不同接種源對(duì)微生物電解池去除水中氨氮的影響

李 涵，趙開心，王 菲，吳大付，郭麗麗

（1.河南科技學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.河南師范大學(xué)，河南 新鄉(xiāng) 453007；3.河南科技大學(xué)，河南 洛陽 471000）

隨著工農(nóng)業(yè)的快速發(fā)展，化工、化肥、養(yǎng)殖等行業(yè)產(chǎn)生了大量氨氮廢水〔1-2〕。如果這類廢水排入河流湖泊，將加劇水體富營養(yǎng)化、毒害水生生物，也嚴(yán)重危害飲用水安全。目前報(bào)道最多的氨氮廢水處理方法主要有吹脫法、吸附法、化學(xué)沉淀法、離子交換法、折點(diǎn)氯化法等物化法〔3-7〕，但物化法存在運(yùn)行成本高、對(duì)運(yùn)行環(huán)境要求嚴(yán)格、易產(chǎn)生二次污染等缺點(diǎn)，并不是理想的處理技術(shù)。生物法具有運(yùn)行成本低、無二次污染、可回收有用物質(zhì)、條件溫和等優(yōu)點(diǎn)，克服了物化法的一些缺點(diǎn)〔8〕，在處理氨氮廢水方面具有良好的應(yīng)用前景。

生物法利用微生物將污水中的氨氮最終轉(zhuǎn)化為N2，去除效果較好，但往往需要補(bǔ)充碳源，且具有占地面積大、操作復(fù)雜、啟動(dòng)緩慢等弊端。生物電化學(xué)法將電化學(xué)法與生物法相結(jié)合，彌補(bǔ)了2種方法單獨(dú)運(yùn)行時(shí)的不足，有效提高了反應(yīng)器內(nèi)的生物脫氮性能，已成為廢水處理技術(shù)發(fā)展的趨勢(shì)〔9-10〕。生物電化學(xué)系統(tǒng)（BES）主要包括微生物燃料電池（MFC）和微生物電解池（MEC）。生物電化學(xué)法脫氮時(shí)，外加電壓可顯著影響微生物的活性、生長(zhǎng)速率及新陳代謝，從而影響微生物的硝化作用，同時(shí)廢水電解產(chǎn)生的部分中間產(chǎn)物也可將氨氮轉(zhuǎn)化為氮?dú)狻?1-12〕。因此，生物電化學(xué)脫氮具有更高效、節(jié)能的優(yōu)點(diǎn)。Xue WU等〔13〕采用MEC模式對(duì)陰極室模擬廢水和實(shí)際廢水（NH4+-N質(zhì)量濃度為1 g/L）進(jìn)行處理，二者的氨氮回收率分別為94%和79%。Tingting ZHU等〔14〕構(gòu)建了單室BES，當(dāng)陽極電勢(shì)控制為-0.5 V時(shí)，氨氧化速率加快。

目前，有關(guān)不同微生物接種源對(duì)雙室MEC處理氨氮廢水的影響還未見報(bào)道，本研究以小麥根際土壤、回流污泥、曝氣池污泥為微生物接種源，以碳?xì)譃殛帢O電極材料，利用雙室MEC去除模擬廢水中的氨氮，考察不同微生物接種源和外加電壓對(duì)氨氮去除率的影響，并對(duì)陰極室的碳?xì)诌M(jìn)行高通量測(cè)序，重點(diǎn)分析微生物的多樣性。

1 材料及方法

1.1 試劑、廢水及微生物接種源

試劑主要包括磷酸鹽（PBS）緩沖液、礦物質(zhì)溶液。礦物質(zhì)溶液成分包含50 mg/L EDTA、4.32 mg/L MnSO4·H2O、5.00 mg/L FeSO4·7H2O、4.15 mg/L CaCl2·2H2O、1.61 mg/L CoCl2·6H2O、2.20 mg/L ZnSO4、1.57 mg/L CuSO4·5H2O、0.1 mg/L H3BO3、1.1 mg/L Na2MoO4。

