適用于暗場生化傳感系統(tǒng)的微流控芯片的研制與驗證*

王 輝，杜 謙，劉國華*

(1.南開大學(xué)電子信息與光學(xué)工程學(xué)院，天津 300071；2.天津市光電傳感器與傳感網(wǎng)絡(luò)技術(shù)重點實驗室，天津 300071；3.南開大學(xué)，薄膜光電子技術(shù)教育部工程研究中心，天津， 300350)

微流控技術(shù)由于具有可以實現(xiàn)高精度的流體控制、低樣本消耗、容易與實際場景相結(jié)合等特點，使其在物理、化學(xué)尤其是生命科學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[1]。 目前微流控芯片在升級中逐漸向簡單化、自動化、集成化、可重復(fù)操作、高延展性等方向發(fā)展，在生物樣本觀測和分離實驗中被廣泛應(yīng)用。 在未來，隨著第四次工業(yè)革命的推進，微流控芯片的制作和集成工藝將愈發(fā)便捷，且可以基于多樣性、快速響應(yīng)無滯后、多功能集成等需求。

暗場顯微鏡的暗場環(huán)阻擋入射光直接進入物鏡，只有樣品散射光被物鏡捕獲，因此背景呈現(xiàn)黑色。 斜入射光匯聚在被測樣品上發(fā)生散射，視野中呈現(xiàn)白色亮點[2]，該結(jié)構(gòu)可以突出粒子光強，整體畫面黑白分明，具有信噪比高、對比度強等特點，因此暗場的分辨率可達40 nm 以上。 本課題自主搭建的暗場顯微鏡主體結(jié)構(gòu)是由雙目正置金相顯微鏡改良而成，如圖1所示，在該系統(tǒng)下捕捉圖像如圖2 所示。

圖1 暗場顯微成像結(jié)構(gòu)圖

圖2 暗場顯微成像系統(tǒng)拍攝圖

當(dāng)光源入射到金納米粒子表面時，入射電場會對金屬表面自由電子產(chǎn)生力的作用，引起振動，當(dāng)入射電磁波頻率與金屬納米粒子表面的自由電子的固有振動頻率相匹配時，入射波能量會被明顯地吸收或散射，產(chǎn)生局域等離激元共振(Localized Surface Plasmon Resonance，LSPR)[3]，這是金屬納米材料獨有的光學(xué)特性。 基于LSPR 現(xiàn)象的暗場顯微成像系統(tǒng)因其能夠獲取單納米顆粒的散射光譜，在生化目標(biāo)痕量檢測方面具有明顯優(yōu)勢[4]，傳統(tǒng)實驗中納米顆粒需要以單層形式固定在玻璃基底上[5]，每次只可檢測出一個樣品的數(shù)據(jù)，實驗中不能精確控制變量。 為了更靈敏地獲取高質(zhì)量的傳感信息以及提高檢測效率，高通量并行檢測已經(jīng)成為暗場技術(shù)的急迫需求[6-7]。 由此，本研究引入微流控技術(shù)，設(shè)計并實現(xiàn)一款適用于暗場生化傳感系統(tǒng)的多通道并行微流控芯片，對待測空間和視野進行劃分，每一區(qū)域獨立檢測散射光譜及其共振峰峰移，實現(xiàn)多目標(biāo)并行檢測，提高檢測精度和速度。 該方法在提高檢測精度的同時，降低了對光源和探測器等硬件設(shè)備的要求，為低成本檢測痕量重金屬離子濃度提供了一種高效便捷的方法和手段。

1 微流控芯片設(shè)計

1.1 微流控芯片尺寸設(shè)計及通道分布

本課題搭建的暗場系統(tǒng)最常用20 倍物鏡，此時可以清晰地觀測到數(shù)千顆納米粒子，視野大小為508 μm×380 μm，為了充分利用暗場視野，微流控通道的寬度應(yīng)至少大于暗場的視野范圍508 μm。 鏡頭與物體平面準(zhǔn)確對焦后，物體平面前后一定范圍內(nèi)也可以清晰成像，可以清晰成像的范圍稱為景深。其公式為

