嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2膜蛋白對宿主細(xì)胞pre-mRNA 3'UTR加工的影響*

歐陽歆 曾先燕 谷 斌 婁哲琦 黃 進(jìn) 譚正宗 于 倩 車 雨 錢昱舟 朱 勇

（重慶醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)研究院，重慶 400016）

嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2），引發(fā)的新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）疫情仍然在全球范圍內(nèi)廣泛傳播，嚴(yán)重危害人類健康。SARSCoV-2是一種有包膜包被的單鏈RNA病毒，具有極高的傳染性［1］。SARS-CoV-2編碼4種結(jié)構(gòu)蛋白，包括S（spike）、M（membrane）、E（envelope）、N（nucleocapsid），其中M蛋白是一個(gè)跨膜蛋白，擁有兩個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，是SARS-CoV-2編碼的結(jié)構(gòu)蛋白中最豐富的蛋白質(zhì)，并且與多種病毒功能相關(guān)［2］。M蛋白具有高度保守的特性，因此適合作為COVID-19治療的藥物靶點(diǎn)［3］。現(xiàn)有研究表明，M蛋白可以通過干擾宿主細(xì)胞應(yīng)對病毒感染的重要細(xì)胞生物過程中關(guān)鍵因子的表達(dá)和功能，以幫助病毒逃避宿主免疫反應(yīng)的攻擊或者影響宿主細(xì)胞的存活［4-5］，但是其中具體分子機(jī)制仍需進(jìn)一步闡明。

Banerjee等［6］研究發(fā)現(xiàn)，SARS-CoV-2編碼的蛋白質(zhì)可通過與宿主RNA的相互作用，從轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后、翻譯和翻譯后調(diào)控等多個(gè)層面調(diào)控宿主基因表達(dá)，破壞這些重要的細(xì)胞功能可以抑制宿主抗病毒因子的產(chǎn)生和功能。轉(zhuǎn)錄后調(diào)控包括選擇性剪接和選擇性多聚腺苷酸化 （alternative polyadenylation，APA），APA是一種通過對premRNA 3'端進(jìn)行加工、調(diào)控基因的表達(dá)及功能的機(jī)制［7］。pre-mRNA 3'端加工可以發(fā)生在3'非翻譯區(qū)（untranslated regions，UTR）或者編碼區(qū)，主要包括兩個(gè)步驟，即切割和聚腺苷酸化［8］。大約70%的人類pre-mRNA上有多個(gè)polyA位點(diǎn)，由premRNA上的序列元件和APA調(diào)控因子相互作用決定選擇不同位置的polyA位點(diǎn)，由此產(chǎn)生具有不同3'UTR長度的mRNA亞型。mRNA的穩(wěn)定性、定位和翻譯效率很大程度受3'UTR長度影響，因?yàn)?'UTR存在一系列特殊的序列元件，如miRNA和RNA結(jié)合蛋白位點(diǎn)［7-10］。近期，有研究發(fā)現(xiàn)，COVID-19患者大多數(shù)基因發(fā)生動(dòng)態(tài)APA事件且呈現(xiàn)3'UTR縮短，并且這些基因富集于抗病毒免疫反應(yīng)中，揭示了APA在SARS-CoV-2調(diào)節(jié)宿主抗病毒免疫反應(yīng)中的作用［11］。但目前關(guān)于SARS-CoV-2編碼的蛋白質(zhì)對宿主pre-mRNA 3'端加工影響的研究甚少。深入研究SARS-CoV-2編碼的蛋白質(zhì)對宿主pre-mRNA 3'UTR加工的影響，有利于闡明病毒致病機(jī)制，以及制定針對性治療策略。

本研究利用RNA-Seq和生物信息學(xué)等方法，分析SARS-CoV-2膜蛋白對宿主細(xì)胞pre-mRNA 3'UTR加工的影響，以及發(fā)生APA事件的基因表達(dá)和功能的變化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系與質(zhì)粒

本研究使用的人肺上皮細(xì)胞A549和過表達(dá)SARS-CoV-2膜蛋白質(zhì)粒pcDNA3.1-M-3×flag來源于重慶醫(yī)科大學(xué)感染實(shí)驗(yàn)室林永教授課題組。pcDNA3.1質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑

