基于卵形鯧鲹基因組重測(cè)序的InDel標(biāo)記挖掘與耐低氧性狀關(guān)聯(lián)分析

傘利擇 ，劉寶鎖, ，張 楠, ，郭 梁, ，郭華陽(yáng), ，朱克誠(chéng), ，張殿昌,

1. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 海洋學(xué)院，河北 秦皇島 066003

2. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510300

3. 廣東省海洋生物種業(yè)工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510300

卵形鯧鲹 (Trachinotus ovatus) 具有生長(zhǎng)快、肉質(zhì)鮮美、經(jīng)濟(jì)價(jià)值高等優(yōu)點(diǎn)，是我國(guó)南部沿海地區(qū)重要的海水養(yǎng)殖品種之一。其生存和生長(zhǎng)容易受到各種環(huán)境因素的影響，其中水體中的溶解氧含量是關(guān)鍵因素之一。在自然條件下，海水通過風(fēng)和浪的物理攪動(dòng)使大量的氧氣溶解在水中。水生生物光合作用產(chǎn)生的氧氣也是水中溶解氧的重要來(lái)源。但當(dāng)海水交換不及時(shí)，或赤潮爆發(fā)后，大量死亡的藻類在分解過程中消耗大量氧氣[1]，導(dǎo)致卵形鯧鲹缺氧。一些寄生蟲例如刺激隱核蟲 (Cryptocaryon irritans)[2]和眼點(diǎn)淀粉卵渦鞭蟲 (Amylocdinium ocellatum)[3]的寄生會(huì)破壞鰓組織，使魚無(wú)法進(jìn)行氣體交換，導(dǎo)致卵形鯧鲹缺氧死亡。

溶解氧的減少會(huì)對(duì)魚類產(chǎn)生諸多影響，包括食物攝入量減少、生長(zhǎng)速度減慢、游泳能力下降和影響魚類的形態(tài)學(xué)特征和生存策略[4]。研究發(fā)現(xiàn)，低氧環(huán)境會(huì)導(dǎo)致尼羅羅非魚 (Oreochromis niloticus) 的食欲下降并影響其生長(zhǎng)速度[5]；相比正常溶解氧的生存環(huán)境，虹鱒 (Oncorhynchus mykiss) 在低氧條件下游得更慢[6]；長(zhǎng)期缺氧會(huì)降低大西洋鮭 (Salmo salar) 卵的孵化率，甚至導(dǎo)致胚胎發(fā)育畸形或死亡[7]。一些魚類為適應(yīng)低氧環(huán)境，鰓組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。例如，鯽 (Carassius carassius)[8]、金魚 (C. auratus)[9]和團(tuán)頭魴 (Megalobrama amblycephalala)[10]通過重建鰓組織、暴露鰓板增加鰓的表面積以應(yīng)對(duì)缺氧脅迫。

DNA標(biāo)記是一種非常可靠的分子標(biāo)記，隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA (Random Amplified Polymorphic DNA, RAPD)[11]、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性 (Amplified Fragment Length Polymorphism, AFLP)[12-13]、簡(jiǎn)單序列重復(fù) (Simple Sequence Repeat, SSR)[14]、單核苷酸多態(tài)性 (Single Nucleotide Polymorphism, SNP)[15-17]和插入-缺失 (InDel)[18-19]等分子標(biāo)記已廣泛應(yīng)用于遺傳育種研究。在不同的個(gè)體中，由于基因的插入或缺失，相應(yīng)的基因和基因組區(qū)域會(huì)有不同的序列長(zhǎng)度。這些突變被稱為InDel，可以通過插入轉(zhuǎn)座元件、相似重復(fù)副本之間的不相等交叉事件或簡(jiǎn)單序列復(fù)制的滑移形成[20]，并可能表現(xiàn)為功能喪失或無(wú)意義突變[21]。InDel和SNP是動(dòng)物基因組中最豐富和分布最廣泛的變異性來(lái)源，均非常適合于構(gòu)建遺傳連鎖圖譜、全基因組關(guān)聯(lián)分析和遺傳多樣性分析等其他遺傳學(xué)研究。然而，在分子標(biāo)記輔助育種的過程中，InDel比SNP更方便可取，因?yàn)镮n-Del的多態(tài)性更易通過設(shè)計(jì)特異性引物、PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳來(lái)顯示。以往有多項(xiàng)畜牧和農(nóng)作物研究使用了InDel標(biāo)記[22-23]，但在水產(chǎn)動(dòng)物中使用InDel標(biāo)記的研究?jī)H占少數(shù)[18-19,24]。因此，本研究利用全基因組重測(cè)序技術(shù)挖掘卵形鯧鲹與耐低氧性狀顯著關(guān)聯(lián)的InDel標(biāo)記，所篩選到的InDel標(biāo)記可作為分子標(biāo)記輔助育種，并有助于鑒定與卵形鯧鲹耐缺氧性狀相關(guān)的候選基因，為進(jìn)一步研究卵形鯧鲹耐缺氧性狀的分子機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

