類胡蘿卜素降解對枸杞酒特征香氣的影響

田爭福， 申鵬森， 趙 璐， 張惠玲*

（1.寧夏大學(xué) 食品與葡萄酒學(xué)院，寧夏 銀川 750021；2.寧夏食品微生物應(yīng)用技術(shù)與安全控制重點實驗室，寧夏銀川 750021）

枸杞作為寧夏特色農(nóng)產(chǎn)品，其營養(yǎng)價值和藥理活性受到醫(yī)學(xué)專家和養(yǎng)生專家的高度重視[1-2]。枸杞酒作為枸杞加工后主要產(chǎn)品之一，保健作用和營養(yǎng)價值深受人們青睞，這種觀念促進了枸杞酒產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展。類胡蘿卜素是枸杞中重要的天然色素和抗氧化物，在枸杞酒的釀造過程中由于受到光照、氧化、高溫等因素的影響，導(dǎo)致枸杞中類胡蘿卜素降解，還有大量的類胡蘿卜素在枸杞渣中并未得到利用[3-5]。周廣志等通過枸杞汁的前處理，利用HPLC測定了果膠酶、二氧化硫添加量及高壓滅菌對枸杞酒中類胡蘿卜素含量的影響[6]。王琦等通過測定枸杞酒發(fā)酵過程中類胡蘿卜素降解產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)10余種降異戊二烯類化合物對枸杞酒香氣有特殊的貢獻[7]。趙璐等在氧化、光照等方法下處理枸杞，表明枸杞渣中的類胡蘿卜素未得到有效利用，降異戊二烯類化合物在類胡蘿卜素中獲得率較低[8]。

目前，對于枸杞渣中類胡蘿卜素利用方面的研究較少[9-11]。作者采用一株可降解類胡蘿卜素的庫特氏菌進行實驗，以3種方式降解類胡蘿卜素，研究類胡蘿卜素降解產(chǎn)物對枸杞酒特征香氣的影響，為進一步探索類胡蘿卜素降解產(chǎn)物對枸杞酒的特征香氣影響提供了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

庫特氏菌（Kurthia sp.）GQ-16：作者所在實驗室分離保藏；法國釀酒干酵母：法國Lamothe-Abiet公司產(chǎn)品；干枸杞果：寧夏百瑞源枸杞產(chǎn)業(yè)發(fā)展有限公司產(chǎn)品；白砂糖（食品級）：購自當?shù)爻?；?胡蘿卜素標準品（純度＞98%）：成都曼思特生物科技有限公司產(chǎn)品；磷酸氫二鈉、氯化鉀、硫酸鎂（均為分析純）：天津化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；降異戊二烯類化合物標準品、甲基庚烯酮、2，4-壬二烯醛、二氫-β-紫羅蘭酮、二氫茉莉酮、β-紫羅蘭酮、β-大馬酮、α-環(huán)檸檬醛、β-環(huán)檸檬醛、藏紅花酮、香葉基丙酮、檸檬烯、丙酸香葉酯、二氫獼猴桃內(nèi)酯、2，2，6-三甲基環(huán)己酮、2-辛烯醛（均為色譜純）、正構(gòu)烷烴混合標準品（C8～C40）：上海Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品；2-辛醇、無水乙醇：美國Sigma試劑公司產(chǎn)品。

1.2 儀器與設(shè)備

TGL-16M高速臺式冷凍離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司產(chǎn)品；島津GCMS-QP2010氣質(zhì)聯(lián)用儀、DB-5MS色譜柱：美國Agilent公司產(chǎn)品；50/30 μm聚二甲基硅烷-二乙烯基苯涂層纖維（DVB/CAR/PDMS）萃取頭：美國Supelco公司產(chǎn)品；DF-Ⅱ數(shù)顯集熱式磁力攪拌器：常州愛華儀器制造有限公司產(chǎn)品；JYL-C051多功能料理機：九陽公司產(chǎn)品；PB-LO pH計：賽多利斯科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；AL204電子天平：托利多儀器（上海）有限公司產(chǎn)品；LDZX-40C型自動立式電熱壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠產(chǎn)品。

