西藏五個鹽湖浮游生物組成與微生物多樣性

楊 歡，高美榮，韓學(xué)凱，段 虎，王振乾，隋麗英

(亞洲區(qū)域鹵蟲參考中心，天津科技大學(xué)海洋與環(huán)境學(xué)院，天津 300457)

西藏蘊藏著豐富的鹽湖資源.西藏鹽湖多為碳酸鹽型或硫酸鹽型鹽湖，主要分布在平均海拔為 4000～4500m 西藏北部的那曲市和阿里地區(qū)[1].該地區(qū)的主要氣候特征為輻射強、日照短、氣溫低、降水少和氣壓低等.20世紀(jì) 60年代，我國科技工作者開始進行西藏鹽湖生態(tài)和生物資源的調(diào)查研究[2-4].雖然大多數(shù)西藏鹽湖為寡營養(yǎng)狀態(tài)，但仍從中發(fā)現(xiàn)了具有經(jīng)濟價值的浮游動植物，包括螺旋藻(Spirulina sp.)、杜氏鹽藻(Dunaliella sp.)、褶皺臂尾輪蟲(Brachionus plicatilis)、蘿卜螺(Radix sp.)、西藏擬蚤(Daphniopsis tibetana)和鹵蟲(Artemia sp.)等[5-7].西藏鹽湖鹵蟲資源已被成功地進行了商業(yè)化開發(fā)，帶來可觀的經(jīng)濟效益.研究人員對鹵蟲的分類[8]、種群分布[6,9-10]、種質(zhì)特征[11-12]及其在海洋魚類[13]和凡納濱對蝦[14]等經(jīng)濟水產(chǎn)動物養(yǎng)殖中的應(yīng)用進行研究.隨著培養(yǎng)方法的改進和分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們對西藏鹽湖微生物的多樣性、豐度及其與環(huán)境因素之間的關(guān)系有了更多的認(rèn)識[15].研究人員通過構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹發(fā)現(xiàn)了一些新的原核生物分支[16].雖然西藏鹽湖生物資源研究取得了一些進展，但由于藏北地區(qū)氣候惡劣、交通不便，許多鹽湖的生物資源情況仍不清楚.

本研究對我國西藏的那曲市和阿里地區(qū)的30個湖泊進行調(diào)查.采集了當(dāng)穹錯、班戈錯、洞錯、聶爾錯和鹽湖鄉(xiāng)5個鹽湖的水體和底泥樣品，進行了湖水離子組成分析、浮游生物種群組成(特別是鹵蟲)檢測、底泥微生物多樣性分析以及細(xì)菌的分離鑒定，旨在分析鹽湖的微生物多樣性及浮游生物組成，為西藏鹽湖資源的開發(fā)利用奠定理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 鹽湖信息

2019年9 月和2020年7月，對我國西藏北環(huán)沿線 30個湖泊進行了調(diào)查(圖1).鹽湖的水體鹽度和地理信息見表1.對其中鹽度超過40的5個鹽湖(當(dāng)穹錯、班戈錯、洞錯、聶爾錯和鹽湖鄉(xiāng))進行了浮游生物組成和微生物多樣性分析.

圖1 西藏鹽湖生物資源考察路線圖Fig.1 Route map for investigation of biological resources in Tibet salt lakes

表1 鹽湖的水體鹽度和地理信息Tab.1 Water salinity and geographic information of salt lakes

1.2 水樣理化參數(shù)分析

用溫度計和鹽度計(日本 ATAGO公司)現(xiàn)場測定水體的溫度和鹽度.將水樣帶回實驗室，用 pH計(美國Mettler Toledo公司)測定pH.5個鹽湖水樣的主要離子組成參照文獻[17]的方法進行測定：重量法測定和 K+，酸堿滴定法測定，絡(luò)合滴定法測定 Cl-、Mg2+和 Ca2+，電感耦合法測定 Na+.

1.3 浮游生物組成及鹵蟲種群分析

使用 25#浮游植物網(wǎng)和 13#浮游動物網(wǎng)(北京普瑞特儀器有限公司)過濾收集5個鹽湖的浮游植物和浮游動物，并將樣品放置在密封塑料瓶中，加入 37%甲醛溶液進行固定.在DM500型顯微鏡(德國Leica公司)和 SZ2-ILST型體視顯微鏡(日本 Olympus公司)下觀察樣品中的浮游生物，參考分類學(xué)專著對浮游動植物種類進行鑒定[18-20].

