溶瘤性流感病毒的研究進展*

梁 亮 唐 磊 石華冉 方中岳 歐 霞 楊 帆 張繼虹 楊景暉

（1）昆明理工大學醫(yī)學院，昆明 650500；2）云南省第一人民醫(yī)院，昆明 650032）

惡性腫瘤是目前重大疾病中發(fā)病率最高的疾病。世界衛(wèi)生組織癌癥研究機構（IARC）發(fā)布的最新數(shù)據(jù)稱，2020年全球有1 930萬癌癥新發(fā)病例，近1 000萬患者死于癌癥［1］。研發(fā)新型的抗腫瘤藥物一直是推動腫瘤針對性治療的動力。溶瘤病毒（oncolytic virus，OVs）是一類新的治療藥物，通過選擇性殺傷腫瘤細胞和誘導全身抗腫瘤免疫的雙重作用機制實現(xiàn)抗腫瘤效果。目前已研究了多種病毒，其中常用的病毒包括腺病毒、痘苗病毒、皰疹病毒、呼腸孤病毒、細小病毒、新城疫病毒、柯薩奇病毒等用作溶瘤治療，且已應用于臨床并取得了良好的治療效果［2］。隨著溶瘤病毒的不斷發(fā)展，目前已有4種溶瘤病毒獲批準上市，分別是：Rigvir?、Oncorine?、Imlygic?和Delytact?。其中最新獲批的Delytact?是日本第一三共株式會社和東京大學聯(lián)合開發(fā)的一款針對神經(jīng)膠質(zhì)瘤的溶瘤病毒，其是通過基因工程方法敲除γ34.5、ICP6、α47基因的單純皰疹病毒［3］，該病毒分別減弱了病毒的致病性、加強了靶向性、增強了病毒復制率，于2021年在日本被厚生勞動省批準上市，成為全球首款針對腦部腫瘤的溶瘤病毒產(chǎn)品［4］。而自1900年代首次發(fā)現(xiàn)流行性感冒病毒（influenza virus）簡稱流感病毒，可能作為“有益”的病毒緩解白血病病情以來，不斷有研究證明其具有殺傷腫瘤細胞的能力。

流感病毒屬于正粘病毒科（Orthomyxoviridae），是一類有包膜的單股負鏈RNA病毒，在世界范圍內(nèi)流行。人類在對抗流感的過程中做了諸多嘗試，分別成功研發(fā)出了滅活疫苗、減毒活疫苗和亞單位重組等類型的流感疫苗，這些經(jīng)驗為進一步以流感病毒為基礎構建溶瘤病毒積累了寶貴的經(jīng)驗［5］。流感病毒是最早一批用于治療癌癥的病毒，在作為溶瘤病毒方面有著很大的潛力，經(jīng)過自然選育或反向遺傳學修飾后可形成對人致病能力較弱的減毒株［6］，并可利用完善的疫苗生產(chǎn)優(yōu)勢在雞胚中大規(guī)模制造，且流感病毒的基因片段及產(chǎn)物的功能是明確已知的。流感病毒作為RNA病毒其基因不會整合至宿主基因上。隨著現(xiàn)代生物學的發(fā)展，針對溶瘤流感病毒的機制研究也越發(fā)深入，目前溶瘤流感病毒的作用方式可以總結為以下3點：a.病毒直接裂解腫瘤細胞；b.病毒激活機體免疫來殺傷腫瘤細胞；c.病毒作為載體表達外源基因提高上述兩種能力?，F(xiàn)將近年來流感病毒溶瘤的進展進行綜述。

1 溶瘤流感病毒直接裂解腫瘤細胞

流感病毒對腫瘤細胞的致細胞病變效應是能夠觀察到的最直接的溶瘤結果，這與流感病毒感染癌細胞并復制出大量子代病毒使癌細胞裂解的特點有關。和流感病毒感染宿主細胞的過程一致，當流感病毒感染細胞時，流感病毒的血凝素通過吸附宿主細胞表面唾液酸受體以胞飲的方式進入細胞，病毒囊膜與細胞膜融合后釋放病毒核酸并進行轉錄和復制。流感病毒的蛋白質(zhì)合成后開始進行病毒組裝，最后成熟的子代病毒通過出芽的方式釋放，此過程中使細胞發(fā)生裂解死亡。流感病毒感染腫瘤細胞的結果是相同的（圖1a）。

