甲氧基肉桂酸（P- MAC）等。

圖2 玄參、麥冬成分靶點(diǎn)圖

表2 玄參、麥冬的靶點(diǎn)成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?/p>

2.4.2 玄參、麥冬PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析 利用STRING 構(gòu)建了玄參、麥冬靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，見圖3。并通過Cytoscape 3.7.2 打開，運(yùn)用MCODE 插件對網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，得到module，見圖4。對此PPI 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析，滿足標(biāo)準(zhǔn)的靶點(diǎn)蛋白即為核心靶點(diǎn)蛋白，見表3。排名靠前的是AKT1、LEP、NOS3、EDN1、IGF1。

表3 玄參、麥冬靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?/p>

圖3 玄參、麥冬-糖尿病靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)

圖4 玄參、麥冬-糖尿病靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)中的module

2.5 GO 功能富集分析

為了預(yù)測玄參、麥冬治療DM 的作用機(jī)制，對其進(jìn)行GO 生物過程富集分析。將105 個潛在靶點(diǎn)錄入ClusterProfiler 數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行生物學(xué)功能富集，系統(tǒng)地分析其生物過程，其中最顯著相關(guān)功能條目見圖5。玄參、麥冬主要參與的生物學(xué)過程包括脂質(zhì)代謝過程的調(diào)控（regulation of lipid metabolic process）、生物對營養(yǎng)元素的應(yīng)答過程（response to nutrient levels）、對肽激素的應(yīng)答（response to peptide hormone）、小分子代謝進(jìn)程（ regulation of small molecule metabolic process）、神經(jīng)遞質(zhì)的生物合成過程（neurotransmitter biosynthetic process），見圖5（A）。

2.6 KEGG 通路富集分析

將上述靶點(diǎn)錄入ClusterProfiler 數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行KEGG 通路富集分析。其中參與的主要通路有，脂肪因子信號通路（Adipocytokine signaling pathway）、2 型糖尿?。═ype II diabetes mellitus）、胰島素信號 通 路（Insulin signaling pathway）、 鈣 信 號 通 路（Calcium signaling pathway）、 癌 癥 通 路（Pathways in cancer）、丙酮酸代謝（Pyruvate metabolism）、肥厚型心肌?。℉ypertrophic cardiomyopathy , HCM）、ErbB 信號通路（ErbB signaling pathway）、1 型糖尿?。═ype I diabetes mellitus）、MAPK 信號通路（MAPK signaling pathway）等，見表4、圖5（D）。分析反映了玄參、麥冬可能通過這些信號通路發(fā)揮治療作用。

表4 玄參、麥冬潛在靶點(diǎn)和信號通路信息

圖5 玄參、麥冬治療DM 靶點(diǎn)GO 富集分析及KEGG 富集分析通路

3 討論

玄參-麥冬藥對源于《辨證錄》中的玄冬湯和《醫(yī)學(xué)集成》中的玄麥飲[9]。玄參-麥冬均甘寒，兩者相配伍使其養(yǎng)陰生津、清熱潤燥的功效倍增，與糖尿病陰津虧損、燥熱偏勝的病機(jī)相應(yīng)?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示，玄參中含有環(huán)烯醚萜、苯丙素苷、有機(jī)酸、萜類、苯酚、甾醇、黃酮、糖類等化學(xué)成分，具有抗炎、調(diào)節(jié)免疫、保護(hù)神經(jīng)元等藥理作用[10]。麥冬的化學(xué)成分主要包括甾體皂苷類、高異黃酮類、多糖類等有效成分，具有降血糖、增強(qiáng)免疫力等藥理作用[7]。玄參-麥冬藥對常出現(xiàn)在名老中醫(yī)經(jīng)驗(yàn)用藥治療糖尿病中，如施今墨老先生認(rèn)為玄參偏入腎以滋養(yǎng)腎陰，壯水制火，清熱解毒 ；麥冬偏入肺以益胃生津，除煩止渴。玄參與麥冬相配伍，可達(dá)到金水相生，養(yǎng)陰生津，潤燥止渴的效果。玄參配麥冬可治療病機(jī)屬肺胃陰虛之證（治以養(yǎng)陰增液為法），施先生常將其用于津少口干、口渴多飲、舌紅少苔等證[11]。趙洪偉[12]的研究顯示，玄參中的玄參多糖具有良好的降血糖作用，且劑量越大，降血糖效果越好，除此之外，玄參多糖對糖代謝、脂代謝以及抗氧化能力也有一定的調(diào)節(jié)作用。張寧[13]的研究表明，玄參及其組分可通過多途徑保護(hù)胰島β 細(xì)胞，改善糖、脂代謝；其中，降血糖的物質(zhì)基礎(chǔ)可能是苯丙素酸苷、環(huán)烯醚萜等組分。施吉祥[14]研究發(fā)現(xiàn)，麥冬多囊脂質(zhì)體能夠有效減輕2 型糖尿病小鼠的胰島素抵抗癥狀，降低其口服糖耐量，且效果優(yōu)于麥冬多糖。吳萬征[15]研究發(fā)現(xiàn)，麥冬寡糖可顯著降低自發(fā)性2 型糖尿病db/db 小鼠的空腹血糖水平、24 小時蛋白尿量、血清尿素氮和血清肌酐濃度，對小鼠的糖代謝和腎損傷有著正面效應(yīng)。