在海南省陵水縣中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所熱帶水產(chǎn)研究開發(fā)中心隨機(jī)抽取90對(duì)卵形鯧鲹親本。人工催產(chǎn)孵化后，對(duì)幼魚進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化養(yǎng)殖管理。隨機(jī)選取500尾3月齡的幼魚 [體質(zhì)量 (22±2.9) g] 運(yùn)至車間，以流水的養(yǎng)殖方式暫養(yǎng)2周，水體溶解氧水平維持在 (8.8±0.2) mg·L-1，水體pH為8.1。在暫養(yǎng)期間，每天投喂2次商品配合飼料，飼料投喂量為魚體體質(zhì)量的5%，實(shí)驗(yàn)開始前24 h停止投喂。

1.2 低氧處理

將500尾卵形鯧鲹轉(zhuǎn)移到體積為3 m3的養(yǎng)殖水桶中。在實(shí)驗(yàn)過程中，溶解氧含量由溶解氧測(cè)定儀 (WTW multi3620，德國(guó)) 監(jiān)測(cè)。實(shí)驗(yàn)開始時(shí)溶解氧質(zhì)量濃度為8.8 mg·L-1，實(shí)驗(yàn)開始后，關(guān)閉流水和氧氣，以向水中注入氮?dú)獾姆绞浇档腿芙庋跛剑? h內(nèi)將溶解氧水平降至窒息點(diǎn) (1.3 mg·L-1)，以1.3 mg·L-1水平一直維持到實(shí)驗(yàn)結(jié)束。當(dāng)卵形鯧鲹在第一次觸底后不能繼續(xù)游超過10 s時(shí)，定義為死亡?？焖贀破鹚吏~，記錄死亡時(shí)間。收集鰭條保存在乙醇中，每個(gè)鰭條樣品與死亡時(shí)間相對(duì)應(yīng)。按照卵形鯧鲹的死亡時(shí)間分為2組，死亡順序的前10%為缺氧敏感組，后10%為缺氧耐受組。對(duì)收集的共100尾卵形鯧鲹進(jìn)行全基因組重測(cè)序。

1.3 DNA提取及測(cè)序

收集的鰭條組織使用MagPure tissue DNA試劑盒 (Magen，廣州)并按照說(shuō)明書步驟提取DNA。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳 (Biowest agrose, 西班牙)和 NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, 美國(guó)) 分別測(cè)定提取的DNA的質(zhì)量和濃度。檢測(cè)合格的DNA送到天津諾禾致源生物公司進(jìn)行全基因組重測(cè)序。

1.4 基因組重測(cè)序

基因組DNA被隨機(jī)剪切成350 bp的片段。經(jīng)過末端修復(fù)、磷酸化和添加poly-A尾構(gòu)建DNA文庫(kù)，DNA文庫(kù)在Illumina HiSeq PE150平臺(tái)進(jìn)行重測(cè)序。100尾卵形鯧鲹重測(cè)序獲得的原始數(shù)據(jù)使用軟件fastq 0.23[25]進(jìn)行質(zhì)量過濾。過濾條件為：1) 刪除包含接頭 (adapter) 的reads；2) 刪除N含量超過5%的reads；3) 刪除低質(zhì)量reads (Qphred≤20) 的堿基數(shù)占整個(gè)reads長(zhǎng)度的50%以上的reads。

