LC-MS法測定新型VMAT2抑制劑LPM3770164中的樟腦磺酸酯

曹麗曉,付婷婷,李兆琴,薛 英,于文浩,張星星,車 鑫

(1. 煙臺大學藥學院,分子藥理和藥物評價教育部重點實驗室(煙臺大學),新型制劑與生物技術藥物研究山東省高校協(xié)同創(chuàng)新中心,山東 煙臺,264005;2. 綠葉制藥集團有限公司長效和靶向制劑國家重點實驗室,山東 煙臺,264003)

LPM3770164為突觸囊泡單胺轉(zhuǎn)運體(vesicular monoamine transporter,VMAT)2抑制劑,用于治療遲發(fā)性運動障礙(Tardive dyskinesia,TD)或亨廷頓舞蹈癥(Huntington's disease,HD)[1]。目前已上市的VMAT2抑制劑有三種:丁苯那嗪、氘代丁苯那嗪和纈苯那嗪。丁苯那嗪和氘代丁苯那嗪均為外消旋體,其代謝產(chǎn)物種類較多,會產(chǎn)生抑郁和自殺傾向的黑框警告[2-4]。纈苯那嗪是丁苯那嗪主要活性代謝產(chǎn)物[+]-α-二氫丁苯那嗪的前藥,提高了藥物的靶點選擇性和特異性,去除了前兩種藥物的黑框警告,但該藥物的生物利用度較低,具有代謝排泄壓力和心臟的安全性風險[5-8]。LPM3770164則是基于纈苯那嗪的臨床治療學缺陷,針對其活性代謝產(chǎn)物[+]-α-二氫丁苯那嗪進行結(jié)構(gòu)改造,設計合成更優(yōu)新化合物,預期最終獲得治療TD或HD的靶向VMAT2抑制劑的1類新藥。

基因毒性雜質(zhì)在較低水平就有可能引起DNA的損傷并可能引發(fā)癌變,對患者的用藥安全產(chǎn)生嚴重危害,所以藥物中遺傳毒性雜質(zhì)的控制和監(jiān)測成為藥物開發(fā)和生產(chǎn)的一個關鍵問題[9]。EMA、FDA和ICH均頒布了與基因毒性雜質(zhì)相關的指導原則[10],為制藥企業(yè)對雜質(zhì)的控制提供了相關指導。樟腦磺酸作為拆分劑,廣泛應用于手性化合物的合成中。LPM3770164為單一手性結(jié)構(gòu)化合物,在其制備工藝中使用樟腦磺酸作為手性拆分劑,而樟腦磺酸很容易與工藝路線中使用的醇溶劑甲醇、乙醇反應生成潛在基因毒性雜質(zhì)樟腦磺酸甲酯(MCS)和樟腦磺酸乙酯(ECS)[11],其化學結(jié)構(gòu)式如圖1所示。目前暫未查到MCS、ECS的相關毒理學數(shù)據(jù),根據(jù)基于專家知識規(guī)則的Derek和基于統(tǒng)計學的Sarah兩類構(gòu)效關系軟件評估結(jié)果,MCS、ECS屬于ICH M7指導原則中第3類基因毒雜質(zhì)(具有警示結(jié)構(gòu),與原料藥結(jié)構(gòu)無關,無致突變性數(shù)據(jù))。為保證LPM3770164用藥安全性,有必要對MCS、ECS進行測定,并制定合理的限度。