胎牛血清（以色列BI公司）；DMEM培養(yǎng)基、胰酶、青霉素鏈霉素（美國gibco公司）；轉(zhuǎn)染試劑PEI（美國polysciences公司）；Trizol（美國Thermo公司）；5×SDS-PAGE蛋白質(zhì)上樣緩沖液、脫脂奶粉、RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑、50×磷酸酶抑制劑、化學(xué)發(fā)光液（北京碧云天公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國abcam公司）；蛋白質(zhì)預(yù)染marker（美國proteintech公司）；SYBR（美國Thermo公司）；AKT1、Phospho-AKT1（Thr450）抗體（成都正能生物公司）；β-actin抗體（美國Proteintech公司）；anti-flag抗體（美國Bethyl公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

A549細(xì)胞培養(yǎng)使用含有10%胎牛血清、1%雙抗（青霉素-鏈霉素）的DMEM培養(yǎng)基，在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)37℃，5%CO2培養(yǎng)。

線上活動(dòng)。一是配合電臺(tái)早晚上下班高峰節(jié)目互動(dòng)話題，欄目設(shè)計(jì)有獎(jiǎng)問答環(huán)節(jié)，制作播出訪談節(jié)目，三局相關(guān)人員分別上線，通過與受眾第一時(shí)間互動(dòng)達(dá)到政策法規(guī)宣傳效果。二是制作“聽眾話國策”“大咖話國策”和“主播話國策”電臺(tái)宣傳視頻。三是發(fā)動(dòng)新媒體宣傳，聯(lián)合FM106.4經(jīng)典車電臺(tái)、慈溪發(fā)布、青春慈溪、慈溪衛(wèi)生和計(jì)劃生育、慈溪法治國土、慈溪環(huán)保微信公眾平臺(tái)跟蹤報(bào)道，發(fā)布最新消息，拓寬宣傳面和受眾面。

1.2.2 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染

提前24 h以每孔3.5×105個(gè)細(xì)胞的數(shù)量將細(xì)胞種至六孔板內(nèi)。在細(xì)胞狀態(tài)良好，并且生長至40%密度時(shí)開始轉(zhuǎn)染。首先將六孔板內(nèi)細(xì)胞的完全培養(yǎng)基換成無血清無雙抗的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。將轉(zhuǎn)染試劑PEI和質(zhì)粒稀釋液混合，室溫孵育15 min后逐滴加入各孔內(nèi)，6~8 h后換成完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3 蛋白質(zhì)免疫印跡（Western blot）實(shí)驗(yàn)

用含有1%蛋白酶抑制劑、2%50×磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上裂解細(xì)胞30 min，加入5×SDS-PAGE蛋白質(zhì)上樣緩沖液，95℃高溫變性10 min。電泳時(shí)分別使用70 V和110 V恒壓跑濃縮膠和分離膠；在冰水浴中，使用100 V恒壓，100 min的條件轉(zhuǎn)膜。用5%脫脂牛奶封閉2 h。按照相應(yīng)分子質(zhì)量切下條帶，4℃孵育一抗過夜。次日根據(jù)一抗種屬孵育二抗。在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)上對蛋白質(zhì)條帶進(jìn)行曝光成像。

1.2.4 RT-qPCR實(shí)驗(yàn)

按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書步驟將提取好的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。RT-qPCR采用10μl體系，SYBR 5μl，正 向 引 物0.4μl，反 向 引 物0.4μl，cDNA 2μl，H2O 2.2μl。每個(gè)基因設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。最后結(jié)果分析采用2-ΔΔCt計(jì)算相對定量。RT-qPCR引物如表1所示。