采用浮游生物網(wǎng)(孔徑150μm)過濾20L湖水收集鹵蟲，每個鹽湖設(shè)定 5個采樣點共 100L水體(以鹽湖中心為第1個取樣點，分別向四周延伸50m設(shè)定其他 4個取樣點).將鹵蟲樣品置于塑料瓶中，添加甲醛溶液進行固定.根據(jù)發(fā)育階段，將鹵蟲分為無節(jié)幼體、后無節(jié)幼體、幼蟲和成蟲 4個類群.在體視顯微鏡下觀察并統(tǒng)計不同發(fā)育階段的鹵蟲、雌性和雄性成蟲的數(shù)量，計算鹵蟲種群密度、雌性/雄性比例、無節(jié)幼體/后無節(jié)幼體/幼蟲/成蟲的比例.種群密度為每立方米水體中鹵蟲個體的總數(shù).

1.4 鹽湖底泥微生物多樣性分析

使用天根生化(北京)科技公司的TIANamp細(xì)菌基因組 DNA提取試劑盒提取 5個鹽湖底泥樣品的基因組 DNA，送至北京諾禾致源科技股份有限公司進行高通量測序.使用通用細(xì)菌引物 515F/806R擴增16SrDNA基因的V4片段.PCR反應(yīng)條件：98℃預(yù)變性1min；98℃變性10s，50℃退火30s，72℃延伸 30s，30個循環(huán)；72℃延伸 5min終止反應(yīng).用純化試劑盒(德國 Qiagen公司)對 PCR產(chǎn)物進行純化.使用 TruSeq?DNA PCR-Free試劑盒(美國 Illumina公司)制備文庫.采用 Qubit@2.0型熒光儀(美國Thermo Scientific公司)和 Agilent Bioanalyzer 2100系統(tǒng)評估文庫質(zhì)量，在Illumina NovaSeq平臺上進行測序，輸出 250bp片段的信息.利用 UPARSE軟件進行序列分析，將相似性≥97%的序列歸為相同的操作分類單元(OTUs)，對每個 OTUs的代表性序列進行篩選，以便進一步注釋.根據(jù) OTUs計算香農(nóng)-維納多樣性指數(shù)(H)和辛普森多樣性指數(shù)(D)，以評估各樣本的微生物多樣性.通過物種的相對豐度和典型關(guān)聯(lián)分析(CCA)，比較不同鹽湖中的微生物群落組成.

1.5 鹽湖底泥微生物的分離鑒定

根據(jù)鹽湖水樣的鹽度和主要離子組成配制培養(yǎng)基，并添加 10g/L酵母提取物和 7.5g/L酸水解酪蛋白作為營養(yǎng)物質(zhì).取5g底泥，加入100mL新鮮培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)1d，之后將3mL上清液轉(zhuǎn)入新鮮培養(yǎng)基，28℃富集培養(yǎng) 3～4d.將富集后的菌液分別稀釋10-5、10-6和 10-7后涂布到固體培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)7d.挑取不同形態(tài)、顏色、大小的單菌落，轉(zhuǎn)入新鮮的液體培養(yǎng)基，并通過劃線法純化菌株.使用華大基因合成的通用引物(27F：5′-AGAGTTTGATCCTGG CTCAG-3′；1492R ：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)擴增分離菌株的 16SrDNA 序列并測序.測序結(jié)果在美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫進行比對分析，選取相似性≥99%的比對結(jié)果作為菌種鑒定依據(jù).

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽湖水樣的主要離子組成

當(dāng)穹錯、班戈錯、洞錯、聶爾錯和鹽湖鄉(xiāng)水樣鹽度均超過40，pH為7.66～9.38，均為堿性鹽湖.根據(jù)離子組成分析結(jié)果和鹽湖分類標(biāo)準(zhǔn)[21]，確定當(dāng)穹錯、班戈錯為碳酸鹽型鹽湖，洞錯、聶爾錯和鹽湖鄉(xiāng)為硫酸鹽型鹽湖(表2).