1.1 流感病毒感染腫瘤細胞

流感病毒特異性識別腫瘤靶細胞是進行溶瘤治療的第一步，流感病毒的血凝素蛋白HA（hemagglutinin，HA）與病毒識別宿主細胞高度相關［7］。研究發(fā)現(xiàn)，在結直腸癌、宮頸癌、乳腺癌等多發(fā)惡性腫瘤的細胞表面，唾液酸含量及種類顯著高于正常細胞，腫瘤細胞唾液酸化的增加常表現(xiàn)為唾液酸基以特異的α-2,3、α-2,6糖苷鍵與乳糖胺Galβ1~4 GluNAc單位相連。腫瘤中存在的唾液酸修飾異常主要是由唾液酸轉移酶表達異常引起的，由于人體中缺乏CMP-Neu5Ac羥化酶基因，在成人的正常細胞中沒有Neu5Gc結構，但部分腫瘤包括結腸癌組織中常具有Neu5Gc，可以作為一種腫瘤治療的特異性靶點［8］。流感病毒通過表面血凝素蛋白HA的末端結構為唾液酸受體（SAα-2,3和SAα-2,6）介導病毒與腫瘤細胞膜融合，故流感病毒對此類腫瘤細胞就具備很好的靶向性［9］。此外，HA蛋白的構象改變是病毒進入宿主細胞的必要步驟，胰蛋白酶或類似物（trypsin or trypsin-like serine proteases）通過結合HA蛋白的堿性裂解位點（basic cleavage site）使其形成合適的構象來結合宿主細胞表面的唾液酸受體［10-11］。Alain等［12］研究發(fā)現(xiàn)，大部分惡性腫瘤組織中由腫瘤自身或中性粒細胞或巨噬細胞等腫瘤微環(huán)境中的固有免疫細胞分泌的胰蛋白酶類似物（trypsin-like serine proteases）高表達。其中彈性蛋白酶在胰腺起源的腫瘤細胞中表達量又高于其他細胞。將部分非結構蛋白1（NS1）缺失（僅保留NS1前116位氨基酸）的PR8毒株中血凝素蛋白的胰蛋白酶切割位點替換為彈性蛋白酶后接種在異種胰腺導管腺癌移植瘤模型（PANC-1）和鼠黑色素瘤（B16）模型時觀察到了良好的療效［11］。

1.2 流感病毒在腫瘤細胞中復制

流感病毒感染宿主細胞后的復制需要病毒的NS1支持。NS1可阻斷Ⅰ型干擾素介導的抗病毒反應，是病毒編碼的一種毒力蛋白。干擾素誘導蛋白激酶R（IFN-induced protein kinase R，PKR）是誘導干染素產(chǎn)生抗病毒作用的一個重要刺激元件，活化形態(tài)的PKR能夠使真核細胞的轉錄因子2（eukaryotic translation factor 2，eIF2α）磷酸化進而阻斷病毒蛋白的合成而抑制病毒的復制［13］。

NS1蛋白能夠抑制宿主細胞基因表達并刺激病毒自身蛋白的轉錄和轉錄后調(diào)節(jié)［14］。NS1蛋白在細胞中的表達與多種作用有關：抑制mRNA的核質(zhì)轉運，抑制mRNA的前剪接和刺激病毒mRNA的翻譯，NS1與dsRNA結合并隨后阻斷dsRNA的激活，因此NS1蛋白可以作為細胞凋亡的抑制劑或誘導劑。流感病毒早期階段非結構蛋白NS1通過抑制被dsRNA（double-stranded RNA）激活的PKR細胞凋亡轉錄因子的連鎖激活效應和抑制IRF-3（IFN regulatory factor 3）并減少NF-κB（nuclear factor-κB）誘導的TNF-α釋放來拮抗細胞的凋亡。當NS1截短或缺失后，PKR、IRF-3、NF-κB激活干擾素所誘導的連鎖反應使流感病毒不能有效復制［15］（圖1）。

