濾過型凈化柱凈化-超高效液相色譜-三重四極桿/復(fù)合線性離子阱質(zhì)譜法測定草魚中11 種農(nóng)藥殘留

封騰望, 王新新, 周銳東, 劉 歡, 孫慧武, 李晉成*,

(1. 上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306；2. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院，北京 100141；3. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品質(zhì)量安全控制重點實驗室，北京 100141)

農(nóng)藥殘留可在水產(chǎn)養(yǎng)殖的水產(chǎn)品中富集并通過食物鏈在人體內(nèi)蓄積[1]，其安全問題引起關(guān)注。為了保證水產(chǎn)品質(zhì)量安全，我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部等10 部委于2019 年印發(fā)《關(guān)于加快推進水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)綠色發(fā)展的若干意見》[2]，大力推進水產(chǎn)養(yǎng)殖綠色發(fā)展，防控水域污染。因此，探索并建立水產(chǎn)品中農(nóng)藥多殘留定量檢測方法已經(jīng)成為研究熱點。

2020 年，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部制定了《水產(chǎn)養(yǎng)殖用藥明白紙》[3]，明確將克百威等農(nóng)藥列入了水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中禁止使用藥物清單；另外，有機磷類農(nóng)藥[4]和三嗪類除草劑[5]同樣會在水產(chǎn)品中蓄積并產(chǎn)生危害。目前，以克百威為代表的氨基甲酸酯類農(nóng)藥[6-14]、以樂果和滅線磷為代表的有機磷農(nóng)藥[7-11,14,15]以及三嗪類除草劑[7]在水產(chǎn)品中的殘留檢測分析已有相關(guān)研究報道，但3 種不同類型農(nóng)藥同時檢測技術(shù)鮮有報道。本研究選取以克百威為代表的8 種氨基甲酸酯類農(nóng)藥、以樂果和滅線磷為代表的2 種有機磷農(nóng)藥以及以撲草凈為代表的三嗪類除草劑作為研究對象，以期建立草魚中3 種不同類型農(nóng)藥殘留的檢測方法。

目前，水產(chǎn)品中農(nóng)藥多殘留的檢測方法主要有氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[16-18]和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[6,8,19]。雖然水產(chǎn)品中農(nóng)藥多殘留的分析方法取得一定進展，但由于水產(chǎn)品基質(zhì)中干擾物質(zhì)含量高，導(dǎo)致樣品前處理過程復(fù)雜。目前，針對水產(chǎn)品中農(nóng)藥的樣品前處理方法有固相萃取[20-21]、QuEChERS 方法[8,22-24]等。濾過型凈化柱(multi-plug filtration clean-up, m-PFC)由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)潘燦平[25]課題組開發(fā)，與傳統(tǒng)樣品前處理方法相比，m-PFC 無需活化、淋洗等操作，僅需一步即可實現(xiàn)提取液的快速凈化，具有操作簡單、處理速度快的優(yōu)點。該技術(shù)已經(jīng)在水產(chǎn)品中孔雀石綠、結(jié)晶紫殘留檢測中成功應(yīng)用[26]。然而，m-PFC 在使用過程中需要拔掉活塞才能往柱管中加入待凈化液。本課題組基于m-PFC 提出了推桿式濾過型凈化柱 (CAFS clean-up column)，該凈化柱在柱管上部側(cè)壁設(shè)置上樣口，僅需將活塞拉至上樣口上方即可加入待凈化液，并將其結(jié)合超高效液相色譜-三重四極桿/復(fù)合線性離子阱質(zhì)譜 (UPLCQTRAP-MS/MS) 構(gòu)建了魚肉中三卡因、丁卡因和布比卡因殘留量的快速檢測方法[27]?；诒菊n題組自行研制的快速自動化凈化儀[28]，實現(xiàn)批量自動凈化，大大提高了檢測效率。

本研究基于QuEChERS 方法，使用CAFS clean-up column，結(jié)合UPLC-QTRAP-MS/MS 建立了草魚中11 種農(nóng)藥 (結(jié)構(gòu)式見圖式1) 殘留的快速分析方法，旨在為水產(chǎn)品中農(nóng)藥多殘留的快速檢測提供參考。

圖式1 11 種農(nóng)藥的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Scheme 1 Chemical structural formulas of 11 pesticides