表2 鹽湖的鹽度、溫度、pH和離子組成Tab.2 Salinity，temperature，pH and ion composition of the salt lakes

2.2 鹽湖水樣的浮游植物組成

5個鹽湖浮游植物樣品中共發(fā)現(xiàn) 5門 36屬 53種浮游植物(包含未定種)，其中硅藻門11屬25種，綠藻門14屬15種，藍(lán)藻門9屬11種，黃藻門1種，裸藻門1種(表3).

表3 鹽湖中的浮游植物種類Tab.3 Phytoplankton species in the salt lakes

2.3 鹽湖水樣的浮游動物組成

在5個鹽湖水樣中均發(fā)現(xiàn)了鹵蟲卵或鹵蟲幼體，在洞錯鹽湖水樣中發(fā)現(xiàn)了 3種輪蟲為褶皺臂尾輪蟲(Branchionus plicatilis)、壺狀臂尾輪蟲(B.urceolaris)、小種輪蟲(B.rotundiformis)，以及 2種橈足類為新月北鏢水蚤(Arctodiaptomus stewartianus)和鋸齒棘猛水蚤(Attheyella dentata).對班戈錯、聶爾錯和當(dāng)穹錯 3個鹽湖的鹵蟲成蟲性別比例、種群密度和組成進行了統(tǒng)計分析.結(jié)果表明，成蟲雌性/雄性的比例為1.0∶1～1.9∶1，其中當(dāng)穹錯雌性占比最高.班戈錯鹵蟲種群密度為 6×104m-3，遠(yuǎn)高于其他鹽湖.各鹽湖無節(jié)幼體/后無節(jié)幼體/幼蟲/成蟲的比例也有差異，其中聶爾錯以成蟲為主(表4).

表4 鹵蟲的性別比、種群密度和種群組成Tab.4 Sex ratio，population density and population composition of Artemia

2.4 鹽湖底泥的微生物多樣性

香農(nóng)-維納多樣性指數(shù)表示樣品中的分類總數(shù)及其占比，辛普森多樣性指數(shù)表征群落內(nèi)物種分布的多樣性和均勻度.洞錯鹽湖底泥的這兩個指數(shù)均高于其他 4個鹽湖，表明其微生物多樣性最豐富.除了班戈錯外，其余鹽湖底泥的微生物多樣性與水體鹽度有關(guān)，鹽度越高微生物多樣性越低(表5).

表5 鹽湖底泥的微生物多樣性分析Tab.5 Analysis of microbial diversity of salt lake sediments

CCA分析表明，影響洞錯鹽湖底泥微生物多樣性的主要因素是 pH和鹽度，而當(dāng)穹錯和班戈錯鹽湖底泥的微生物多樣性主要與鹽湖中和濃度有關(guān)(圖2).

圖2 鹽湖底泥微生物多樣性與 、、pH、鹽度的典型關(guān)聯(lián)分析Fig.2 Canonical correlation analysis of sediment microorganisms correlated with and content，pH and salinity

根據(jù)OTUs聚類分析，獲得了鹽湖底泥微生物中相對豐度較高的 10個屬，其中：當(dāng)穹錯鹽湖底泥微生物的優(yōu)勢屬為堿擾菌屬(Alkaliflexus)，所占比例為33%；鹽湖鄉(xiāng)鹽湖底泥微生物的優(yōu)勢屬為Salipaludibacillus，所占比例為 12.0%；班戈錯鹽湖底泥微生物的優(yōu)勢屬為鹽單胞菌屬(Halomonas)，所占比例為 9.0%；聶爾錯鹽湖底泥微生物的優(yōu)勢屬為粉色海生菌屬(Roseimarinus)，所占比例為 8.1%；洞錯鹽湖底泥微生物的優(yōu)勢屬為 Izimaplasma，所占比例為 2.3%(表6).