Table1 Primers for RT-qPCR

1.2.5 生物信息學(xué)分析

RNA-Seq測序由北京諾禾致源公司完成，在Illumina平臺(tái)上進(jìn)行。使用工具包APAlyzer［12］對RNA-Seq數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到發(fā)生APA事件的基因。本研究主要分析3'UTR區(qū)域APA，使用每個(gè)基因3'UTR上第一個(gè)和最后一個(gè)多聚腺苷酸化位點(diǎn)［12］。每個(gè)基因3'UTR的APA可以由一個(gè)相對表達(dá)量（relative expression，RE）分?jǐn)?shù)表示，此相對表達(dá)量分?jǐn)?shù)計(jì)算式為log2（RDaUTR/RDcUTR），其中RDcUTR代表在終止子到3'UTR上第一個(gè)polyA位點(diǎn)的區(qū)域內(nèi)匹配的序列數(shù)比上這段區(qū)域的長度，RDaUTR代表在3'UTR上第一個(gè)polyA位點(diǎn)到最后一個(gè)polyA位點(diǎn)的區(qū)域內(nèi)匹配的序列數(shù)比上這段區(qū)域的長度。一個(gè)基因在兩個(gè)樣本之間的差異用RE差 異（RE difference，RED）來 表 示［12］。APAlyzer的輸出結(jié)果包括4列，分別是“gene symbol”、“RED”、“P-value”、“APAreg”。在“APAreg”中定義了3種類型，“UP”表示實(shí)驗(yàn)組aUTR讀數(shù)豐度至少比對照組高5%，且“P-value”<0.05，“DN”表示實(shí)驗(yàn)組aUTR讀數(shù)豐度至少比對照組低5%，且“P-value”<0.05，“NC”表示剩余的基因?！癠P”表示3'UTR延長，“DN”表示3'UTR縮短（https://bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/APAlyzer/inst/doc/APAlyzer.html）。使用R語言ggpubr軟件包繪制發(fā)生APA事件的基因的火山圖。使用deepTools將得到的bam文件轉(zhuǎn)換bigWig格式文件［13］，在IGV軟件（2.11.1）里進(jìn)行可視化。Matescape數(shù)據(jù)庫［14］進(jìn)行功能富集分析。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用Excel、GraphPad 8.0、R 4.1.3軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間的差異顯著性統(tǒng)計(jì)使用t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 構(gòu)建外源表達(dá)SARS-CoV-2膜蛋白細(xì)胞模型

利用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)分別將pcDNA3.1質(zhì)粒和帶3×flag標(biāo)簽的SARS-CoV-2 M蛋白表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入A549細(xì)胞內(nèi)，轉(zhuǎn)染后24 h收取細(xì)胞提取總蛋白質(zhì)和總RNA，使用Western blot和RT-qPCR技術(shù)檢測M蛋白（圖1a，b）和M蛋白的mRNA（圖1c）表達(dá)情況。結(jié)果顯示，M蛋白及M蛋白的mRNA在A549細(xì)胞中表達(dá)，說明該模型成功，可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 篩選發(fā)生APA事件的基因

將上述收取的RNA進(jìn)行RNA-Seq高通量測序，對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，使用R軟件包APAlyzer描繪宿主細(xì)胞APA事件［12］。將APA在實(shí)驗(yàn)組與對照組中的差異程度量化為RED的變化，RED>0且定義為“UP”的基因則為3'UTR延長，RED<0且定義為“DN”的基因則為3'UTR縮短。以P<0.05和|RED|>0為條件，篩選顯著發(fā)生APA事件的基因。共篩選出813個(gè)發(fā)生APA事件的基因，其中3'UTR延長的基因有444個(gè)，3'UTR縮短的基因有369個(gè)。繪制發(fā)生APA事件的基因的火山圖，圖中紅點(diǎn)表示“UP”即3'UTR延長的基因，藍(lán)點(diǎn)表示“DN”即3'UTR縮短的基因（圖2）。圖中縱軸尺度調(diào)整為0~20，標(biāo)注P值排序前五的基因。結(jié)果顯示，M蛋白外源表達(dá)后影響宿主細(xì)胞pre-mRNA 3'UTR加工，且多數(shù)基因3'UTR延長（54.6%）。