本論文欲通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究玄參、麥冬多成分、多靶點(diǎn)、多通路治療糖尿病的作用機(jī)制。通過以上信息搜集、數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析，本研究共收集到治療糖尿病的活性成分118 個，與2 型糖尿病有共同作用靶點(diǎn)的活性成分共10 個，其中L- 天冬酰胺（L-Asparagine）、對甲氧基肉桂酸（P- MAC）是核心結(jié)點(diǎn)化合物，可推知是玄參、麥冬治療糖尿病的重要活性成分。研究表明，天冬酰胺受到ASPG 基因中遺傳變異的強(qiáng)烈影響[16]。該基因編碼天冬酰胺酶，該酶可將天冬酰胺轉(zhuǎn)化為天冬氨酸。天冬酰胺酶是一種白血病藥物，可降低血漿天冬酰胺的水平。天冬酰胺酶的不良反應(yīng)包括高血糖癥和葡萄糖耐量降低[17]。因此，無論是通過ASPG 基因的正常遺傳變異還是通過添加天冬酰胺酶來增加天冬酰胺向天冬氨酸的轉(zhuǎn)化，都可能導(dǎo)致循環(huán)天冬酰胺水平的降低和高血糖癥的發(fā)生。這表明，低血漿天冬酰胺水平與糖尿病前期之間存在潛在的因果關(guān)系。但Filip Ottosson 發(fā)現(xiàn)天冬酰胺水平與空腹血糖之間沒有關(guān)聯(lián)，這意味著其與DM 的關(guān)聯(lián)可能是由葡萄糖耐量降低或其他機(jī)制驅(qū)動的[18]。P-MCA 可通過增加胰島素分泌、糖酵解，以及減少糖原異生來發(fā)揮降血糖作用[19]。