1 材料與方法

1.1 藥劑、試劑及材料

99.9%撲草凈標(biāo)準(zhǔn)品 (德國Dr.Ehrenstorfer 公司)；甲醇中殺蟲劑混標(biāo)溶液 (包含殘殺威、甲硫威、殺線威、速滅威、克百威、甲萘威、異丙威、仲丁威、樂果和滅線磷，質(zhì)量濃度均為100 μg/mL，天津阿爾塔科技有限公司)。乙腈和甲醇 (HPLC級，美國J.T.Baker 公司)；甲酸 (色譜級，上海阿拉丁生物科技股份有限公司)；N-丙基乙二胺(PSA)和十八烷基硅烷鍵合硅膠(C18) (北京振翔科技有限公司)；NaCl (分析純，上海麥克林生化科技有限公司)。

以乙腈為溶劑，制備撲草凈的標(biāo)準(zhǔn)儲備液(1.0 mg/mL)并用乙腈稀釋制得撲草凈標(biāo)準(zhǔn)中間液(100.0、10.0、1.0 μg/mL)，于 -20 ℃遮光保存，備用。用甲醇稀釋殺蟲劑混標(biāo)溶液，制得殺蟲劑的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液(10.0、1.0 μg/mL)，于 -20 ℃遮光保存，備用。以甲醇為溶劑，制得11 種農(nóng)藥的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液(100.0、10.0 ng/mL)，現(xiàn)配現(xiàn)用。

本研究用于方法開發(fā)與驗證的草魚采購于北京市農(nóng)貿(mào)市場，采集的樣品冷藏運輸回實驗室；經(jīng)去皮、去骨，取可食用部位，用均質(zhì)機研磨搗碎，于-20 ℃冷凍保存。

1.2 儀器與設(shè)備

QTRAP?5500 超高效液相色譜-三重四極桿/復(fù)合線性離子阱質(zhì)譜儀 (美國SCIEX 公司)；CAFS clean-up column 一步凈化儀 (中國水產(chǎn)科學(xué)研究院)；SB-5200 DTN 超聲波清洗機 (寧波新芝生物科技股份有限公司)；MVM-2500 多管渦流混合器(上海泰坦科技股份有限公司)；MS 3 Basic 基本型旋渦混勻器 (德國IKA 公司)；H-2050 R 臺式高速離心機 (湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)；NEVAPTM112 氮吹儀 (美國Organomation Aossociates公司)；AB265-S 雙量程分析天平(0.01/0.1 mg)、PL 2002 電子天平(0.01 g)[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；0.22 μm Nylon 針式過濾器 (浙江歐爾賽斯科技有限公司)。

1.3 檢測條件

色譜條件：BEH C18色譜柱 (2.1 mm × 100 mm，1.7 μm，賽默飛世爾科技有限公司)；流動相A 相為V(甲酸) :V(水) = 1 : 999，B 相為V(甲酸) :V(乙腈)=1 : 999；柱溫為40 ℃；進樣量為5 μL；采用梯度洗脫程序 (表1)。

表1 梯度洗脫程序Table 1 The gradient elution program

質(zhì)譜條件：采用電噴霧離子源(ESI)，正離子模式下采用多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式采集數(shù)據(jù)。離子源參數(shù)：氣簾氣壓力 (CUR) 0.24 MPa；噴霧電壓 (IS) 5 500.0 V；離子源溫度 (TEM) 500.0 ℃；噴撞氣 (CAD) Medium；霧化氣壓力 (GS1) 0.38 MPa；輔助氣壓力 (GS2) 0.38 MPa；碰撞室射入電壓(EP) 10.0 V；碰撞室射出電壓 (CXP) 13.0 V。其他質(zhì)譜參數(shù)信息見表2。

表2 11 種農(nóng)藥的質(zhì)譜參數(shù)Table 2 Mass spectrum parameters of 11 pesticides

1.4 樣品前處理

提?。簩⒗鋬霾蒴~魚糜解凍至室溫，稱取5.0 g勻漿后的草魚樣品于50 mL 離心管中；加入20 mL乙腈，于2 500 r/min 下渦旋振蕩1 min；加入1 g氯化鈉，混勻，離心管依次在超聲波水浴中浴浸提取20 min；先于 -20 ℃下冷凍30 min 后，再于6 000 r/min 下離心10 min；取上清液，用乙腈定容至20 mL，待凈化。