1.5 InDel的檢測(cè)與注釋

利用BWA 0.7.17軟件將過濾后的100尾卵形鯧鲹的reads與參考基因組進(jìn)行比對(duì)定位，并輸出BAM文件。使用gatk 4.2.6.0軟件[26]檢測(cè)每個(gè)樣品的InDel并統(tǒng)計(jì)數(shù)目，檢測(cè)得到包含每個(gè)個(gè)體InDel的VCF文件和gff3格式的基因組注釋文件。通過snpEff 5.1和ANNOVAR軟件[27-28]獲得InDel在基因組的位置以及變異位點(diǎn)為同義突變或者為非同義突變的信息。

1.6 變異基因功能注釋

比較低氧敏感組和耐受組兩組的差異InDel，篩選低氧耐受組所特有的InDel位點(diǎn)，并定位到變異的基因。通過ClusterProfiler對(duì)變異基因進(jìn)行GO、KEGG富集分析，篩選與耐低氧相關(guān)的通路。通過KEGG注釋篩選耐低氧相關(guān)的候選基因，進(jìn)行基因功能分析。

1.7 InDel與耐低氧性狀的關(guān)聯(lián)分析

利用PLINK 1.90b6.21軟件[29]對(duì)100尾卵形鯧鲹InDel數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控，去除次要等位基因頻率小于5%和個(gè)體變異缺失率大于5%的位點(diǎn)，并進(jìn)行主成分分析 (Principal component analysis, PCA)，并使用ggplot2軟件包可視化PCA圖。使用GCTA 1.26.0軟件[30]評(píng)估個(gè)體間的親屬關(guān)系系數(shù)。最后，利用GEMMA 0.98.3軟件[31]的線性混合模型 (Linear mixed model, LMM) 將InDel位點(diǎn)和表型數(shù)據(jù)結(jié)合起來(lái)進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析。計(jì)算模型為：

式中：Y為個(gè)體在缺氧脅迫下的生存時(shí)間；W為協(xié)方差矩陣；α為群體均值和顯著主成分的協(xié)變量；X為固定效應(yīng)矩陣；β為每個(gè)InDel位點(diǎn)的效應(yīng)值；Z為基于InDel的親緣關(guān)系矩陣；μ為加性遺傳效應(yīng)；ε為殘差向量。關(guān)聯(lián)分析結(jié)果利用ggplot2包繪制曼哈頓圖和QQ (Quantile-Quantile) 圖。

在顯著相關(guān)InDel標(biāo)記上下游50 kb的區(qū)域內(nèi)篩選候選基因。利用BLAST在非冗余核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行序列比對(duì)，確定基因。根據(jù)基因的位置和功能，初步確定候選基因。

2 結(jié)果

2.1 測(cè)序結(jié)果質(zhì)量分析

通過使用Illumina平臺(tái)對(duì)100尾卵形鯧鲹進(jìn)行PE150測(cè)序，生成了693.48 Gb原始序列數(shù)據(jù)，并保存在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù) (PRJNA658481)。統(tǒng)計(jì)100尾卵形鯧鲹的測(cè)序數(shù)據(jù)，測(cè)序讀段在每個(gè)位置的GC含量約為41%，且在整個(gè)測(cè)序過程基本穩(wěn)定不變，呈水平線，無(wú)偏好性。前幾位堿基在核苷酸組成上有一定偏好性，產(chǎn)生波動(dòng)是由于測(cè)序讀段連接的接頭所引起 (圖1-a)。堿基的測(cè)序質(zhì)量Q30平均為90.8% (Q30即堿基正確識(shí)別率為99.9%)，表明堿基測(cè)序的出錯(cuò)率很低，保證了后續(xù)分析的準(zhǔn)確性 (圖1-b)。根據(jù)PE150測(cè)序技術(shù)的特點(diǎn)，測(cè)序片段末端的堿基質(zhì)量一般會(huì)比前端低。