式中:h為景深，D為光圈直徑，δ為允許彌散斑直徑，f為鏡頭的焦距，μ為物距[8]。 由式(1)可以看出，景深較大的成像系統(tǒng)具有更大的縱深調(diào)控范圍。當(dāng)微流控芯片高度較小時，即上下表面相距很近，若芯片上表面已聚焦下表面未聚焦，則下表面會在上表面的視野中投影成大圓斑或圓環(huán)，圖像互相重合，影響觀測效果，所以微流控芯片的高度應(yīng)大于該暗場系統(tǒng)的景深200 μm[9]。

暗場的物鏡調(diào)整成像清晰度，聚光鏡調(diào)整入射光強度，當(dāng)二者都聚焦時，觀測效果最佳，接收到散射光信號的信噪比達到極大值。 受重力的影響，較多的納米粒子會以單層形式附著在芯片的下表面。因此，只觀測上表面不符合實際的需求。 這要求暗場系統(tǒng)要增大物鏡與聚光鏡共同聚焦的觀測范圍，即增大暗場系統(tǒng)的工作距離[10]，實際測量出其范圍為500 μm～700 μm。

暗場系統(tǒng)聚光鏡的散射角大，物鏡散射角小，聚光鏡聚焦距離較短，導(dǎo)致聚光鏡的工作距離較短，同時還需避免炫光的產(chǎn)生，所以微流控芯片載玻片的厚度不能太厚，厚度選為0.17 mm。

暗場系統(tǒng)對蓋玻片的厚度要求較高，實驗中很微弱的蓋玻片厚度偏離便會降低物鏡的圖像質(zhì)量，現(xiàn)實中蓋玻片的制造誤差會使其厚度不一，考慮對暗場圖像質(zhì)量的要求，需要避免光學(xué)聚焦困難和散射光損失。 良好地校正物鏡蓋玻片后，可以極大地避免這些可能存在的誤差，物鏡蓋玻片經(jīng)實驗驗證，矯正標(biāo)準(zhǔn)為0.17 mm。

考慮到載玻片、通道、蓋玻片厚度，要求微流控芯片的厚度要控制在1.6 mm 以內(nèi)。

除了要滿足上述討論的尺寸之外，微流控芯片及通道分布的設(shè)計還應(yīng)滿足以下要求:

①可實現(xiàn)四通道并行檢測。

②利用通道的連通性，精確地控制實驗變量，兩兩腔室可進行對照觀察。

③考慮到實際加工問題，芯片結(jié)構(gòu)盡可能簡單，進出口個數(shù)盡可能少，現(xiàn)有工藝可以實現(xiàn)。

鷙四個觀測區(qū)域不宜過大，否則會浪費實驗試劑；不宜過小，否則會浪費暗場視野。

⑤可以應(yīng)用于暗場環(huán)境，視野范圍與暗場匹配，暗場顯微鏡下可清晰成像。

基于以上要求，設(shè)計出如圖3 所示芯片結(jié)構(gòu)。 其中最外層一環(huán)為四個入口，內(nèi)部有兩個出口，中間框為反應(yīng)腔室。 在實驗中，分別向入口1、3 通入試劑a、試劑b，向入口2、4 通入試劑x、試劑y。 此時腔室1發(fā)生試劑a 與試劑x 的反應(yīng)，腔室2 發(fā)生b 與x 的反應(yīng)，腔室3 為a、y 反應(yīng)，腔室4 為b、y 反應(yīng)。 任意兩個相鄰腔室都可進行嚴格的控制變量實驗。

圖3 微流控芯片通道設(shè)計圖

1.2 微流控腔室的仿真設(shè)計

本設(shè)計的應(yīng)用場景為暗場系統(tǒng)，所以在暗場顯微鏡下可以盡可能多地觀測到腔室中的納米粒子尤為重要，因此，在設(shè)計腔室結(jié)構(gòu)之前，首先明確設(shè)計應(yīng)滿足的條件:

①盡量拓展暗場的有效觀察視野。

②在有效視野下，增加單位時間流量，加強結(jié)果的統(tǒng)計效果。

③盡量破壞層流結(jié)構(gòu)，來保證反應(yīng)腔中的流體流速均勻穩(wěn)定。 因為流速不均會影響流體的折射率，從而改變納米粒子的散射光[11]。

④反應(yīng)腔的結(jié)構(gòu)盡可能簡單，并大于現(xiàn)有工藝的最小加工線寬。 目前本課題實驗室可加工最小線寬為10 μm。

在設(shè)計以及優(yōu)化反應(yīng)腔的過程中，使用COMSOL Multiphysics 進行仿真驗證。

雷諾數(shù)是流體力學(xué)中表征粘性影響力的相似準(zhǔn)則數(shù)，通過雷諾數(shù)可以判別流體的流動狀態(tài)，其無量綱表達式為:

式中:Re為雷諾數(shù)，其中ρ是介質(zhì)密度，ν是介質(zhì)的平均速度，L為微通道的特征長度，μ是介質(zhì)的動力粘度。 當(dāng)Re?1 時，流體為蠕動流；Re在1 ～2 000時，流體為層流；當(dāng)Re＞4 000 時，流體為湍流[12]。本設(shè)計的微流控芯片尺寸為微米量級，實驗中流體速度較低且主要成分與水接近，故以水為例估算出雷諾數(shù)Re≈0.9[13]左右，因此選擇層流模型進行后續(xù)的仿真建模。

設(shè)計的微流控芯片寬度遠遠大于高度，此時流場x-y平面分布的差異遠遠大于z軸方向的差異。 因此，使用x-y二維模型代替三維模型進行仿真分析。流體中粒子直徑小于100 μm 且速度小于0.2 m/s，此時慣性升力FL不能使粒子發(fā)生顯著的側(cè)向移動，粒子受力主要由斯托克斯拖曳力FD決定，因此用流體的速度來表征流體中粒子的運動。 流速分布使用穩(wěn)態(tài)層流Navier-Stokes 方程描述，流體密度、粘度系數(shù)接近于水，入口流速設(shè)為0.003 m/s，出口壓力設(shè)置為默認值，邊界條件為non-slipping wall[14]。

由于四個反應(yīng)腔設(shè)計完全對稱，仿真其中一個效果即可。 將初步設(shè)計反應(yīng)腔的一個腔室導(dǎo)入，觀察其分布。 暗場視野下的流速分布如圖4 所示，圖中右側(cè)光譜表征流速，此時為典型的層流流動模式，反應(yīng)液從入口流入，沿著右下方大致45°方向從出口流出，流速極度不均勻。 因此，需要在此基礎(chǔ)上，進行優(yōu)化。

圖4 反應(yīng)腔初始結(jié)構(gòu)速度場分布圖

為解決上述流速不均，加入弧形擋板以及導(dǎo)流片。 流場分布的Navier-Stokes 方程是非線性且比較復(fù)雜，很難對所有參數(shù)同時進行優(yōu)化，因此使用“貪心算法”分別優(yōu)化每個參數(shù)。 引入Q評估因子，去全面地表征反應(yīng)腔內(nèi)流體的效果。

式中:Q為流速標(biāo)準(zhǔn)差的表達式，單位為m/s，n-1個擋板將反應(yīng)池分為n份，vi表示第i個流道中央位置流體的速度，ˉv表示n個流道的平均流速。 因此Q能很好地表征液體流動是否均勻穩(wěn)定，Q越小越好。