流感病毒感染癌細胞且不引起感染性疾病是溶瘤流感病毒的靶向要求。NS1截短的流感病毒可以特異地在RAS信號通路激活導致干擾素缺陷的腫瘤細胞中包裝復制且不影響人體正常細胞［16］。Muster等［16］已證實缺失NS1（delNS1）基因后的流感病毒在感染干擾素合成受抑制或RAS基因突變的腫瘤細胞后表現(xiàn)出高度的復制特異性，即僅在黑色素瘤、淋巴癌細胞中大量復制，而不在正常細胞中復制。在黑色素瘤細胞中，與表達野生型NS1蛋白病毒相比，delNS1顯示出更強的凋亡誘導作用。這是由于delNS1病毒對PI3K/AKT途徑的激活減少所致。并且在包括黑素瘤細胞在內(nèi)的惡性細胞中，PI3K/AKT的活化與腫瘤的進展和對抗腫瘤治療反應的增強有關［17］。B16-F10黑色素瘤細胞由于RAS基因的過度活化使得PKR去磷酸化抑制了IFN的產(chǎn)生而使病毒能在IFN-α、β缺陷的細胞中增殖［18-19］（圖1）。病毒在Vero細胞和其他宿主細胞中生長的差異能力是由于Vero細胞缺乏功能性干擾素的表達這一事實所致［20］。超過30%的腫瘤細胞由于RAS基因的激活而抑制了真核細胞起始激酶（eukaryotic initiation factor）并進一步阻止了PKR的活化［21］。研究發(fā)現(xiàn)所有癌癥亞型中約1/3的致癌大鼠肉瘤RAS基因突變導致PKR抑制［22］。并且NS1缺失的流感病毒可以靶向致癌性RAS突變的人518黑素瘤細胞的小鼠異種移植腫瘤模型［23］。驗證了以PKR依賴性方式將PR8流感病毒靶向RAS突變的腫瘤。Efferson等［24］研究發(fā)現(xiàn)，在RAS基因未激活的前列腺腫瘤細胞LNCap模型中，NS1基因缺失的流感病毒能誘導外周血單核細胞（PBMC）產(chǎn)生IFN-γ，與活化細胞毒性T淋巴細胞（CTL）產(chǎn)生的IL-12刺激病毒特異的CD8+T細胞，與NK細胞共同發(fā)揮細胞免疫效應來裂解腫瘤細胞（圖1）。