本研究中利用繪制Venn 圖，得到疾病與中藥活性成分的共同基因靶點(diǎn)118 個，并通過繪制PPI 靶點(diǎn)圖得到10 個核心靶點(diǎn)，分別是AKT1、IGF1、NOS3、TNF、LEP、JUN、EDN1、NOS2、IL1B、PTGS2，提示玄參- 麥冬藥對主要通過作用于這些靶點(diǎn)治療2 型糖尿病。Akt 可被稱為蛋白激酶B 或PKB，Akt1 ( 或稱為PKBα) 是其中一種亞型。相比于Akt 的其他亞型，Akt1 是在肝細(xì)胞中可檢測到的主要的胰島素激活的PKB 亞型[20]?，F(xiàn)代研究表明，Akt1 的解除調(diào)控與糖尿病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)[21-22]。Akt 可通過刺激GLUT4葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體轉(zhuǎn)運(yùn)到質(zhì)膜來調(diào)控葡萄糖進(jìn)入肌肉和脂肪細(xì)胞，并通過抑制磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶和葡萄糖6- 磷酸酶這兩種關(guān)鍵酶的表達(dá)，在胰島素抑制肝臟糖異生過程中發(fā)揮作用[23]。IGF1 是胰島素樣生長因子1，是一個由人類基因IGF1 編碼的蛋白質(zhì)。IGF-1 的動力學(xué)數(shù)據(jù)表明，大多數(shù)循環(huán)IGF-1 由肝細(xì)胞產(chǎn)生，主要存在于人類脂肪細(xì)胞中，和胰島素具有共同的進(jìn)化起源和分子相似性[24]。研究者得出結(jié)論，IGF-1 具有與胰島素類似的代謝作用。當(dāng)使用啟動(20罐/kg bolus)，恒定(24 /tg/kg / h) 滴注IGF-1 并保持正常血糖時，IGF-1 的作用類似于外源性胰島素，即通過降低c 肽水平，抑制肝臟葡萄糖生成，刺激外周葡萄糖攝取，并抑制脂肪分解和蛋白質(zhì)分解代謝[25]。通過KEGG 通路富集分析可以得知脂肪因子信號通路、胰島素信號通路、MAPK 信號通路等通路可能是改善DM 的作用機(jī)制。有研究表明，來自脂肪組織的細(xì)胞因子對胰島素抵抗的發(fā)生有重要作用[26]。在生理狀態(tài)下，脂肪因子通過內(nèi)分泌、旁分泌等途徑來影響胰島素的生物學(xué)效應(yīng)，改善胰島素抵抗，而在病理狀態(tài)下，如肥胖、代謝綜合征等，則會導(dǎo)致脂肪因子的分泌和功能失調(diào)，進(jìn)而加重糖代謝異常、脂代謝異常和胰島素抵抗等。瘦素是一種肽類激素，是由脂肪細(xì)胞分泌的，在肥胖人群里會產(chǎn)生瘦素抵抗現(xiàn)象，出現(xiàn)瘦素對胰島素的抑制作用減弱，正常的脂肪- 胰島素反饋機(jī)制被破壞，胰島素大量分泌出現(xiàn)高胰島素血癥[27]。近年來，有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)一種新型脂肪因子胰島素快速誘導(dǎo)基因（INSIG）蛋白，其可以改善胰島素抵抗以及胰島β 細(xì)胞功能。Carobbio[28]研究指出，通過對體內(nèi)外小鼠脂肪細(xì)胞調(diào)節(jié)INSIG 編碼蛋白表達(dá)，可以明顯改善與胰島素抵抗相關(guān)的脂代謝紊亂，進(jìn)而改善胰島素抵抗。Chen 等[29]報道，通過調(diào)節(jié)INSIG-1/SREBP-1c 途徑，可增加抗氧化物質(zhì)活性，進(jìn)而保護(hù)胰島β 細(xì)胞免受糖毒性損傷，從而改善胰島β 細(xì)胞功能[30]。當(dāng)胰島素與胰島素受體結(jié)合時，胰島素信號通路中的蘇氨酸蛋白酶（AKT）被磷酸化的磷酸肌醇3- 激酶（PI3K）激活后，活化的AKT抑制下游分子磷酸肌醇3- 激酶（PI3K）活性，可抑制糖原合成酶磷酸化和糖原合成，進(jìn)而升高血糖。正常的胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可以促進(jìn)糖原的合成和葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)，達(dá)到降血糖的目的。MAPK 信號通路與糖尿病患者的高血糖、氧化應(yīng)激、生長因子等有關(guān)。糖尿病狀態(tài)下的高糖蛋白激酶C (PKC) 通路、糖基化終產(chǎn)物、氧化應(yīng)激、生長因子等都可激活MAPK 家族 , 使轉(zhuǎn)錄因子活性升高 , 參與糖尿病慢性并發(fā)癥的發(fā)生。阻斷MAPK 通路將可能成為治療糖尿病并發(fā)癥的新思路,而MAPK 將可能成為治療糖尿病并發(fā)癥的新靶點(diǎn)[31]。綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法對玄參、麥冬治療糖尿病的作用機(jī)制進(jìn)行研究，結(jié)果表明，玄參、麥冬的核心活性成分L-天冬酰胺、對甲氧基肉桂酸中的核心靶點(diǎn)AKT1、IGF1 等可通過脂肪因子信號通路、胰島素信號通路、MAPK 信號通路等通路發(fā)揮治療糖尿病的作用，體現(xiàn)了多通路、多靶點(diǎn)聯(lián)合作用的特點(diǎn)。這為臨床使用玄參、麥冬治療糖尿病提供了科學(xué)依據(jù)。