圖1 卵形鯧鲹基因組 GC含量和測(cè)序質(zhì)量分布圖Fig. 1 GC content and sequence quality in T.ovatus

2.2 InDel序列長(zhǎng)度及分布分析

通過GATK 4.2.6.0分析共檢測(cè)到2 574 178個(gè)InDel位點(diǎn)。其中插入和缺失的個(gè)數(shù)分別為1103610和1 470 568個(gè)，缺失個(gè)數(shù)多于插入個(gè)數(shù)。大部分插入或缺失的片段大小為1～5 bp，分別占各自總數(shù)的75.8%和76.6%。1個(gè)堿基的插入和缺失的數(shù)量最多，分別為496 002和532 256個(gè) (表1)。通過對(duì)InDel在基因組上的位置分析，發(fā)現(xiàn)有34.51%和35.64%的InDel位于基因間和內(nèi)含子上，占據(jù)了InDel總數(shù)的一半以上，只有極少數(shù) (0.68%) 的InDel位于外顯子上 (圖2)。本研究中采用了重測(cè)序的方法對(duì)InDel篩選，獲得的InDel平均密度為372.1 InDel·Mb-1，24條染色體中，密度最大的是17號(hào)染色體 (4 886.6 InDel·Mb-1)，密度最小的是4號(hào)染色體 (3 400.9 InDel·Mb-1)，表明17號(hào)染色體發(fā)生最多的變異 (圖3)。

圖2 InDel在基因組上的分布位置Fig. 2 Region of InDel on genome

圖3 InDel在基因組上的分布密度Fig. 3 Distribution density of InDel on genome

表1 鑒定到的不同長(zhǎng)度InDel的數(shù)量Table 1 Number of InDels of different sizes identified

2.3 耐受組特有InDel分析

分別對(duì)敏感組和耐受組進(jìn)行InDel篩選，敏感組和耐受組分別篩選到1 723 005和1 720 945個(gè)InDel，其中耐受組所特有的InDel 249 395個(gè)。使用snpEff 5.1和ANNOVAR軟件對(duì)耐受組所特有的InDel進(jìn)行基因分析，249 395個(gè)InDel中有2209個(gè)位于外顯子上，涉及543個(gè)基因。通過GO注釋分析，多數(shù)變異基因主要富集在染色體和頂體泡的組成、核酸結(jié)合和GTP結(jié)合的分子功能和細(xì)胞對(duì)DNA損傷刺激的反應(yīng)，以及Wnt信號(hào)通路上 (表2)。通過KEGG富集分析，這些基因主要富集在核苷酸切除修復(fù)信號(hào)通路和細(xì)胞黏著分子上 (圖4)。