2.3 差異APA基因的GO和KEGG分析

對差異APA基因進(jìn)行功能富集分析，以P<0.01作為顯著富集閾值，圖中選取Top10的富集項(xiàng)進(jìn)行展示，橫坐標(biāo)代表富集項(xiàng)的顯著性，縱坐標(biāo)為富集項(xiàng)的ID和名稱，紅色標(biāo)注的條目代表本文感興趣的條目或者已有研究報(bào)道M蛋白在其中發(fā)揮作用。結(jié)果顯示，3'UTR延長的差異APA基因廣泛參與有絲分裂細(xì)胞周期、調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)應(yīng)激、mRNA加工等生物過程（圖3a），涉及病毒感染、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上蛋白質(zhì)加工等信號(hào)通路（圖3b）。3'UTR縮短的差異APA基因參與核糖核蛋白復(fù)合物的生物合成、mRNA代謝過程、細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)運(yùn)輸?shù)壬镞^程（圖3c），涉及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上蛋白質(zhì)加工、細(xì)胞周期、凋亡等信號(hào)通路（圖3d）?？傮w來說，SARS-CoV-2 M蛋白影響宿主細(xì)胞內(nèi)與細(xì)胞增殖存活、應(yīng)對病毒感染、基因表達(dá)調(diào)控以及蛋白質(zhì)合成加工相關(guān)生物過程的基因的3'UTR加工。

以上富集項(xiàng)發(fā)現(xiàn)AKT1（AKT serine/threonine kinase 1）基因包含在多種生物學(xué)過程及信號(hào)通路，包括細(xì)胞周期的調(diào)控、細(xì)胞內(nèi)定位的調(diào)控、病毒感染等（表2）。其所編碼的蛋白質(zhì)AKT1是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（serine threonine protein kinase，AKT）家族中的一員，是磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/AKT信號(hào)通路中的核心因子，發(fā)揮抑制凋亡、促進(jìn)細(xì)胞增殖、參與免疫和炎癥反應(yīng)的作用［15-16］。有研究發(fā)現(xiàn)，AKT1在SARS-CoV-2感染的動(dòng)物模型及患者肺部樣本呈現(xiàn)被激活狀態(tài)，并且介導(dǎo)抑制宿主細(xì)胞的自噬［17］。

2.4 AKT1基因的3'UTR延長

本文使用IGV軟件查看AKT1基因3'UTR的變化。根據(jù)polyA位點(diǎn)相對于編碼區(qū)的位置，靠近編碼區(qū)的polyA位點(diǎn)定義為近端polyA位點(diǎn)，簡稱近端，遠(yuǎn)離編碼區(qū)的polyA位點(diǎn)定義為遠(yuǎn)端polyA位點(diǎn)，簡稱遠(yuǎn)端。圖中d表示遠(yuǎn)端（distal），p表示近端（proximal），紅色箭頭指示M蛋白實(shí)驗(yàn)組AKT1基因的3'UTR上polyA位點(diǎn)由近端向遠(yuǎn)端移動(dòng)（圖4a）。如圖4b所示，分別在AKT1基因的3'UTR區(qū)的近端和遠(yuǎn)端設(shè)計(jì)引物。利用RT-qPCR技術(shù)，以遠(yuǎn)端作為參照，計(jì)算得出近端相對遠(yuǎn)端的RNA表達(dá)水平（圖4c）。如圖中所示M蛋白實(shí)驗(yàn)組proximal/distal相比于對照組降低（P<0.01），說明AKT1 mRNA 3'UTR遠(yuǎn)端的RNA表達(dá)水平高于近端的RNA表達(dá)水平，表示在實(shí)驗(yàn)組中AKT1 mRNA的3'UTR延長。

2.5 AKT1蛋白表達(dá)水平及磷酸化情況

Western blot法檢測AKT1的蛋白質(zhì)表達(dá)、功能活化即磷酸化情況（磷酸化位點(diǎn)為Thr450）（圖5a）。在過表達(dá)M蛋白實(shí)驗(yàn)組AKT1蛋白表達(dá)水平無明顯變化，而AKT1磷酸化水平升高，說明AKT1被激活。以β-actin為內(nèi)參，對Western blot結(jié)果進(jìn)行半定量分析，計(jì)算M蛋白實(shí)驗(yàn)組p-AKT1與pcDNA3.1對照組p-AKT1相對蛋白質(zhì)表達(dá)水平，AKT1磷酸化水平明顯升高（P<0.01）（圖5b）。

3 討 論

SARS-CoV-2仍在全球肆虐橫行，危害人類生命健康。感染SARS-CoV-2后將會(huì)引發(fā)宿主產(chǎn)生過度的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致患者肺部嚴(yán)重?fù)p傷，進(jìn)而引起呼吸衰竭是患者死亡的重要原因［18］。因此深入探索其致病機(jī)制，以及制定更好地治療策略刻不容緩。