凈化：準(zhǔn)確移取1 mL 上清液，采用CAFS clean-up 凈化柱 (50 mg PSA) 凈化。凈化流程如圖1 所示：CAFS clean-up 凈化柱固定于本課題組自行研制的快速自動化凈化儀上，向上拉動活塞至上樣口上面，柱口上接0.22 μm 有機相濾膜，下接進樣瓶，使用移液槍將1 mL 上清液通過CAFS clean-up 凈化柱加樣孔加入到柱管中；凈化儀自動推動活塞使上清液依次經(jīng)過凈化柱填料層和濾膜，直接轉(zhuǎn)移到進樣瓶；待檢測。

圖1 CAFS clean-up column 凈化流程[27]Fig. 1 The procedure of CAFS clean-up column[27]

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SCIEX 的Analyst?Software 軟件對數(shù)據(jù)進行采集，MultiQuant 3.0.3 軟件進行定量分析。所有數(shù)據(jù)均由Microsoft Excel 2016 計算，由OriginPro 2021 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器條件的優(yōu)化

在正離子掃描模式監(jiān)測下，分別將不同種類的農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品溶液注入電噴霧離子源，進行離子掃描，得到定量離子和定性離子，進一步優(yōu)化碰撞能量等參數(shù)，詳見表2。在確定質(zhì)譜參數(shù)的基礎(chǔ)上，對流動相條件進行優(yōu)化。首先比較了有機相為乙腈或甲醇時對目標(biāo)化合物色譜峰的影響。結(jié)果表明，有機相為乙腈時各目標(biāo)物的色譜峰良好；這可能是因為進樣液 (即凈化處理后的流出液) 的溶劑為乙腈，溶劑效應(yīng)相對較小。進一步分別在水相和乙腈相中加入體積分?jǐn)?shù)為0.1% 的甲酸以提高目標(biāo)化合物在ESI+模式下的電離效率，在定量限濃度下草魚基質(zhì)中11 種農(nóng)藥的色譜圖見圖2。

圖2 草魚樣品中11 種農(nóng)藥的色譜圖(1LOQ)Fig. 2 Chromatograms of 11 pesticides in grass carp sample spiked an LOQ level

2.2 提取條件優(yōu)化

為了提高草魚中11 種農(nóng)藥的提取效率，對比了純乙腈和V(甲酸) :V(乙腈)=1 : 999 溶液對11 種農(nóng)藥的提取效果 (樣品中各農(nóng)藥的添加水平均為4 μg/kg)。如圖3 所示：經(jīng)兩種提取液提取后，11 種農(nóng)藥的平均回收率均在80%～120% 之間，除殺線威和撲草凈外，其余9 種農(nóng)藥均經(jīng)純乙腈提取后回收率更高，并且采用純乙腈提取后，11 種農(nóng)藥回收率之間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差更低，說明純乙腈對11 種農(nóng)藥的整體提取效果更好、更穩(wěn)定。這與Pang 等[29]的研究結(jié)論基本一致，同時考慮試驗的簡便性和經(jīng)濟性，最終選擇純乙腈作為提取溶劑。

圖3 乙腈和V (甲酸) : V(乙腈) = 1 : 999 對草魚樣品中11 種農(nóng)藥的提取效果對比 (n = 3)Fig. 3 Comparison of extraction effects of 11 pesticides in grass carp using acetonitrile and acetonitrile containing 0.1% formic acid (n = 3)

2.3 濾過型凈化柱參數(shù)的優(yōu)化

2.3.1 凈化填料種類優(yōu)化 由于水產(chǎn)品基質(zhì)中含大量的脂肪和蛋白質(zhì)等干擾成分，而用乙腈進行提取時，油脂會伴隨著目標(biāo)物一起被提取出來，影響定性和定量分析結(jié)果。因此，需采用CAFS clean-up 凈化柱對提取液進行凈化處理。C18和PSA是常用的凈化材料，C18可去除脂質(zhì)，PSA 可去除脂肪酸和糖分[30]。本研究選擇不凈化以及分別以50 mg C18和50 mg PSA 作為CAFS clean-up 凈化柱進行凈化，對比研究了凈化柱填料的種類對凈化效果的影響。如圖4 所示：草魚樣品經(jīng)填料為50 mg C18的凈化柱凈化處理后，11 種農(nóng)藥的回收率普遍偏低，半數(shù)以上農(nóng)藥的回收率低于80%；不凈化處理的草魚樣品中11 中農(nóng)藥的整體回收率情況不佳，其中滅線磷和撲草凈的回收率低于80%，其余9 種農(nóng)藥回收率雖在80%～120%內(nèi)，但除甲萘威和樂果外，均低于經(jīng)50 mg PSA 為填料的凈化柱凈化處理后的回收率；而采用50 mg PSA 為填料的凈化柱凈化處理后，草魚樣品中11 種農(nóng)藥的回收率均在80%～120% 內(nèi)。因此，最終選擇PSA 作為凈化填料。