圖4 KEGG富集分析Fig. 4 KEGG enrichment scatter plot

表2 變異基因GO功能分類注釋Table 2 GO classification of mutated genes

2.4 InDel與耐低氧性狀關(guān)聯(lián)分析

利用InDel位點(diǎn)對(duì)實(shí)驗(yàn)群體進(jìn)行主成分分析和親緣關(guān)系分析。親緣關(guān)系分析發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)個(gè)體間的親緣關(guān)系介于-0.1～0.3 (圖5-a)。在主成分分析中，主成分因子1和2將實(shí)驗(yàn)樣本分成5組 (圖5-b)。采用GEMMA 0.98.3軟件的線性混合模型對(duì)耐低氧性狀進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，觀察到的InDel位點(diǎn)的P值大于其預(yù)期值 (圖5-c)，表明線性混合模型處理樣本數(shù)據(jù)是合理的，所得結(jié)果是可靠的。根據(jù)Bonferroni校正，閾值設(shè)置為P= (0.05/N)，其中N為突變位點(diǎn)的數(shù)量。在本研究中，通過PLINK 1.90b6.21軟件質(zhì)控后，共有336 391個(gè)InDel位點(diǎn)被用于卵形鯧鲹耐低氧性狀的關(guān)聯(lián)分析。因此，本研究中的閾值設(shè)置為-lg (0.05/336 391)=6.83。由于Bonferroni校正過于嚴(yán)格會(huì)導(dǎo)致假陰性，所以需要根據(jù)曼哈頓圖調(diào)整閾值[32-33]。閾值設(shè)置為-lg (1/336 391)=5.53作為建議顯著性閾值，且達(dá)到該閾值的InDel位點(diǎn)可能與耐低氧性狀關(guān)聯(lián)。336 391個(gè)InDel位點(diǎn)中無(wú)InDel位點(diǎn)達(dá)到顯著性閾值，包括調(diào)整后的閾值。但3個(gè)InDel位點(diǎn)的P值接近建議性顯著性閾值。其中2個(gè)InDel位點(diǎn)位于3號(hào)染色體，根據(jù)InDel在染色體上的位置對(duì)其編號(hào)為In-Del22883061和InDel24919481，對(duì)應(yīng)的-lgP分別為5.26和5.11。另外一個(gè)InDel位于19號(hào)染色體，將其命名為InDel14451779，對(duì)應(yīng)的-lgP為5.25 (圖 5-d)。

圖5 100尾卵形鯧鲹親緣關(guān)系熱圖 (a)、主成分分析 (b)、耐低氧性狀全基因組關(guān)聯(lián)分析的QQ圖 (c) 和曼哈頓圖 (d)Fig. 5 Heat map of genetic relationship (a), principal component analysis (b), Q-Q plot (c) and Manhattan plot (d) of genome-wide association analysis for low oxygen tolerance of 100 individuals of T. ovatus

2.5 顯著InDel基因注釋

對(duì)重要的3個(gè)InDel位點(diǎn)上下游50 kb的基因組序列進(jìn)行注釋后，探索可能與卵形鯧鲹耐缺氧相關(guān)的基因。3個(gè)位點(diǎn)共注釋到9個(gè)耐低氧性狀相關(guān)的候選基因。位于3號(hào)染色體上的2個(gè)InDel位點(diǎn)共注釋到3個(gè)基因 (gpr153、acot7和lrfn2b)。另一位于19號(hào)染色體的InDel位點(diǎn)共注釋到6個(gè)基因(tmem237b、mpp4、als2、LOC111232287、LOC111232276和LOC120797970)。

3 討論

InDel是廣泛分布于基因組的結(jié)構(gòu)變異的主要來(lái)源之一，是對(duì)其他基于序列的遺傳標(biāo)記 (如SSRs和SNPs) 的有價(jià)值補(bǔ)充，被公認(rèn)為遺傳分析的有效標(biāo)記系統(tǒng)，且InDel標(biāo)記具有密度大、可快速和經(jīng)濟(jì)有效地進(jìn)行基因分型等優(yōu)點(diǎn)[34]。以往有關(guān)魚類耐低氧性狀分子標(biāo)記篩選研究大多集中在SNP上，很少有關(guān)于篩選InDel標(biāo)記的報(bào)道[32-33]。本研究利用重測(cè)序技術(shù)對(duì)100尾卵形鯧鲹進(jìn)行測(cè)序，獲得了693.48 Gb的測(cè)序數(shù)據(jù)，其中Q30 (正確識(shí)別率大于99.9%的堿基占總體堿基的百分比)平均值為90.8%，測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)量主要分布在Q30(≥80%)，這樣能夠保證后續(xù)分析的正常進(jìn)行。在此基礎(chǔ)上，計(jì)算了InDel位點(diǎn)在基因組上的平均分布密度為3 972.1 InDel·Mb-1，高密度的InDel位點(diǎn)為挖掘與耐低氧性狀關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)提供了基礎(chǔ)。通過對(duì)InDel在基因組位置的注釋發(fā)現(xiàn)，大部分In-Del位點(diǎn)位于基因間和內(nèi)含子上 (70.5%)，只有極少的InDel位點(diǎn)位于外顯子上 (0.7%)，證明編碼區(qū)的InDel位點(diǎn)數(shù)量較少，這與之前SNP在基因組上的分布情況一致[35]。這種分布模式不僅存在于卵形鯧鲹中，在獅頭鵝 (Shitou goose)、陸地棉(Gossypium hirsutum) 等生物中也表現(xiàn)出相同的分布模式[36-37]，位于非編碼區(qū)的InDel位點(diǎn)多于位于編碼區(qū)的數(shù)量，這一結(jié)果符合生物學(xué)特性。