2 溶瘤病毒激活機體免疫來殺傷腫瘤細胞

溶瘤流感病毒不僅能在惡性腫瘤中復制，并且具有NS1缺失的甲型流感病毒比野生型病毒能更有效地刺激先天免疫來殺傷腫瘤。這是因為減毒與先天免疫系統(tǒng)病毒毒力因子缺失有關。NS1對免疫系統(tǒng)的抑制作用是多方面的。機體細胞存在先天免疫介質(zhì)，NS1顯示出抑制干擾素調(diào)節(jié)因子3（IRF3）和NF-κB。由于NS1缺失的甲型流感病毒能夠誘導強烈的PKR通路上調(diào)，因此下游信號傳導可能導致細胞膜上的鈣網(wǎng)蛋白（CALR）暴露。CALR充當DAMP的角色，導致PKR敏感癌癥中甲型流感病毒感染后凋亡小體的免疫原性增強［25-26］。在對NS1部分截斷的病毒增加了促炎基因的上調(diào)，但完整的NS1缺失導致表達進一步增加［27］。溶瘤流感病毒免疫刺激的效力與NS1缺失的長度相關，完全的NS1缺失導致病毒流產(chǎn)。因此，病毒促炎免疫刺激的水平和衰減的水平可以通過缺失的長度來滴定。實驗表明，NS1缺失到80或116個剩余氨基酸（去除效應結構域，但留下RNA結合結構域和一個核定位序列）誘導衰減和溶瘤效應之間的最佳平衡［16，28］。NS1的截斷減少了PKR途徑的抑制，同時保留對通過RIG-I途徑的免疫原性信號傳導的抑制。并且PKR和RIG-I都與I型干擾素的產(chǎn)生有關［29］。溶瘤病毒的主要免疫刺激與腫瘤相關抗原（TAA）的適應性T細胞反應相關。實驗顯示，NS1缺失病毒可用于刺激樹突狀細胞（DC），以通過交叉表達對惡性細胞產(chǎn)生T細胞反應［24，30］。T細胞的刺激可以通過暴露于delNS1病毒產(chǎn)生的病毒裂解物的DCs或通過將感染delNS1病毒的DCs暴露于腫瘤細胞裂解物來誘導。同樣，部分NS1缺失病毒比完全缺失NS1蛋白更有效。這些離體分析可能在某種程度上模擬溶瘤治療期間的體內(nèi)腫瘤微環(huán)境。免疫細胞暴露于溶瘤NS1缺失病毒也顯示出誘導外周血單核細胞（PMBC），包括T細胞、B細胞、單核細胞和自然殺傷（NK）細胞對各種癌細胞系的直接IFN依賴性細胞毒作用［31-32］（圖1）。

3 編碼抗癌基因的重組溶瘤流感病毒

OVs可以通過多種機制直接導致腫瘤細胞死亡，但不足以完全破壞腫瘤組織。與其他外源基因或其他治療策略的結合是增強治療效果的必要途徑。穩(wěn)定表達細胞因子的重組病毒的產(chǎn)生并且溶瘤性delNS1病毒基因組中外源基因的表達不會干擾其抗腫瘤活性［33］。

3.1 表達IL-2、IL-15的溶瘤流感病毒

目前研究指出，大部分的實體瘤缺乏CTL的浸潤，如何恢復有效的抗腫瘤免疫應答是近年來抗腫瘤治療的熱點之一。人白介素-2（IL-2）是一種免疫調(diào)節(jié)性T細胞衍生分子，是抗原激活T細胞的克隆擴增所必需的，能誘導T輔助和T殺傷細胞的增殖以及刺激T細胞產(chǎn)生其他細胞因子。此外，IL-2還可以激活B細胞、NK細胞和巨噬細胞［34］。Liu等［35］和Kittel等［36］構建了一種可以在細胞內(nèi)外源分泌的IL-2的重組流感病毒。病毒具有在小鼠肺部高效復制的特性，在較高劑量（2×105PFU/只）接種6周齡的小鼠后沒有造成小鼠的死亡，除了注射部位IL-2的分泌增高以外研究還發(fā)現(xiàn)，針對該改造病毒特異的T細胞免疫應答水平也大幅增高，這提示表達IL-2的重組病毒具有激活腫瘤免疫環(huán)境的能力。IL-15在固有免疫和適應性免疫方面具有多種功能，并在NK細胞和T細胞的分化和增殖中起主要作用［37］。為了提高溶瘤流感病毒的免疫刺激特性，Hock等［38］在NS1缺失的基礎上利用反向遺傳學技術讓病毒內(nèi)源性表達IL-15，體外研究結果顯示，改造后的病毒能刺激CD4+、CD8+T細胞的分化且促進STAT5A/B的磷酸化，并且在小鼠結腸癌組織處募集了大量的NK細胞與效應記憶T細胞，效應記憶T細胞產(chǎn)生的IFN-γ又能增強CD8+T細胞在腫瘤組織中的浸潤，改善腫瘤免疫微環(huán)境。無論是內(nèi)源還是外源表達的人白介素在通過流感病毒表達后都顯著延長了該蛋白質(zhì)在體內(nèi)的半衰期及局部濃度，并且大幅刺激機體產(chǎn)生IFN-γ、IL-4等其他細胞因子。