圖4 不同凈化填料對草魚樣品中11 種農(nóng)藥回收率的影響 (n=3)Fig. 4 Effects of different types of purification sorbents on recoveries of 11 pesticides in grass carp (n=3)

2.3.2 凈化填料用量優(yōu)化 在確定凈化填料的基礎(chǔ)上，分別采用50、100、200 和300 mg 的PSA對CAFS clean-up 凈化柱填料含量進一步優(yōu)化。如圖5 所示：采用300 mg PSA 為凈化填料時11 種農(nóng)藥的回收率過低，除撲草凈外，均低于80%；采用200 mg PSA 為凈化填料時11 種農(nóng)藥的回收率普遍偏低，多達(dá)7 種農(nóng)藥的回收率不足90%；采用100 mg PSA 為凈化填料時11 種農(nóng)藥的整體回收率情況不佳，其中異丙威、仲丁威、速滅威和滅線磷的回收率低于70%；而采用50 mg PSA為凈化填料時11 種農(nóng)藥的回收率均在80%～120%內(nèi)。故CAFS clean-up 凈化柱選擇使用50 mg PSA 作為最終凈化填料。

圖5 不同質(zhì)量凈化填料對草魚樣品中11 種農(nóng)藥回收率的影響 (n=3)Fig. 5 Effect of different amount of purification sorbents on recoveries of 11 pesticides in grass carp (n=3)

2.3.3 凈化次數(shù)優(yōu)化 在確定凈化填料種類和用量的基礎(chǔ)上，分別對比了不凈化和凈化1 次以及同一待凈化液反復(fù)通過同一凈化柱2 次、3 次凈化處理對凈化效果的影響。如圖6 所示：3 次凈化后草魚樣品中11 種農(nóng)藥的整體回收率情況不佳，其中殺線威和撲草凈的回收率接近120%，而仲丁威回收率僅70%左右；2 次凈化處理后11 種農(nóng)藥的整體回收率情況同樣不佳，其中殺線威、滅線磷和撲草凈的回收率接近甚至超過120%，而甲硫威和仲丁威回收率均不足80%；不凈化處理的農(nóng)藥整體回收率情況尚可，但滅線磷和撲草凈的回收率同樣不足70%；而1 次凈化處理后的農(nóng)藥回收率均在80%～120%內(nèi)。綜合考慮，對草魚樣品進行1 次凈化處理，11 種農(nóng)藥即可獲得較好的回收率并可保證快速檢測。

圖6 不同凈化次數(shù)對草魚樣品中11 種農(nóng)藥回收率的影響 (n=3)Fig. 6 Effect of different cleanup times on recoveries of 11 pesticides in grass carp (n=3)

2.4 基質(zhì)效應(yīng)考察

采用電噴霧電離定量分析會受到樣品中基質(zhì)或其他干擾引起的離子抑制或增強的顯著影響[31]；這種現(xiàn)象通常稱為基質(zhì)效應(yīng) (Me)，基質(zhì)效應(yīng)的存在會影響定量結(jié)果。本研究通過(基質(zhì)中標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率/溶劑中標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率-1) × 100%，對草魚樣品中11 種農(nóng)藥的基質(zhì)效應(yīng)進行考察評估，當(dāng)0≤|Me|≤20%時為弱基質(zhì)效應(yīng)，當(dāng)20%＜|Me|＜50%時為中等基質(zhì)效應(yīng)，當(dāng)|Me|≥50% 時為強基質(zhì)效應(yīng)[32-34]。如圖7 所示：11 種農(nóng)藥的|Me|均大于20%，部分農(nóng)藥的|Me|大于50%；即11 種農(nóng)藥在草魚樣品中均表現(xiàn)為中等或強基質(zhì)效應(yīng)。故本研究選擇基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，以外標(biāo)法定量分析。