圖 1 MCS、ECS的化學結(jié)構(gòu)式

根據(jù)LPM3770164臨床擬定的服藥劑量,參考EMA關于基因毒性雜質(zhì)限度的相關指南[12],對于結(jié)構(gòu)相似的基因毒性雜質(zhì),雜質(zhì)的總量應不超過毒理學關注閾值(TTC)即1.5 μg·d-1,得到MCS、ECS的限度約為10 ng·mL-1。為了實現(xiàn)這種痕量水平的定量,需要開發(fā)靈敏、準確的分析方法。對于磺酸酯類基因毒性雜質(zhì)的測定,歐洲藥典附錄[13]中收載了一種在線衍生化頂空GC-MS法,以碘化鈉作為衍生試劑進行衍生,逐漸成為一種通用方法,但該方法所采用的防止NaI氧化的硫代硫酸鈉對方法的耐用性有不利影響[14],并且采用衍生化間接測定可能會由于反應特異性不強而造成假陽性結(jié)果[15]。RAMAN等[16]采用GC-MS法測定樟腦磺酸甲酯與樟腦磺酸乙酯,其檢測限和定量限分別為150 ng·mL-1和500 ng·mL-1,檢測靈敏度無法滿足限度需求。因此,本課題采用具有較高的靈敏度和選擇性的LC-MS法進行直接測定,并進行相應的方法學研究,為LPM3770164的工藝和質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

1 材 料

1.1 儀器

Agilent 1290 超高效液相色譜儀(美國Agilent公司);Agilent 6470 三重四級桿質(zhì)譜儀,配置噴射流離子聚焦技術(Jet Stream)的AJS ESI源(美國Agilent公司);ACQUITY UPLC Peptide CSH C18(150 mm×2.1 mm,1.7 μm)(美國Waters科技公司);梅特勒電子天平XS105(瑞士Mettler Toledo公司);梅特勒電子天平PB-403S(瑞士Mettler Toledo公司)。

1.2 試藥

MCS(批號:11-RCD-92-2,純度:97%,多倫多化學研究有限公司);ECS(批號:4-RVK-176-2,純度:94%,多倫多化學研究有限公司);乙腈(HPLC純,德國Merck公司);乙酸銨(HPLC純,上海安譜科技股份有限公司);娃哈哈純凈水(杭州娃哈哈集團);LPM3770164(批號:20200824、20200825、20201207,山東綠葉制藥有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜-質(zhì)譜條件

2.1.1 色譜條件 采用色譜柱ACQUITY UPLC Peptide CSH C18(150 mm×2.1 mm,1.7 μm),以10mmol·L-1乙酸銨溶液-乙腈(90∶10,V/V)為流動相A,乙腈為流動相B,采用梯度洗脫[0 min(80% A-20% B)→10 min(20% A-80% B)→10.1 min(80% A-20% B)→15 min(80% A-20% B)],流速為0.3 mL·min-1,柱溫35 ℃,進樣量為10 μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件 單四級桿質(zhì)譜,采用電噴霧離子源(ESI)正離子化的選擇離子監(jiān)測(SIM)模式測定。MCS、ECS的目標離子[M+NH4]+質(zhì)荷比分別為264.5、278.5,碎裂電壓(Fragmentor)分別為85 V、90 V。干燥器溫度為300 ℃,干燥器流速為5 L·min-1,鞘氣溫度250 ℃,鞘氣流速5 L·min-1,毛細管電壓4 kV,噴嘴電壓1500 V,霧化氣壓力為35 psi,監(jiān)測時間為4～7.7 min,其余時間色譜系統(tǒng)中流出物均不進入質(zhì)譜分析。

2.2 溶液制備

2.2.1 混合雜質(zhì)對照品溶液 精密稱取MCS、ECS各約25 mg,置25 mL量瓶中,加空白溶液(V(乙腈)∶V(水)=1∶1)溶解并稀釋至刻度,搖勻,分別制成MCS、ECS對照品貯備溶液。精密量取上述對照品貯備溶液1.0 mL,置同一100 mL量瓶中,加空白溶液稀釋至刻度,搖勻,制成10 μg·mL-1的混合溶液。精密量取混合溶液1.0 mL,置100 mL量瓶中,加空白溶液稀釋至刻度,搖勻,即得0.1 μg·mL-1的混合雜質(zhì)對照品貯備液。精密量取混合雜質(zhì)對照品貯備液5.0 mL,置50 mL量瓶中,加空白溶液稀釋至刻度,搖勻,得到質(zhì)量濃度約為10 ng·mL-1混合雜質(zhì)對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取供試品約25 mg,精密稱定,置25 mL量瓶中,加適量空白溶液超聲溶解,稀釋至刻度,搖勻,即得。