在下面優(yōu)化中，主要從擋板數(shù)量、寬度、開口朝向，各擋板間距，以及導(dǎo)流片的形狀尺寸等方面分別進行分析優(yōu)化。

1.2.1 擋板的數(shù)量與寬度

為使腔室內(nèi)流速均勻，考慮設(shè)置2 ～6 個數(shù)目的擋板分別進行仿真，在腔室內(nèi)擋板沿著半徑方向等間隔分布，取每個流道中央位置的流速，如圖5 所示，圖中框內(nèi)為速度的參考點。Q值與擋板數(shù)關(guān)系如圖6所示，其中橫坐標(biāo)n為擋板數(shù)，隨著擋板數(shù)量增加，Q值逐漸減小，擋板分流使得腔室內(nèi)流速變均勻。 但擋板數(shù)量增加到一定程度時，Q值有反向上升的趨勢。層流具有在同一截面，流道內(nèi)中央速度大，貼壁速度小的特點。 隨著擋板數(shù)的增加，降低了流體的層流效應(yīng)，有向湍流轉(zhuǎn)變的趨勢。 但當(dāng)擋板數(shù)增加到一定程度時，即擋板將腔室流速分級越多，最外圍與最內(nèi)圍流道壓強差越大，由此Q值逐漸增大。 考慮效果穩(wěn)定且要求結(jié)構(gòu)盡量簡單，選擇n=4 條擋板。 此時流速分布如圖5 所示，Q=6.5×10-3m/s，此時，流速雖然均勻很多，但仍需繼續(xù)優(yōu)化。

圖5 引入擋板反應(yīng)腔室速度分布

圖6 不同擋板數(shù)下Q 值分布

進一步考慮改變擋板寬度w，取30 μm ～80 μm范圍內(nèi)進行仿真，結(jié)果如圖7 所示，Q值隨著擋板寬度的增加先快速減小后維持基本穩(wěn)定。 分析原因隨著擋板寬度的增加，各流道之間的絕對體積差變小，導(dǎo)致壓強差變小，速度差也隨之變小，流速更均勻穩(wěn)定。 流道體積隨著w的變化呈立方變化，所以Q值開始會隨著w的增加驟降。 但w繼續(xù)增加，流道之間的絕對體積差的變化不再明顯，Q值也隨之基本穩(wěn)定。 考慮擋板寬度過大時，視野有效面積較小，同時會增加反應(yīng)腔內(nèi)的流體粘度。 因此最終選擇擋板寬度為50 μm，此時Q=5.7×10-3m/s。

圖7 不同擋板寬度下的Q 值分布

1.2.2 擋板偏移量

從上述圖5 中可以看到，此時最外側(cè)的流速仍遠遠大于內(nèi)測。 考慮通過依次減小外側(cè)流道的寬度，降低不同流道間的絕對體積差，從而降低不同流道間的壓強差，表現(xiàn)為速度差變小。 由于最外側(cè)至內(nèi)測的流速依次遞減，減小的寬度也由外側(cè)至內(nèi)測依次遞減。如最外側(cè)流道減小量Δd為60 μm，則第四流道減小40 μm，依次遞減直至為0。 取Δd的范圍為30 μm～120 μm 依次進行仿真，結(jié)果如表1 所示。

表1 不同擋板偏移量下的Q 值分布

當(dāng)Δd=60 μm 時，Q值相對最優(yōu)，為5.1×10-3m/s。同時，采取一種距入口處距離越來越大的陣列排布方式，如圖8 中框內(nèi)所示，這樣既能使外側(cè)流道有液體流過，又因向內(nèi)開口變大，使得流體有向里側(cè)流道流入的趨勢。

圖8 擋板偏移后的腔室速度分布

1.2.3 導(dǎo)流片的形狀與尺寸

導(dǎo)流片形狀有橢圓形、三角形、矩形。 橢圓形由于其較為平滑，不突兀，導(dǎo)流效果較好，但工藝復(fù)雜不易實現(xiàn)。 矩形工藝雖簡便，但導(dǎo)流效果較差，只能起到擋板作用。 因此，本設(shè)計選擇三角形導(dǎo)流片，如圖10中框內(nèi)所示。