模擬廢水成分：1.8 g/L Na2HPO4、0.66 g/L NaH2PO4、0.1 g/L KCl、1 g/L NaHCO3、0.1 g/L NH4Cl、0.012 g/L MgSO4、25 mL/L礦物質(zhì)溶液。

本研究微生物接種源選擇回流污泥、曝氣池污泥和小麥根際土壤?；亓魑勰嗪推貧獬匚勰嗳∽孕锣l(xiāng)市駱駝灣污水處理廠，常規(guī)指標(biāo)見表1。小麥根際土壤采集自試驗(yàn)田，采用5點(diǎn)取樣法，去除土壤表層可見的動(dòng)植物殘?bào)w，深挖到20 cm處，將根系和土壤一同裝入無菌袋中，放于4℃冰盒內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室；到實(shí)驗(yàn)室后將根系取出，輕輕抖掉根系表層的土壤，用毛刷將附著在根系上的土壤刷下；將5個(gè)樣點(diǎn)的根際土壤混勻并過篩（1 mm），即得到實(shí)驗(yàn)用的根際土壤，常規(guī)指標(biāo)見表2。

表1 回流污泥和曝氣池污泥常規(guī)指標(biāo)Table 1 Index of reflux sludge and aeration tank sludge

表2 小麥根際土壤常規(guī)指標(biāo)Table 2 Index of wheat roots soil

1.2 實(shí)驗(yàn)裝置

主反應(yīng)器采用雙室MEC反應(yīng)器，結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 雙室MEC反應(yīng)器Fig.1 Two-chamber MEC reactor

如圖1所示，采用陽離子交換膜將陰極室和陽極室分隔，陽離子交換膜材質(zhì)為Nafion?N117膜，厚度為0.180 mm，交換容量≥0.90 mmol/g，CAS：31175-20-9 d.1.98。陰陽極室的有效工作容積均為100 mL，陰極材料為預(yù)處理（在沸水中煮2 h后自然風(fēng)干）后的碳?xì)郑?0 mm×50 mm），陽極材料為石墨板（50 mm×50 mm）。采用與三電極系統(tǒng)相連的CHI1000C恒電位儀（上海辰華儀器公司）控制電極電位，以陰極為工作電極，陽極為對(duì)電極，Ag/AgCl電極（上海辰華儀器公司CHI111）為參比電極并置于陰極室中。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

在陰極室內(nèi)加入回流污泥與模擬廢水，在陽極室內(nèi)加入PBS緩沖液。將陰陽極室放到顯熱磁力攪拌器上，分別設(shè)置4個(gè)電壓：0.3、0.5、0.7、0.9 V。將設(shè)置好的4個(gè)MEC裝置同時(shí)運(yùn)行，并設(shè)置空白對(duì)照（不加電壓）。每天定時(shí)取樣，裝置運(yùn)行3 d后，將碳?xì)旨舻粢恍K保存，并檢測(cè)其上的微生物類型。曝氣池污泥與根際土壤接種源的操作同回流污泥。表3為MEC裝置的運(yùn)行條件，反應(yīng)序號(hào)中R1、A1、S1分別表示回流污泥、曝氣池污泥和根際土壤微生物接種源，V1、V2、V3、V4分別代表0.3、0.5、0.7、0.9 V的運(yùn)行電壓。此外，R0、A0、S0分別代表回流污泥、曝氣池污泥和根際土壤的空白對(duì)照組。

表3 MEC的運(yùn)行條件Table 3 Operating conditions of MEC

1.4 分析方法

每天取陰極室中的上清液，經(jīng)0.22 μm玻璃纖維濾紙過濾后，使用納氏試劑分光光度法測(cè)定上清液氨氮含量，并計(jì)算氨氮去除率。

1.5 高通量測(cè)序

高通量測(cè)序被廣泛應(yīng)用在工廠污染廢水、土壤和大氣中微生物多樣性的分析，被稱為“新一代的測(cè)序技術(shù)”〔15-17〕。采用高通量測(cè)序檢測(cè)陰極碳?xì)稚仙锬さ奈⑸锝Y(jié)構(gòu)，并對(duì)微生物菌群進(jìn)行OTU（可操作分類單元）分類〔18〕。本研究高通量測(cè)序送往上海派森諾生物公司測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同接種源MEC的氨氮去除效果