3.2 表達CTLA-4單鏈抗體的溶瘤流感病毒

CTLA-4是一種下調(diào)T細胞活化初始階段的抑制性受體，是檢查點抗體的初始目標。Yervoy?單抗藥物的獲批顯示出CTLA-4在腫瘤治療中的潛力。Hamilton等［39］設計表達該抗體的流感病毒，并證明編碼阻止免疫檢查點CTLA-4的單鏈抗體可增強流感病毒的抗癌活性。為了在病毒生命周期中表達抗體的具有復制能力的IAV，使用了聚合酶PB1和PA區(qū)段。為了從IAV表達9H10抗體，將重鏈和輕鏈基因都插入了IAV基因組中。重鏈基因被克隆到PB1下游。將豬破傷風病毒1（PTV-1）2A序列插入PB1和重鏈基因之間，以便進行PB1和重鏈蛋白的分離。另外，將IL-2信號肽序列克隆在2A和重鏈序列之間，以靶向新生的重鏈多肽并分泌。采用相同的策略將抗體的輕鏈表達在PA片段上。通過靶向免疫檢查點CTLA-4的單鏈可變片段的表達進一步增強了IAV的溶瘤能力。B16-F10黑色素瘤是一種高度侵襲性和轉移性癌癥模型，以其在體內(nèi)的快速生長而聞名［40］。瘤內(nèi)注射IAVCTLA-4可有效抑制B16-F10腫瘤的生長。此外，用IAV-CTLA-4進行治療可介導明顯的作用，從而延遲未經(jīng)治療的遠端腫瘤生長并延長了總生存期。

3.3 表達HER-2的溶瘤流感病毒

人類表皮生長因子受體2（HER-2/neu）為一具有免疫原性的糖蛋白，在卵巢癌、乳腺癌、胃癌等腫瘤細胞中存在并高表達，具有免疫原性的HER-2/neu肽可被CTL和TH識別，是腫瘤治療的重要靶點之一。Efferson等［41］以流感病毒A/PR/8/34的NA基因為裝載基因，將HER-2中9個氨基酸構成的CTL表位E75插入到NA的莖部區(qū)域，構建出重組流感病毒。感染該重組病毒的DC能產(chǎn)生高水平的IFN-α并激發(fā)外周血單核細胞，卵巢癌和乳腺癌患者相關的淋巴細胞對表達HER-2的腫瘤細胞產(chǎn)生特異性CTL效應，并分泌IFN-γ和IL-2。因此減毒性流感病毒能夠作為腫瘤抗原的遞呈載體，可行使腫瘤疫苗的作用具有獨特的應用價值［42］。

3.4 堿基突變使溶瘤流感病毒溶瘤能力增強

文中已敘述部分惡性腫瘤組織中胰蛋白酶類似物（elastase）高表達［12］。為了進一步將IAV靶向腫瘤，將胰蛋白酶切割位點改為了彈性蛋白酶切割 位 點。Kuznetsova等［11］將NS1基 因 截短 的A/Puerto Rico/8/34流感病毒的HA堿性裂解位點處的氨基酸序列由SIQSR343G344LFGA變?yōu)镾IQSPI343G344LFGA，選擇該切割位點是因為在腫瘤微環(huán)境中表達了酶。此外，先前已顯示切割位點的交換減弱了肺中病毒的生長。新產(chǎn)生的彈性蛋白酶激活的（elastase-activated）流感病毒AE病毒在腫瘤細胞中的生長效價與胰蛋白酶激活的（trypsin-activated）對 應 病 毒AT病 毒 相 似。向B16f1黑色素瘤衍生的小鼠體內(nèi)進行AE病毒的顱內(nèi)注射，與AT病毒相似，可減少腫瘤的生長，并且在異源人類PANC-1衍生的腫瘤中具有更好的治療效果。因此，在病毒HA中引入減毒標記“彈性蛋白酶切割位點”可以進行安全有效的溶瘤病毒治療。