圖7 11 種農(nóng)藥的基質(zhì)效應(yīng)Fig. 7 Matrix effects of 11 pesticides

2.5 方法確證

2.5.1 線性方程和定量限 以空白草魚樣品為基質(zhì)，采用空白基質(zhì)加標(biāo)方法配制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 和50.0 μg/kg 不同濃度的混合基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液，按上述方法檢測；以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，外標(biāo)法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。以陰性草魚樣品為基質(zhì)，以信噪比≥10 為依據(jù)，并根據(jù)GB/T 27404—2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢驗》中關(guān)于被測組分含量低于0.1 mg/kg 時，回收率范圍為60%～120%的要求，對11 種農(nóng)藥進行定量限 (LOQ) 的考察。各組分線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)和定量限見表3。11 種農(nóng)藥在1.0～50.0 μg/kg 內(nèi)的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.99；定量限為1.0～2.0 μg/kg，說明本方法具有較高的靈敏度。

表3 11 種農(nóng)藥的標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量限Table 3 Standard curves and limit of quantifications of 11 pesticides

2.5.2 方法正確度和精密度 按照1.4 節(jié)中樣品前處理方法，選取空白樣品，添加并制備得到3 個不同水平的陽性樣品 (1 × LOQ、2 ×LOQ 和10 ×LOQ)。重復(fù)性采用相對標(biāo)準(zhǔn)偏差 (RSD) 衡量。每個水平重復(fù)6 次，計算添加回收率及日內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差；按相同的樣品處理方式，連續(xù)測定3 d，計算3 d 內(nèi)每個水平測得值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，作為方法的日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果如表4 所示，11 種農(nóng)藥在3 個不同添加水平下的回收率為83%～119%，日內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.6%～20%，日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.7%～15%。表明本研究建立的檢測方法正確度高且重復(fù)性好，符合農(nóng)藥殘留分析要求[35]。

表4 草魚中11 種農(nóng)藥的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差 (n=6)Table 4 Recoveries and RSD of 11 pesticides in grass carp (n=6)

2.6 方法應(yīng)用

為了進一步驗證方法的可行性，應(yīng)用所建立的方法對從市場購買的草魚、鯉魚、石斑魚、大菱鲆、南美白對蝦以及鰻魚共6 個不同種的水產(chǎn)品進行檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，殺線威在草魚、石斑魚和大菱鲆中以及撲草凈在大菱鲆中有微量殘留，但均低于定量限，可視為未檢出；殺線威在鰻魚中檢出量高于定量限，為1.22 μg/kg。

3 結(jié)論

本研究采用CAFS clean-up column 凈化，結(jié)合UPLC-QTRAP-MS/MS 對草魚中11 種農(nóng)藥殘留量進行檢測。結(jié)果顯示，11 種農(nóng)藥的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.99；定量限為1.0～2.0 μg/kg。11 種農(nóng)藥在3 個不同添加水平下的回收率為83%～119%，日內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.6%～20%，日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.7%～15%。本研究所采用的CAFS clean-up column 可實現(xiàn)對提取液的自動化批量凈化，并且無需氮吹濃縮，凈化和過膜操作可同步進行 (約3 min)，大大提高了檢測效率，并顯著減少了有機溶劑和針式過濾器的用量。此方法靈敏度和正確度高，重復(fù)性好，方便快捷且經(jīng)濟高效。將本方法運用于實際樣品的分析，在鰻魚中檢出殺線威殘留。

謹(jǐn)以此文慶賀中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)藥學(xué)學(xué)科成立70 周年。

Dedicated to the 70th Anniversary of Pesticide Science in China Agricultural University.

作者簡介：

封騰望, 男，碩士研究生。2020年6 月于河北農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)養(yǎng)殖學(xué)專業(yè)獲農(nóng)學(xué)學(xué)士學(xué)位。2020 年9 月考入上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院攻讀水產(chǎn)養(yǎng)殖學(xué)學(xué)術(shù)碩士學(xué)位，主要研究方向為水產(chǎn)品中藥物殘留的快速檢測技術(shù)。

李晉成，男，副研究員，碩士生導(dǎo)師。2012 年在中國科學(xué)院化學(xué)研究所獲得分析化學(xué)博士學(xué)位。博士畢業(yè)后就職于中國水產(chǎn)科學(xué)研究院，主要從事水產(chǎn)品中藥物殘留檢測、殘留消除規(guī)律及標(biāo)準(zhǔn)化等方面研究工作。相關(guān)成果先后獲2020 年中國水產(chǎn)學(xué)會范蠡科學(xué)技術(shù)獎(科技進步類)二等獎等多項。現(xiàn)任上海海洋大學(xué)碩士生導(dǎo)師、中國水產(chǎn)學(xué)會青年工作委員會委員。