不同微生物接種源的MEC中氨氮去除率隨運(yùn)行電壓的變化見圖2。

圖2 不同微生物接種源的MEC中氨氮去除率隨運(yùn)行電壓的變化Fig.2 The removal rate of ammonia nitrogen in MEC of different microbial inoculation sources varies with operating voltage

由圖2可以看出，電壓對(duì)不同微生物接種源的MEC的影響有較大不同。以回流污泥為接種源的MEC，隨著電壓的增大（0.3～0.5 V），氨氮去除率也相應(yīng)提高，在電壓為0.5 V時(shí)，氨氮去除效果最佳，去除率達(dá)到75.00%；電壓超過0.5 V后氨氮去除率又出現(xiàn)下降趨勢(shì)，0.9 V時(shí)氨氮去除率降至最低（2%）。以根際土壤為接種源的MEC，隨著電壓的升高，氨氮去除率也逐漸升高，在電壓為0.9 V時(shí)最佳，氨氮去除率為50.52%。而曝氣池污泥在電壓刺激下對(duì)氨氮的去除效果不佳，在最佳電壓0.9 V時(shí)僅取得了36.02%的氨氮去除率，原因可能是曝氣池污泥中具有硝化能力的微生物含量較少，不利于氨氮的轉(zhuǎn)化去除。同一外加電壓下，不同微生物接種源的MEC中氨氮去除率也差別較大，電壓低于0.9 V時(shí)，以回流污泥為接種源的MEC的氨氮去除效果較好；而電壓為0.9 V時(shí)，根際土壤的氨氮去除率最高。因此，不同微生物接種源的MEC在去除模擬廢水中氨氮時(shí)都有其最佳外加電壓，不同外加電壓和接種源對(duì)氨氮去除率的影響也呈現(xiàn)不同趨勢(shì)。

2.2 生物結(jié)構(gòu)分析

2.2.1 門分類水平上的韋恩圖

對(duì)3組不同微生物接種源的MEC陰極生物膜進(jìn)行高通量測(cè)序，得到門分類水平上的OTU豐度矩陣。根據(jù)OTU豐度矩陣，使用R軟件計(jì)算各樣本組共有OTU的數(shù)量，并通過韋恩圖直觀地呈現(xiàn)各樣本微生物的分布。圖3為在4個(gè)不同電壓下發(fā)生硝化反應(yīng)的陰極生物膜在門分類水平上微生物的OTU數(shù)量。

圖3 不同電壓下不同接種源的MEC生物膜中微生物在門分類水平上的韋恩圖Fig.3 Wenn diagram of the microbial community at the phylum level in MEC with different inoculation sources at different voltages

由圖3（a）可知，以回流污泥為接種源的MEC陰極生物膜在4個(gè)運(yùn)行電壓下的總OTU數(shù)量為2 279，共有OTU數(shù)量為497，占總OTU數(shù)量的21.8%；0.3 V與0.5 V電壓條件下共有OTU數(shù)量為983，占總OTU數(shù)量的43.1%。由圖3（b）可知，以根際土壤為接種源的MEC陰極生物膜在4個(gè)運(yùn)行電壓下的總OTU數(shù)量為1 397，共有OTU數(shù)量為174，占 總OTU數(shù)量的12.5%；以根際土壤為接種源的硝化反應(yīng)中，0.7 V與0.9 V電壓條件下氨氮去除率相近（分別為43.92%和50.52%），共有OTU數(shù)量為434，占總OTU數(shù)量的31.1%；4個(gè)電壓中獨(dú)有OTU數(shù)量最多的是0.9 V，獨(dú)有OTU數(shù)量為243，然后依次為0.5 V、0.7 V、0.3 V，獨(dú)有OTU數(shù)量分別為169、121、116。由圖3（c）可知，以曝氣池污泥為接種源的MEC陰極生物膜在4個(gè)運(yùn)行電壓下的總OTU數(shù)量為2 576，共有OTU數(shù)量為543，占總OTU數(shù)量的21.1%。整體來看，外加電壓對(duì)不同接種源的MEC陰極生物膜中微生物的生長(zhǎng)影響較大。