1.3 實驗方法

1.3.1 枸杞酒釀造條件枸杞酒工藝流程如下：

干枸杞復(fù)水（干枸杞與水體積比1∶5）打漿→榨汁→過濾→果膠酶、亞硫酸→28℃發(fā)酵→過濾→陳釀→產(chǎn)品。

1）對照組 將干枸杞復(fù)水（干枸杞與水體積比1∶5）榨汁后，加入亞硫酸和果膠酶，添加量分別為60 mg/L和40 mg/L，用檸檬酸將pH調(diào)至3.3，接入酵母活化液于28℃培養(yǎng)箱中發(fā)酵，發(fā)酵完成后過濾，陳釀15 d檢測相關(guān)指標，并進行感官評價。

2）庫特氏菌增香組 將干枸杞復(fù)水（干枸杞與水體積比1∶5）榨汁后，加入亞硫酸和果膠酶，添加量分別為60 mg/L和40 mg/L，枸杞清汁用檸檬酸將pH調(diào)整至3.3，接入酵母活化液于28℃培養(yǎng)箱中發(fā)酵，枸杞渣中接入庫特氏菌活化液于28℃培養(yǎng)箱中發(fā)酵（降解類胡蘿卜素），發(fā)酵結(jié)束將二者合并后按工藝流程過濾、陳釀并檢測相關(guān)指標，同時進行感官評價。

3）高壓法增香組 將干枸杞復(fù)水（干枸杞與水體積比1∶5）榨汁后，加入亞硫酸和果膠酶，添加量分別為60 mg/L和40 mg/L，然后過濾，果汁用檸檬酸調(diào)整pH為3.3，接入酵母活化液于28℃培養(yǎng)箱中發(fā)酵，枸杞渣置于錐形瓶中，封口后于高壓滅菌鍋中，120℃滅菌20 min后冷卻至室溫，合并發(fā)酵后過濾、陳釀并檢測相關(guān)指標，同時進行感官評價。

4）庫特氏菌提取酶增香組 將干枸杞復(fù)水（干枸杞與水體積比1∶5）榨汁后，加入亞硫酸和果膠酶，添加量分別為60 mg/L和40 mg/L，然后過濾，枸杞清汁用檸檬酸將pH調(diào)整至3.3，將庫特氏菌（Kurthia sp.）GQ-16用察氏培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)后于4℃下10000 r/min離心10 min取上清液，冷凍干燥后的酶制劑加到發(fā)酵液共同發(fā)酵后[12]，過濾、陳釀并檢測相關(guān)指標，同時進行感官評價。

1.3.2 標準品溶液的測定標準品溶液的配制參照劉建花等的方法[13]。

1.3.3 降異戊二烯類化合物的萃取取8 mL枸杞酒于頂空瓶，加入2 g NaCl調(diào)節(jié)離子濃度，添加8 μL 2-辛醇作為內(nèi)標溶液，封口，40℃磁力攪拌器上平衡10 min，插入裝有50/30 μm萃取頭的手動進樣手柄，吸附萃取40 min后，收回萃取頭纖維部分再取出萃取頭，插入GC-MS進樣口于250℃解吸5 min，用于GC-MS分析[14-15]。

1.3.4 氣相色譜質(zhì)譜工作條件色譜條件：安捷倫DB-5MS色譜柱，石英毛細管柱（30 m×250 μm×0.25 μm）；程序升溫：初始溫度40℃，保持3 min，以5℃/min的升溫速度升至120℃，再以8℃/min的升溫速度升至230℃，保持10 min；載氣為高純氦氣（純度＞99.999%），載氣流量1 mL/min；進樣口溫度為250℃，溶劑延遲3 min，進樣模式不分流[16-17]。

質(zhì)譜條件：EI電離源，離子源溫度200℃，進樣口溫度250℃，EI源能量70 eV，燈絲發(fā)射電流0.20 mA，檢測器電壓350 V。掃描范圍為m/z 20～450[18]。