為簡化研究，使用底角為30°的等腰三角形。由于本課題實驗室工藝最小線寬為10 μm，因此設(shè)高10 μm，斜邊長20 μm 的三角形為導(dǎo)流片的原子尺寸。 設(shè)i為導(dǎo)流片的高，分別用不同尺寸的導(dǎo)流片進行仿真，計算Q值。 導(dǎo)流片過小則不起作用，過大會減小暗場的有效觀察視野。 從圖9 中可看出，當(dāng)i=10 μm 或20 μm 時，Q均達到較為優(yōu)異的值，考慮到加工工藝，最終取i=20 μm。

圖9 不同尺寸的導(dǎo)流片的Q 值分布

然而，此時第二流道流速仍較小，因此將靠近圓心的導(dǎo)流片向外略微移動，使得流體盡量向第二流道分流。 圖10 中框內(nèi)即為調(diào)整位置的導(dǎo)流片，此時Q值為3.5×10-3m/s，各個流道速度均勻，反應(yīng)池優(yōu)化完成，最終效果如圖10 所示。

圖10 最終腔室流速分布示意

2 微流控芯片的制備

設(shè)計的微流控芯片主要由PDMS 微流道與玻璃基底鍵合而成。 掩模板加工成模具，PDMS 微流道便由掩模版圖樣決定，如圖11 中圓盤所示。

圖11 PDMS 微流道掩模版圖樣

2.1 微流控溝道制備

通過澆注工藝制作微溝道，流程如圖12 所示，具體操作步驟如下:

圖12 微流道制作工藝流程圖

①硅膠與粘合劑以10 ∶1 的比例進行混合并充分攪拌4 min。

②用膠帶將陽模無縫隙地固定在錫紙上，錫紙按陽模的形狀聚合成桶狀。

③混合好的PDMS 均勻倒在陽模上。

④于真空機內(nèi)放置45 min，目的是去除混合劑里的氣泡，同時使PDMS 層與陽模貼合更緊密。

⑤于烤內(nèi)在箱90 ℃條件下烘烤45 min，使PDMS 固化。

⑥最后恢復(fù)至室溫后脫模并根據(jù)圖樣進行裁剪。 此時成品如圖11 中透明的PDMS 層所示。

2.2 微流控芯片整體封裝

PDMS 層為300 μm 左右，普通的針管插入入口和出口時，不能保持穩(wěn)定。 所以通過鍵合的方式在入口和出口添加PDMS 墊片。 如圖13 所示。

圖13 微流控芯片進出口模擬圖

最后整體封裝工藝流程如下:

①35 mm×90 mm×0.15 mm 的玻璃片置于H2SO4∶30% H2O2=7 ∶3 體積比的“食人魚”溶液中，靜置20 min。

②用等離子水和無水乙醇分別清洗玻璃片。

③用等離子機將處理好的PDMS 層和玻璃片鍵合。 其機理為等離子機破壞玻璃基底和PDMS 的Si-O鍵，在表面形成-OH 懸掛鍵，此時將PDMS 和玻璃相接觸，就會在表面形成Si-OH 化學(xué)鍵[15]。

④同理按照③步驟，將PDMS 層PDMS 墊片鍵合。

⑤于烤箱內(nèi)在90 ℃條件烘烤45 min 成型。

3 微流控驗證

3.1 氣密性和連通性實驗

向微流控芯片的入口處通入墨水，出口處用注射泵輕輕吸入，利用氣壓差以及自身的重力，使墨水流入管道，觀察流體的流動軌跡，如圖14 所示。 流體從入口流入，以通道路徑軌跡慢慢進入腔室，最后從出口流出，初步驗證了通道的氣密性以及本設(shè)計的可行性。