表6 鹽湖底泥微生物中相對豐度較高的10個屬Tab.6 Top 10 bacterial genus of relative abundance in salt lake sediments

2.5 鹽湖底泥微生物的分離鑒定

篩選菌落形態(tài)、顏色、大小不同的 28株菌，進行16SrDNA分子鑒定.比對結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其中27株鑒定到屬(表7).在門水平上，大部分菌株屬于變形菌門(Proteobacteria，20株，71.43%)，其次是厚壁菌門(Firmicutes，5株，17.86%)和放線菌門(Actinobacteria，2株，7.14%).在屬水平上，大部分菌株屬于鹽單胞菌屬(Halomonas，13株，46.43%)，其次是鹽弧菌屬(Salinivibrio，3株，10.71%)、嗜鹽嗜堿菌屬(Alkalibacterium，2 株，7.14%)、芽孢桿菌屬(Bacillus，2 株，7.14%)和海源桿菌屬(Idiomarina，2株，7.14%).

表7 鹽湖底泥中分離的微生物Tab.7 Microorganisms isolated from salt lake sediments

續(xù)表

3 討 論

研究位于我國西藏那曲市和阿里地區(qū) 5個鹽湖的浮游生物發(fā)現(xiàn)，鹽度是影響高鹽環(huán)境中生物多樣性和豐度的主要參數(shù).隨著水體鹽度的增加，生物多樣性逐漸減少，但耐鹽生物的種群密度則會逐漸提高[22].本研究在鹽度范圍 40～110的 5個鹽湖水樣中，共鑒定到 5門 36屬 53種浮游植物(包含未定種)，其中硅藻門、藍(lán)藻門和綠藻門的種類較多.在這些鹽湖中還發(fā)現(xiàn)了以浮游植物為食的小型甲殼浮游動物鹵蟲，在低鹽度鹽湖(洞錯)中除鹵蟲外，還存在耐鹽的輪蟲、水蚤和橈足類等，而在中、高鹽度鹽湖水樣中沒有發(fā)現(xiàn)其他浮游動物.研究人員[23-26]對西藏地區(qū)鹽湖浮游植物種類的研究發(fā)現(xiàn)，硅藻門占比最高，這與本研究結(jié)果一致(見表8).

表8 與調(diào)查區(qū)域相近的鹽湖浮游生物和微生物研究Tab.8 Research on plankton and microorganism in salt lake similar to the surveyed zone

硅藻門在西藏鹽湖中廣泛分布且具有較高的多樣性.究其原因，西藏鹽湖平均水溫較低，而硅藻對低溫的耐受力較強，在水溫較低的情況下易成為優(yōu)勢種.崇璘璇等[24]對西藏多格錯仁鹽湖(鹽度 135～140)的浮游植物群落結(jié)構(gòu)進行了分析，在 58個站點中共發(fā)現(xiàn)了310種浮游植物，但在靠近中心的站點種類較為單一，如 N38表層水體中僅發(fā)現(xiàn)了 13種硅藻.相較而言，本研究中的浮游植物種類更為豐富.霍元子等[27]對內(nèi)蒙古錫林郭勒盟的鹽湖浮游生物的群落特征進行研究，共檢出59種浮游植物和34種浮游動物.與之相比，西藏鹽湖浮游生物多樣性較低，且兩者的優(yōu)勢藻存在差異，這可能與西藏所處的特殊高原環(huán)境有關(guān).

目前，鹵蟲是西藏鹽湖中唯一商業(yè)化的生物資源，可用于觀賞魚、海水魚蝦等經(jīng)濟水產(chǎn)動物的養(yǎng)殖[13-14].2020年西藏鹽湖(其香錯和拉果錯)的鹵蟲卵總產(chǎn)量超過 600噸，占中國總產(chǎn)量的 1/3.20世紀(jì)90年代初，研究人員從西藏拉果錯鹽湖收集了鹵蟲并進行分類研究，將其定為西藏鹵蟲(A.tibetiana)[8].本研究統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)鹵蟲成蟲雌性/雄性的比例為 1.0∶1～1.9∶1，表明這些鹽湖存在兩性鹵蟲.不同年份之間鹽湖鹵蟲的種群密度和鹵蟲卵產(chǎn)量存在較大差異，推測其主要影響因素為氣候和生態(tài)環(huán)境.7月份班戈錯的鹵蟲種群密度為 6.6×104m-3，遠(yuǎn)高于聶爾錯(2.3×103m-3)和當(dāng)穹錯(2.1×103m-3).在相同季節(jié)，渤海灣鹽場鹵水處于富營養(yǎng)狀態(tài)，鹵蟲的種群密度為 2×104～7×104m-3[30].由此可見，班戈錯的鹵蟲種群密度與渤海灣鹽場相近.然而西藏年平均氣溫較低[1]，導(dǎo)致鹵蟲生長和傳代緩慢.