1.3.5 降異戊二烯類化合物的分析方法定性、定量分析：將GC-MS分析得到的各物質(zhì)質(zhì)譜信息與NIST.107標準譜庫自動檢索對比，以化合物結(jié)構(gòu)特征匹配指數(shù)大于80%作為物質(zhì)鑒定標準；通過C8～C40正構(gòu)烷烴混標物的保留時間，計算未知化合物的保留指數(shù)（RI），結(jié)合文獻以及數(shù)據(jù)庫中RI對化合物進行鑒定，并通過計算待測揮發(fā)物與2-辛醇的峰面積之比求得其含量[18-19]。

香氣化合物質(zhì)量濃度的計算：

化合物與內(nèi)標的響應(yīng)因子計算：

式中：cn為化合物質(zhì)量濃度，μg/mL；Sn為化合物峰面積；S1為2-辛醇峰面積；c1為2-辛醇質(zhì)量濃度，μg/mL；c0為標準品質(zhì)量濃度，μg/mL；S0為標準品峰面積；RF為響應(yīng)因子。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

采用Agilent Mass Hunter 7.0進行定量分析。采用SIMCA-P進行主成分分析（principal component analysis，PCA）、正交偏最小二乘法判別分析 （orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）和數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 對照組發(fā)酵前后降異戊二烯類化合物對比

由圖1可以看出，枸杞汁中的降異戊二烯類物質(zhì)只檢測到6種。在整個發(fā)酵過程中，類胡蘿卜素在外界因素與各種反應(yīng)下降解，在枸杞酒中檢測到13種降異戊二烯類物質(zhì)，枸杞酒中的降異戊二烯類化合物質(zhì)量濃度整體高于枸杞汁，而其中α-環(huán)檸檬醛質(zhì)量濃度低于枸杞汁中的值，這是因為α-環(huán)檸檬醛在發(fā)酵過程中一部分反應(yīng)變成β-環(huán)檸檬醛的同分異構(gòu)體。但同時也有部分類胡蘿卜素降解生成α-環(huán)檸檬醛，因此，枸杞酒中α-環(huán)檸檬醛與β-環(huán)檸檬醛總量高于枸杞汁。

圖1 對照組枸杞汁和枸杞酒中降異戊二烯類化合物種類及質(zhì)量濃度Fig.1 Types and contents of isoprene compounds in wolfberry wine and wolfberry juice in the control group

2.2 不同增香工藝發(fā)酵后枸杞酒中類胡蘿卜素降解規(guī)律

由表1可以看出，3種降解類胡蘿卜素的方法共產(chǎn)生15種降異戊二烯類化合物，其中玉米黃素雙棕櫚酸酯變化最大。玉米黃素雙棕櫚酸酯中有很多雙鍵結(jié)構(gòu)[20-21]，且?guī)в泻芏嗟募谆p鍵容易被破壞發(fā)生反應(yīng)，甲基極容易發(fā)生取代、氧化反應(yīng)，從而發(fā)生降解。實驗測定，類胡蘿卜素降解生成的降異戊二烯類化合物含量較多的幾種都是以雙鍵位置斷裂反應(yīng)生成的。

表1 不同增香工藝枸杞酒產(chǎn)生降異戊二烯類化合物的規(guī)律Table 1 Producing pattern of isoprene compounds in different wolfberry wine produced by flavor-enhancing technology

續(xù)表1

枸杞酒中類胡蘿卜素降解后產(chǎn)物最多的是香葉基丙酮，是由C7’～C8’、C13～C14斷裂生成的，具有青香、果香、蠟香和木香，為枸杞酒提供了復(fù)雜的香氣。最具有典型性香氣的β-大馬酮是由C10～C11斷裂、C9去氫氧化生成，為枸杞酒提供了獨特的玫瑰香。