2.3 方法學驗證

2.3.1 系統(tǒng)適用性 將“2.2.1”項下的混合雜質(zhì)對照品溶液,按照上述色譜-質(zhì)譜條件連續(xù)進樣6針,記錄色譜圖,分別計算MCS、ECS峰面積的RSD。MCS、ECS的RSD分別為2.5%、2.4%,結(jié)果見表1,表明儀器精密度良好。

表1 系統(tǒng)適用性試驗考察結(jié)果

2.3.2 專屬性試驗 將“2.2”項下空白溶液、混合雜質(zhì)對照品溶液和供試品溶液分別進樣,記錄色譜圖。結(jié)果見圖2,MCS、ECS的保留時間分別為5.398、6.295 min,空白溶液和供試品溶液對MCS、ECS測定均無干擾,該方法的專屬性良好。

圖2 LPM3770164中2個樟腦磺酸酯基因毒性雜質(zhì)LC-MS法檢查專屬性試驗

2.3.3 線性與范圍 精密量取“2.2.1”項下混合雜質(zhì)對照品貯備液1.0、1.5、3.0、4.0、5.0和7.5 mL,分別置50 mL量瓶中,用空白溶液稀釋至刻度,制成MCS、ECS質(zhì)量濃度分別約為2、3、6、8、10、15 ng·mL-1的系列標準曲線溶液,按上述色譜-質(zhì)譜條件分別進樣分析,記錄色譜圖。以溶液的質(zhì)量濃度X(ng·mL-1)與峰面積Y作標準曲線,得MCS、ECS的線性回歸方程見表2,結(jié)果表明MCS、ECS分別在1.97～14.79 ng·mL-1、1.90～14.26 ng·mL-1濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性相關性。

表2 線性考察結(jié)果

2.3.4 定量限和檢測限 精密量取“2.2.1”項下的混合雜質(zhì)對照品溶液,用空白溶液逐級稀釋,按上述色譜-質(zhì)譜條件進樣分析,記錄色譜圖,按照定量限S/N≥10的要求,得到定量限溶液。MCS、ECS的定量限濃度分別為1.97 ng·mL-1、1.90 ng·mL-1。將定量限溶液連續(xù)進樣6針,MCS、ECS的信噪比均大于10,MCS峰面積RSD為3.6%,ECS峰面積RSD為2.5%,結(jié)果見表3,該方法的靈敏度符合要求。

表3 定量限考察結(jié)果

精密量取定量限溶液3.0 mL,置于10 mL量瓶,加空白溶液稀釋至刻度,搖勻,即得檢測限溶液。MCS、ECS的檢測限濃度分別為0.59 ng·mL-1、0.57 ng·mL-1,連續(xù)進樣2針,MCS、ECS的信噪比均大于3。

2.3.5 加樣回收率試驗 取供試品約50 mg,精密稱定,置50 mL量瓶中,加適量空白溶液超聲使溶解,并分別精密加入混合雜質(zhì)對照品儲備液1.0、5.0、7.5 mL,加空白溶液稀釋至刻度,制成MCS和ECS低(定量限)、中(100%)、高(150%)三種不同加樣濃度水平的供試品溶液,分別平行配制3份。按上述色譜-質(zhì)譜條件分別進樣分析,記錄色譜圖,計算回收率,結(jié)果見表4。MCS、ECS的平均加樣回收率(n=9)分別為98.5%、99.1%,表明該方法準確度良好。

2.3.6 重復性試驗 因供試品溶液中未檢出各雜質(zhì),采用供試品加標溶液來評估方法的重復性。按照“2.3.5”項下方法制備中濃度加樣水平供試品溶液6份,按上述色譜-質(zhì)譜條件分別進樣分析,記錄色譜圖。通過回收率來計算RSD,結(jié)果見表4。MCS、ECS的RSD(n=6)分別為2.1%、2.2%,表明該方法重復性良好。