西藏鹽湖蘊藏了豐富的微生物資源，其中大部分為耐鹽或嗜鹽微生物[6,10].CCA分析表明，5個鹽湖底泥的微生物多樣性與陰離子濃度、pH和水體鹽度有關(guān).其中濃度和 pH是影響微生物組成的主要因素，其次是鹽度和濃度.同處于青藏高原的小柴旦鹽湖屬于硫酸鹽型鹽湖，與聶爾錯鹽湖類似，但其總鹽度(108.82～113.84)高于聶爾錯鹽湖的總鹽度，接近于當(dāng)穹錯鹽湖的總鹽度.當(dāng)穹錯和聶爾錯鹽湖底泥微生物的優(yōu)勢屬分別為 Alkaliflexus(33%)和Roseimarinus (8.1%)，但在小柴旦鹽湖水樣和底泥混合樣品中芽孢桿菌屬(Bacillus)為優(yōu)勢屬，約占21.53%[28].此外，新疆艾比湖(鹽度約為 112.4)也屬于硫酸鹽型鹽湖，其優(yōu)勢屬為 Halofilum[31].這表明除了鹽度外，湖泊的化學(xué)組成也會影響微生物多樣性.由于鹽湖和鹽場的氣候和生態(tài)特征不同，分離獲得的菌株也存在較大差異.黃建蓉[31]從青藏高原北部6個不同鹽度湖泊中分離獲得了4門90屬210種微生物.上述研究中分離得到的微生物除Halomonas和 Bacillus外，其余均與本研究不同.這可能與湖水的離子組成及所處環(huán)境有關(guān).本研究從鹽度為 40～110的5個鹽湖中分離出13個具有不同形態(tài)特征的Halomonas菌株，表明 Halomonas耐鹽范圍較廣.不僅如此，Halomonas在新疆達(dá)坂鹽湖、羅布泊鹽湖和四川大古鹽井中均有分布，且均為優(yōu)勢菌群[32].Halomonas富含多種生物活性物質(zhì)，如聚羥基脂肪酸、四氫嘧啶和羥基四氫嘧啶、堿性酶等，這些活性物質(zhì)在化妝品、生物醫(yī)藥和水產(chǎn)養(yǎng)殖等領(lǐng)域中具有廣闊的應(yīng)用前景[33-34].因此，Halomonas作為天然代謝產(chǎn)物的物質(zhì)基礎(chǔ)，具有較高的研究價值和開發(fā)利用價值.此外，本課題組發(fā)現(xiàn)通過高通量測序得到的微生物種類明顯多于分離獲得的菌株，而菌株的分離培養(yǎng)是對其進行深入研究的基礎(chǔ)，因而高效分離培養(yǎng)基的設(shè)計和培養(yǎng)方法的改進仍是未來研究的重要方向.

4 結(jié) 語

本研究對我國西藏北部那曲市和阿里地區(qū)的 5個鹽湖進行了湖水離子組成分析、浮游生物檢測、底泥微生物多樣性分析以及分離篩選，發(fā)現(xiàn)西藏鹽湖中的主要浮游動物為鹵蟲，且多為兩性鹵蟲，其種群密度和鹵蟲卵產(chǎn)量受氣候和環(huán)境影響較大.不同鹽湖細(xì)菌的優(yōu)勢屬種類均不相同，有其獨特的菌群結(jié)構(gòu).鹽湖底泥微生物多樣性與鹽度成反比，但在高鹽鹽湖中優(yōu)勢菌群的占比更高.除了鹽度外，鹽湖的化學(xué)組成也會影響微生物群落結(jié)構(gòu).本研究結(jié)果為西藏鹽湖生物資源的開發(fā)利用奠定了理論基礎(chǔ).

致謝：本項目得到中國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁業(yè)漁政管理局援藏項目的支持.感謝天津科技大學(xué)張翠霞老師在樣本浮游動植物分析方面的支持，以及郭亞飛、李瓏和王士強老師在水樣離子組成分析中給予的幫助.