圖14 用墨水驗證芯片的流通性

3.2 金納米粒子成像

加工好的微流控芯片置于暗場顯微鏡下，分別向四通道中通入清潔液、去離子水(用1 mol/L NaOH 將pH 值調(diào)節(jié)至8)進行清洗，1、3 腔室中通入濃度為0.05 mg/mL 平均直徑為50 nm 的功能化金納米顆粒，2、4 腔室中通入濃度為0.1 mg/mL 平均直徑為50 nm 的功能化金納米顆粒，此時視野中可以觀察到流動的納米粒子。 分別向四通道通入1 mol/L 的鹽水1 mL，基于DLVO 理論，離子濃度變化會導(dǎo)致膠體粒子德拜距離改變，金納米顆粒團聚吸附在玻璃基底上。 通過范德華力將流動的金納米粒子固定后，最后通入去離子水清洗，進行暗場圖像采集。 灰度CCD 設(shè)置為0.25 s，幀率設(shè)置為4.0 fps，單色儀的掃描范圍為400 nm ～700 nm，步長為1 nm，步進間隔為0.5 s，拍攝暗場圖像，采集圖像如圖15 所示，此時單色儀波長為550 nm，暗場顯微鏡的光闌阻擋光源進入物鏡，斜入射光經(jīng)透鏡后匯聚在金納米粒子的表面發(fā)生散射，視野中呈現(xiàn)亮點。由于腔室2、4 中通入的納米粒子濃度比腔室1、3 中的納米粒子濃度高，最后呈現(xiàn)在視野下的白色亮斑也更為稠密。

圖15 暗場視野下采集的圖像

使用實驗室自主開發(fā)的圖像處理算法，對于單張圖像，提取單光點的灰度值、計算大小，最后根據(jù)洛倫茲力擬合，確定每一個納米粒子的共振峰位置。 取圖15 中的一個納米粒子進行計算擬合，結(jié)果如圖16所示，其中橫坐標(biāo)為單色儀的入射波長，縱坐標(biāo)為納米粒子在暗場顯微鏡下的光強。 可以看出該金納米球的共振峰在563 nm 左右，與理論值560 nm 大致相同。

圖16 單納米球LSPR 曲線

計算圖15 中每一個粒子的共振峰，得到圖17的統(tǒng)計圖，其中橫坐標(biāo)為單粒子的共振峰位置，縱坐標(biāo)為統(tǒng)計個數(shù)，共計950 個左右。 金納米粒子的共振峰位置呈正態(tài)分布，計算平均值，為558 nm，與理論值560 nm 保持一致。

圖17 金納米球共振峰統(tǒng)計分布

通過上述實驗可以驗證，該微流控芯片設(shè)計可以較好地適應(yīng)暗場傳感檢測環(huán)境。 后續(xù)通入重金屬離子和納米粒子，重金屬粒子的存在，使金納米粒子發(fā)生團聚，形成二聚體或低聚體。 其尺寸和表面形態(tài)會隨之發(fā)生改變，這種變化以光譜峰移形式展示出來，峰移量與重金屬離子的濃度呈正相關(guān)，以此為機理，可實現(xiàn)痕量重金屬的多通道并行檢測。

4 結(jié)論

設(shè)計并研制了一種適用于暗場顯微成像系統(tǒng)的微流控芯片，并通過實驗驗證其可行性。

①通過一系列的仿真和優(yōu)化，設(shè)計出流速穩(wěn)定，暗場視野下有均勻反應(yīng)液流過的微流控芯片。

②由于該設(shè)計的連通性，微流控芯片四個反應(yīng)腔可以兩兩進行精確對照，實現(xiàn)四通道并行檢測。

③實驗中，向制備的微流控芯片通入納米粒子，通過單色儀掃描進行拍照，用算法擬合出金納米粒子的散射光譜，得到共振峰波長，與理論值一致。 驗證了適用于暗場生化傳感系統(tǒng)、實現(xiàn)多通道并行檢測的微流控傳感芯片的可行性。

基于以上討論，可以看出，本文設(shè)計實現(xiàn)的微流控芯片，對暗場高通量的生化檢測具有重要的應(yīng)用價值和參考意義。