通過對(duì)敏感組和耐受組的InDel位點(diǎn)進(jìn)行分析，獲得了249 395個(gè)耐受組特有的InDel位點(diǎn)，其中2 209個(gè)位于外顯子上，涉及543個(gè)基因。在此基礎(chǔ)上對(duì)這些基因進(jìn)行功能注釋，發(fā)現(xiàn)核苷酸切除修復(fù)信號(hào)通路和細(xì)胞黏著分子中均有InDel變異。核苷酸切除修復(fù)是4條DNA損傷修復(fù)的基本途徑之一。本研究中發(fā)現(xiàn)rpa1、ercc3和pold3這3個(gè)基因富集到這條通路上，rpa1基因編碼異三聚體復(fù)制蛋白A復(fù)合物的最大亞基，它與單鏈DNA結(jié)合，形成一個(gè)核蛋白復(fù)合物，在DNA代謝中發(fā)揮重要作用，參與DNA復(fù)制、修復(fù)[38]。pold3基因編碼DNA聚合酶delta的66-kD亞基，DNA聚合酶delta具有聚合酶和3'—5'外切酶活性，在DNA復(fù)制和修復(fù)中起著關(guān)鍵作用[39]。位于這些在DNA復(fù)制和修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用的基因上的InDel位點(diǎn)，可能影響了卵形鯧鲹的耐低氧能力。另一較多基因富集的信號(hào)通路細(xì)胞黏著分子是一種表達(dá)于細(xì)胞表面的蛋白，參與細(xì)胞的活化和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物過程[40]，這些信號(hào)中的變異基因可能影響了低氧環(huán)境下卵形鯧鲹信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的能力。