3.5 表達GM-CSF的新型甲型流感病毒并在肝細胞癌中具有溶瘤作用

粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）是T細胞、NK細胞等免疫細胞分泌的單體糖蛋白?？梢源碳じ杉毎a(chǎn)生粒細胞和單核細胞，并在腫瘤治療中起到很好的治療效果。Yang等［43］以A/PR/8/34為母本，將GM-CSF編碼序列插入到流感非結構蛋白基因中，構建了delNS1-GM-CSF溶瘤病毒。delNS1-GM-CSF病毒通過感染MDCK、A549、SMCC7721和HepG2肝癌細胞在內(nèi)的各種細胞具有與野生型A/PR/8/34有著相同的病毒生長動力學。在4種肝癌細胞中（SMMC-7721、HepG2、MHCC97L、Huh7.5）細胞系中觀察到了病毒的細胞殺傷作用，而在正常肝細胞系LO2中未顯示出細胞毒性。在腫瘤內(nèi)注射病毒HepG2細胞構建的BALB/c裸鼠移植瘤模型后，重配delNS1-GM-CSF病毒顯著抑制了腫瘤的生長，在62例肝癌臨床樣品離體實驗中同樣觀察到了delNS1-GM-CSF的抑瘤作用［43］。

3.6 表達抗程序性細胞死亡1（PD-1）單克隆抗體的溶瘤流感病毒

PD-1是一種重要的免疫抑制分子，能夠下調(diào)免疫系統(tǒng)使腫瘤細胞獲得免疫逃逸。抗PD-1免疫檢查點抑制劑的應用成為抗腫瘤的治療方法［44］。Lei等［45］以流感病毒株A/PR/8/34為載體，將免疫檢查點抑制劑PD-1抗體基因插入到PR8病毒株PB1、PA片段后成功拯救出了溶瘤流感病毒rFlu-a PD1。用重組溶瘤流感病毒rFlu-a PD1感染正常肝細胞LO2、肝癌細胞系HepG2、SMCC-7721后發(fā)現(xiàn)顯著降低了肝癌細胞的細胞活力而對正常的肝細胞沒有明顯的殺傷作用。又通過流式細胞的方法檢測到rFlu-a PD1可誘導HepG2細胞凋亡。同時建立的肝癌PDX小鼠腫瘤經(jīng)過rFlu-a PD1治療后比對照組小鼠腫瘤體積有明顯縮小。重組溶瘤流感病毒rFlu-a PD1選擇性的感染腫瘤細胞，且大量復制并最終殺傷腫瘤細胞，成為肝癌免疫治療的新方法［45］。

4 總結和展望

OVs是一類新型的抗腫瘤藥物，通過靶向腫瘤細胞和誘導全身抗腫瘤免疫的雙重作用達到對腫瘤的殺傷效果。流感病毒具有作為溶瘤病毒的潛力，其不僅可以直接裂解腫瘤細胞并激活機體免疫來殺傷腫瘤細胞，也作為載體表達外源基因提高抗腫瘤靶向能力。雖然流感病毒作為危害人類身體健康主要致病原，但經(jīng)改造后具有安全遞送外源基因的能力，流感病毒在其復制周期中不包含DNA階段，因此排除了病毒基因整合到人類染色體的風險。溶瘤病毒的注射方法多為瘤內(nèi)注射，其他給藥途徑還需要進一步研究。不同流感病毒亞型的抗體往往具有較低的交叉保護能力，因此通過使用屬于不同抗原亞型的病毒載體來避免預存免疫也會是今后研究的一個方向，溶瘤流感病毒的多種亞型提供了多重溶瘤提供可能。最后，以T-VEC溶瘤病毒聯(lián)合檢查點抑制劑Yervoy、Keytruda等免疫療法取得的巨大成功提示更加合理地聯(lián)合溶瘤流感病毒與其他抗腫瘤治療方式可能會使溶瘤病毒有更加廣闊的應用前景［46］。