已有研究報(bào)道SARS-CoV-2編碼的蛋白質(zhì)可通過與宿主RNA的相互作用，從轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后、翻譯和翻譯后調(diào)控等多個(gè)層面調(diào)控宿主基因表達(dá)，如NSP16抑制 宿主RNA剪 接、NSP1抑制mRNA翻譯，以及NSP8和NSP9阻斷蛋白質(zhì)的運(yùn)輸，破壞這些重要的細(xì)胞功能可以抑制宿主抗病毒因子的產(chǎn)生和功能［6］。作為轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中一種重要的機(jī)制，APA通過對pre-mRNA進(jìn)行加工，產(chǎn)生不同3'UTR長度的mRNA亞型，影響基因或蛋白質(zhì)的表達(dá)和功能［7］。但目前尚未有研究探討SARS-CoV-2編碼蛋白對宿主pre-mRNA 3'UTR加工的影響。

本研究針對SARS-CoV-2編碼蛋白中表達(dá)豐富且高度保守的M蛋白，分析M蛋白對宿主細(xì)胞pre-mRNA 3'UTR加工的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，M蛋白外源表達(dá)后影響宿主細(xì)胞pre-mRNA 3'UTR加工，且多數(shù)基因3'UTR延長。此結(jié)果與An等［11］的研究結(jié)果相悖，但是An等的研究結(jié)論是利用COVID-19患者外周血樣本的RNA-Seq數(shù)據(jù)分析得出，由于樣本以及病毒感染的完整性不同可能導(dǎo)致了結(jié)果的差異性。此外，本文研究發(fā)現(xiàn)參與多種病毒性生物過程及信號(hào)通路的關(guān)鍵調(diào)控因子AKT1的3'UTR加工受到影響，但是其蛋白質(zhì)水平并未發(fā)生改變。根據(jù)目前已有文獻(xiàn)報(bào)道，APA不僅僅影響基因的表達(dá)，大約一半的人類基因使用APA生成3'UTR長度不同的mRNA轉(zhuǎn)錄本，同時(shí)產(chǎn)生相同的蛋白質(zhì)，但是蛋白質(zhì)的功能和定位被改變［19］。因此，APA能夠在不改變氨基酸序列的情況下，促進(jìn)蛋白質(zhì)功能的多樣性。AKT1的3'UTR長度改變對其功能的影響仍需進(jìn)一步探索。另外，本文發(fā)現(xiàn)在表達(dá)SARS-CoV-2 M蛋白的細(xì)胞內(nèi)AKT1蛋白功能被激活。有研究報(bào)道，在SARS-CoV-2感染后，發(fā)現(xiàn)AKT1被激活，進(jìn)而導(dǎo)致AKT/mTOR/HIF-1信號(hào)通路失調(diào)［20］、宿主細(xì)胞自噬受到抑制［17］、促炎趨化因子被激活上調(diào)［21］。PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路也被報(bào)道參與肺損傷、肺纖維化以及免疫細(xì)胞的發(fā)育等［22-24］。因此AKT1在SARS-CoV-2感染中具有重要意義，仍需進(jìn)一步探索M蛋白影響AKT1 3'UTR加工的機(jī)制。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)SARS-CoV-2 M蛋白在肺上皮細(xì)胞系A(chǔ)549內(nèi)外源表達(dá)后影響宿主細(xì)胞中與細(xì)胞增殖存活、應(yīng)對病毒感染、基因表達(dá)調(diào)控以及蛋白質(zhì)合成加工相關(guān)的基因pre-mRNA 3'UTR加工，驗(yàn)證了其中參與多種病毒性生物過程及信號(hào)通路的關(guān)鍵調(diào)控因子AKT1的3'UTR變化，及其蛋白質(zhì)功能被激活。本研究為更加深入理解SARS-CoV-2的致病機(jī)制提供了研究基礎(chǔ)。

致謝感謝重慶醫(yī)科大學(xué)感染實(shí)驗(yàn)室林永教授惠贈(zèng)本研究所需的重要實(shí)驗(yàn)材料。