采用與敏感組比較、對(duì)耐受組所特有的位于外顯子上的InDel進(jìn)行基因注釋的方法，獲得的位點(diǎn)信息多，注釋的基因數(shù)量大，僅依靠基因通路和基因功能等信息難以獲得可靠的InDel位點(diǎn)用于分子標(biāo)記的開發(fā)。InDel雖然在基因組上分布廣泛，但在魚類分子標(biāo)記的開發(fā)中主要集中在SNP上，對(duì)InDel的關(guān)注很少，但也有利用InDel位點(diǎn)對(duì)斑節(jié)對(duì)蝦 (Penaeus monodon) 早期性別鑒定的應(yīng)用[41]。雖然在魚類中仍無(wú)利用線性混合模型篩選與性狀顯著關(guān)聯(lián)的InDel的研究，但已有在芝麻 (Sesamum indicum)、山羊 (Capra hircus) 等動(dòng)植物中[42-43]的研究，利用全基因組關(guān)聯(lián)分析 (Genome wide association study, GWAS) 的線性混合模型將InDel位點(diǎn)與表型信息關(guān)聯(lián)，挖掘與表型信息顯著關(guān)聯(lián)的In-Del位點(diǎn)，Yang等[44]也利用全基因組關(guān)聯(lián)分析的方法篩選到了南丹瑤雞與雞冠性狀顯著相關(guān)的In-Del位點(diǎn)。證明利用線性混合模型將InDel位點(diǎn)與性狀關(guān)聯(lián)的可行性。本研究為了篩選與耐低氧性狀顯著相關(guān)的InDel位點(diǎn)，首先利用InDel位點(diǎn)進(jìn)行了主成分分析和親緣關(guān)系分析。通過主成分分析，主成分因子1和2大致將實(shí)驗(yàn)群體分為5個(gè)群體，親緣關(guān)系分析顯示實(shí)驗(yàn)群體的親緣關(guān)系大部分介于-0.1～0.3，這與San等[35]利用SNP分析的結(jié)果一致，保證了后續(xù)關(guān)聯(lián)分析的準(zhǔn)確性。在關(guān)聯(lián)分析的結(jié)果中，InDel位點(diǎn)的P觀察值和期望值相同，說(shuō)明分析模型是合理的。但所有的P觀測(cè)值均未明顯超過期望值，說(shuō)明分析結(jié)果未找到與耐低氧性狀顯著關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)，這可能是因?yàn)槟偷脱跣誀钍怯晌⑿Ф嗷蚩刂频?，單個(gè)變異位點(diǎn)效應(yīng)對(duì)性狀的影響弱，不能達(dá)到顯著性閾值；也可能是因?yàn)槿后w樣本量小，本研究采用重測(cè)序的方法對(duì)InDel分型，成本雖然高但可以挖掘稀有變異，所以只對(duì)極端表型值的100尾個(gè)體進(jìn)行了重測(cè)序，樣本量偏小影響了檢驗(yàn)效能。關(guān)聯(lián)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，沒有位點(diǎn)達(dá)到顯著性閾值，但有3個(gè)InDel位點(diǎn)接近顯著性閾值，仍具有開發(fā)分子標(biāo)記的價(jià)值。通過對(duì)顯著性位點(diǎn)上下游50 kb的基因序列注釋，共注釋到9個(gè)候選基因，其中Acot7對(duì)中、長(zhǎng)鏈脂酰輔酶a具有較高的酶活性。對(duì)小鼠 (Mus musculus) 的研究發(fā)現(xiàn)，Acot7具有保護(hù)神經(jīng)元免受脂肪酸毒性的作用[45]。Lrfn2b編碼一個(gè)突觸黏附樣分子，在小鼠中Lrfn2b可能通過對(duì)n-甲基-d-天冬氨酸 (N-methyl-D- aspartate, NMDA) 受體的調(diào)節(jié)作用來(lái)調(diào)控紅細(xì)胞生成[46]。由此推測(cè)這2個(gè)基因可能在卵形鯧鲹抵抗低氧環(huán)境的過程中發(fā)揮作用。Mpp4編碼的蛋白是鳥苷酸激酶家族中的一種視網(wǎng)膜特異性支架蛋白，參與組織光感受器帶狀突觸中的突觸前蛋白復(fù)合物[47]。Gpr135編碼一個(gè)完整的膜蛋白，屬于G蛋白偶聯(lián)受體的A類視紫紅質(zhì)超家族，在大鼠 (Rattus norvegicus) 中敲除后其食物攝入量受到影響[48]。Als2編碼的蛋白可以激活GTPases的Ras超家族成員，研究發(fā)現(xiàn)als2基因被敲除的斑馬魚(Danio rerio) 出現(xiàn)了嚴(yán)重的發(fā)育異常、游泳障礙和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元紊亂[49]。Tmem237b編碼一種四跨膜蛋白，影響斑馬魚的胚胎發(fā)育[50]。這4個(gè)候選基因在低氧脅迫下發(fā)揮的功能仍需進(jìn)一步研究。

綜上所述，卵形鯧鲹在低氧環(huán)境下，核苷酸切除修復(fù)信號(hào)通路和細(xì)胞黏著分子可能發(fā)揮了重要作用。通過InDel位點(diǎn)與耐低氧性狀的關(guān)聯(lián)分析，挖掘到了3個(gè)與選耐低氧能力相關(guān)的InDel位點(diǎn)，并對(duì)篩選到的InDel位點(diǎn)進(jìn)行基因注釋獲得了9個(gè)候選基因。篩選到的InDel位點(diǎn)對(duì)后期分子標(biāo)記選擇育種的選擇和鑒定有重要價(jià)值，注釋到的候選基因?yàn)槁研析K鲹耐低氧的機(jī)理研究提供了依據(jù)。