2.2.2 門分類水平上微生物培養(yǎng)前后對(duì)比

模擬廢水經(jīng)不同接種源的MEC處理后，陰極生物膜上的微生物組成及數(shù)量會(huì)發(fā)生一定變化。外加電壓通過促進(jìn)或者抑制某些微生物的生長(zhǎng)繁殖來影響氨氮的去除率。圖4為最佳電壓下不同接種源的MEC中微生物在門分類水平上培養(yǎng)前后的變化。

從圖4（a）可以明顯看出，回流污泥接種源培養(yǎng)前后MEC中的優(yōu)勢(shì)菌種均為Proteobacteria；在0.5 V電壓下培養(yǎng)3 d后，Proteobacteria相對(duì)豐度明顯增多，由原來的36.1%增加到68.4%；Chloroflexi相對(duì)豐度明顯減少，由原來的24.1%減少到8.5%。根際土壤接種源培養(yǎng)前后MEC中的優(yōu)勢(shì)菌種均為Proteobacteria，相對(duì)豐度變化也不明顯（85.7%→84.9%），Actinobacteria的相對(duì)豐度由9.5%增至11.9%〔圖4（b）〕。由圖4（c）可見，曝氣池污泥接種源培養(yǎng)前后MEC中的優(yōu)勢(shì)菌種均為Proteobacteria，在0.9 V電壓下培養(yǎng)3 d后，Proteobacteria相對(duì)豐度明顯增多，由原來的36.4%增加到60.7%。Proteobacteria是3種不同接種源的MEC硝化反應(yīng)過程中的優(yōu)勢(shì)菌門，該菌門包含大量具有硝化及反硝化作用的細(xì)菌，對(duì)水體的脫氮效果起重要作用。J.DESLOOVER等〔19〕報(bào)道了BES中自養(yǎng)脫氮的主要優(yōu)勢(shì)菌歸屬Proteobacteria，這些菌廣泛依附在脫氮電極上，盡管數(shù)量不多，但脫氮效率比較高。Rui DU等〔20〕通過分析穩(wěn)定運(yùn)行的反硝化氨氧化反應(yīng)器，也發(fā)現(xiàn)反應(yīng)器中Proteobacteria為優(yōu)勢(shì)菌門。

圖4 最佳電壓下不同接種源的MEC培養(yǎng)前后微生物變化Fig.4 Microbial changes of MEC with different inoculation sources before and after culture under the optimum voltage

2.2.3 微生物群落屬水平熱圖

為進(jìn)一步分析不同微生物接種源細(xì)菌群落組成差異，利用熱圖（圖5）聚類排名前30的細(xì)菌屬，不同的微生物接種源和外加電壓引起了各菌種不同的分布情況。

如圖5所示，在A0、R0、S0、R1V2、A1V4和S1V4中，

圖5 不同接種源在最佳電壓下微生物屬水平熱圖Fig.5 Microbial community heatmap analysis on genus level with different inoculation sources under the optimum voltage