2.3 不同增香工藝枸杞酒中降異戊二烯類化合物種類及質(zhì)量濃度

由表2可以看出，采用3種工藝制作的枸杞酒中降異戊二烯類化合物的種類和質(zhì)量濃度均有差異。其中，高壓法增香組與庫特氏菌提取酶增香組各檢測到15種降異戊二烯類化合物，庫特氏菌增香工藝所制枸杞酒中共檢測到14種降異戊二烯類化合物，未檢測到檸檬烯；3種增香工藝降異戊二烯類化合物總量差異極大。兩種生物法相比較，采用庫特氏菌提取酶增香工藝的枸杞酒中降異戊二烯類化合物明顯高于庫特氏菌增香工藝。

表2 不同增香工藝枸杞酒中降異戊二烯類化合物種類及質(zhì)量濃度Table 2 Types and mass concentration of isoprene compounds in wolfberry wine produced by different flavor-enhancing technology

將庫特氏菌提取后的酶制劑用于發(fā)酵過程，相對于直接采用庫特氏菌發(fā)酵而言，減少了菌種增殖代謝對營養(yǎng)物質(zhì)的消耗，可以很大程度地增強枸杞酒的香氣。

相對于高壓滅菌降解類胡蘿卜素而言，采用庫特氏菌外源酶具有條件溫和的優(yōu)勢。枸杞酒作為一種果酒，屬于熱敏性物料[22-23]。經(jīng)過高溫高壓處理后，不可避免地會產(chǎn)生蒸煮味。且在高溫高壓條件下，會導(dǎo)致類胡蘿卜素降解產(chǎn)物降戊二烯類化合物進一步斷裂而降解，生成相對分子質(zhì)量更小卻不具有香氣的揮發(fā)性物質(zhì)。

2.4 3種增香工藝釀造枸杞酒感官評價

在評價指導(dǎo)員的指導(dǎo)下篩選出10位接受過“食品感官評定”課程并參與訓(xùn)練的評價員進行感官品評。由圖2可知，不同增香工藝對枸杞酒的感官品質(zhì)影響較大。庫特氏菌增香枸杞酒色澤、口感濃郁度略占優(yōu)勢，但平衡性和典型性明顯不足；高壓法增香枸杞酒經(jīng)過高溫破壞了大分子結(jié)構(gòu)使其下沉，因此在澄清度上較優(yōu)，但因為焦糖化反應(yīng)的發(fā)生，色澤較暗；庫特氏菌提取酶增香酒苦味物質(zhì)略微不足，在香氣濃郁度、整體口感質(zhì)量和平衡性方面均更佳。因此，庫特氏菌提取酶在不破壞原酒香氣成分的基礎(chǔ)上還可以增加更多降異戊二烯類化合物，提高枸杞酒品質(zhì)。

圖2 感官評價圖Fig.2 Sensory evaluation diagram

3 結(jié)語

通過對3種酒樣中降戊二烯類化合物的測定并結(jié)合感官品評，發(fā)現(xiàn)采用庫特氏菌酶制劑輔助發(fā)酵，枸杞酒中的降異戊二烯類化合物最多，具有典型香氣和濃郁口感。采用庫特氏菌酶制劑輔助發(fā)酵，一方面不僅可以提高類胡蘿卜素的降解率，從而產(chǎn)生更多的降戊二烯香氣成分；另一方面，避免了庫特氏菌自身的代謝活動產(chǎn)生其他代謝產(chǎn)物影響酒體的協(xié)調(diào)性；其次，使用生物酶時反應(yīng)溫度低，避免了因高溫加熱而對酒體產(chǎn)生不良風(fēng)味。

在枸杞酒釀造過程中，可以將枸杞汁采用庫特氏菌酶制劑進行降解處理，在此之前對枸杞渣可適度配合使用高壓滅菌，從而改進枸杞酒的釀造工藝，提高枸杞酒香氣。作者研究了不同增香工藝對枸杞酒中降異戊二烯類化合物種類及含量的影響，為探究類胡蘿卜素降解產(chǎn)物對枸杞酒特征香氣的影響提供了基礎(chǔ)。