Pseudomonas、Alcanivorax、Hahella、Hyphomicrobium、Ferruginibacter、Nitrospira相 對(duì) 豐 度 較 高，其 中Pseudomonas的相對(duì)豐度分別為11.37%、11.89%、44.33%、24.34%、77.06%、23.97%，占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。在本次研究中出現(xiàn)的功能菌屬中，Pseudomonas為最常見的脫氮菌，屬于革蘭氏陰性菌，桿狀，有極性鞭毛，部分為產(chǎn)孢菌。Pseudomonas隨接種源和外加電壓的不同呈現(xiàn)出不同的變化趨勢(shì)，對(duì)回流污泥和曝氣池污泥來說，外加電壓顯著增加了Pseudomonas的相對(duì)豐度；而對(duì)于根際土壤接種源，Pseudomonas的相對(duì)豐度出現(xiàn)小幅下降趨勢(shì)。3種微生物接種源中，Nitrospira隨著弱電流的出現(xiàn)相對(duì)豐度變化不是特別明顯。外加電壓提高了Alcanivorax的相對(duì)豐度，其在以回流污泥、曝氣池污泥和根際土壤為接種源的MEC中的相對(duì)豐度都出現(xiàn)明顯增加，分別由0、0、0.01%提升至3.78%、0.52%、2.45%。Hahella在以根際土壤為接種源的MEC中的相對(duì)豐度變化最為明顯，從未檢出增至17.43%。其他排名靠前的菌種豐度隨著接種源和外加電壓的不同也都呈現(xiàn)出不同的變化趨勢(shì)。整體來看，以微生物聚集的程度為依據(jù)，微生物接種源為曝氣池污泥和回流污泥的MEC陰極微生物組成較為接近，外加電壓對(duì)其影響也呈現(xiàn)一定的相似性，而以根際土壤為接種源的反應(yīng)器與前兩者差別較大。

2.2.4 微生物群落Alpha多樣性指數(shù)分析

對(duì)于微生物群落Alpha多樣性，常用的度量指數(shù)主要包括側(cè)重于體現(xiàn)群落豐富度的Chao1指數(shù)，以及兼顧群落均勻度的Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)。一般而言，Chao1指數(shù)越大，群落的豐富度越高；Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)越高，群落的多樣性越高。不同微生物接種源的MEC在最佳電壓下微生物的Alpha多樣性指數(shù)如圖6所示。

圖6 最佳電壓下不同接種源微生物的Alpha多樣性指數(shù)Fig.6 Alpha diversity indexes of different inoculation sources under the optimum voltage

由圖6可見，不同接種源的微生物的多樣性和豐富度均有所不同，在最佳電壓下，以回流污泥為接種源的MEC的Chao1最大，平均值為1 559.77；曝氣池污泥次之，平均值為1 466.49；而根際土壤最低，平均值僅為812.13。以回流污泥和曝氣池污泥為接種源的MEC的Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)較為接近，而以根際土壤為接種源的MEC的Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)低于前兩者。隨著外加電壓的加入，以曝氣池污泥和根際土壤為接種源的反應(yīng)器微生物的Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)均出現(xiàn)了上升，表明外加電壓可以提高其微生物的多樣性和豐富度；而回流污泥則出現(xiàn)了不同的變化，外加電壓的刺激引起微生物豐富度的提高，而多樣性則有一定程度的降低，結(jié)合氨氮的最佳去除效果（75%）是以回流污泥為接種源的MEC在外加電壓0.5 V下得到的，可推測(cè)外加電壓促使了硝化功能菌的聚集，從而提高了其去除氨氮的能力。

3 結(jié)論

（1）不同微生物接種源的MEC在去除模擬廢水中氨氮時(shí)有著不同的最佳外加電壓，外加電壓對(duì)氨氮去除率的影響也呈現(xiàn)出不同趨勢(shì)。以回流污泥、根際土壤、曝氣池污泥為微生物接種源的MEC硝化過程中的最佳電壓分別為0.5、0.9、0.9 V，氨氮去除率分別為75%、50.52%、36.02%。

（2）不同電壓對(duì)不同接種源的MEC中微生物生長(zhǎng)影響較大。Proteobacteria是以回流污泥、根際土壤和曝氣池污泥為接種源的MEC硝化反應(yīng)過程中起主要作用的微生物菌門。

（3）不同的微生物接種源和外加電壓引起了菌種分布情況的不同，接種源為曝氣池污泥和回流污泥的MEC中的微生物組成較為接近，外加電壓對(duì)其影響也呈現(xiàn)一定的相似性，而以根際土壤為接種源的反應(yīng)器與前兩者差別較大。

（4）不同接種源的MEC中微生物的多樣性和豐富度均有所不同，結(jié)合氨氮去除效果推測(cè)，外加電壓促使了硝化功能菌的聚集，從而提高了其去除氨氮的能力。