表4 加樣回收率和重復性試驗結(jié)果

2.3.7 溶液穩(wěn)定性試驗 將“2.2.1”項下的混合雜質(zhì)對照品溶液和“2.3.5”項下100%加樣濃度水平的供試品溶液分別于8 ℃樣品盤中放置,在0～36 h間不同的時間點,分別進樣分析,記錄色譜圖,將各時間點對照品溶液、加標供試品溶液的峰面積與0 h測定結(jié)果進行比較,通過計算回收率來確定對照品溶液與加標供試品溶液的穩(wěn)定性。結(jié)果見表5,MCS、ECS各對照品溶液及加標供試品溶液于8 ℃下放置,在36 h內(nèi)穩(wěn)定。

表5 溶液穩(wěn)定性試驗結(jié)果

2.4 樣品檢測

按照上述色譜-質(zhì)譜條件,對3批LPM3770164樣品(20200824、20200825、20201207)的MCS、ECS進行檢測,記錄色譜圖,按外標法計算雜質(zhì)的含量。結(jié)果如圖2(d)所示(以20201207樣品為例),在該方法的檢測靈敏度下,MCS、ECS在3批樣品中均未檢出,滿足其在樣品中的限度要求。

3 討 論

3.1 分析方法的選擇

對于磺酸酯類雜質(zhì),歐洲藥典附錄[13]中收載的衍生化HS-GC-MS法,以碘化鈉為衍生化試劑,與甲磺酸酯、對甲苯磺酸酯和苯磺酸酯等反應生成揮發(fā)性較好的碘代烷烴,通過測定碘代烷烴來計算藥物中磺酸酯類雜質(zhì)的量,該方法通用性較好,但無法區(qū)分不同類的磺酸酯。根據(jù)實際的工藝路線和質(zhì)量控制的需求,不同潛在的磺酸酯類雜質(zhì)需要在不同的控制位點進行質(zhì)控,若采用該藥典方法,專屬性無法保證?？紤]到樟腦磺酸甲酯、樟腦磺酸乙酯的沸點均較高(分別為382.9 ℃、395.9 ℃),采用GC-MS法進行直接測定響應較低,RAMAN等[16]采用的GC-MS法測定埃索美拉唑中的MCS、ECS,為了達到較高的靈敏度,將供試品的濃度定為50 mg/mL。而LPM3770164的溶解性較低,無法達到此濃度,該方法的靈敏度不能滿足本研究的限度需求。因此，本研究最終選擇采用LC-MS法進行直接測定,其專屬性強,靈敏度高,操作更加簡便。

3.2 色譜條件的選擇

方法開發(fā)初期采用超高效液相色譜進行條件的摸索,因樟腦磺酸甲酯、樟腦磺酸乙酯間極性差異小,不易分離,同時藥物中有其他雜質(zhì)干擾目標峰的測定,為確保MCS、ECS進入質(zhì)譜后具有較好的離子化效率,所以選擇柱效較高的Waters ACQUITY UPLC Peptide CSH C18(150 mm×2.1 mm,1.7 μm)色譜柱進行分離,實驗考察了梯度1[0 min(80% A-20% B)→10 min(20% A-80% B)→10.1 min(80% A-20% B)→15 min(80% A-20% B)]、梯度2[0 min(80% A-20% B)→15 min(20% A-80% B)→15.1 min(80% A-20% B)→20 min(80% A-20% B)]兩個梯度,對比兩個梯度的結(jié)果,MCS、ECS間的分離度接近,選擇保留時間較短、靈敏度較高的梯度1進行洗脫。

3.3 質(zhì)譜條件的選擇

由于MCS和ECS在紫外檢測器下響應較差,無法滿足樣品方法學驗證中靈敏度的要求,故選擇在質(zhì)譜檢測器下進行后續(xù)的方法開發(fā)。選用單四級桿質(zhì)譜進行SIM模式檢測時,全掃描模式下,MCS、ECS的母離子在流動相條件下主要以[M+NH4]+的形式存在且峰響應較穩(wěn)定,所以將[M+NH4]+峰264.5、278.5分別作為MCS、ECS的定量離子。SIM模式下,篩選Fragmentor,考察質(zhì)譜響應,結(jié)果表明樟腦磺酸甲酯在85 V下響應較高,樟腦磺酸乙酯在90 V下響應較高。最后進行離子源參數(shù)優(yōu)化,通過依次調(diào)節(jié)鞘氣溫度及流速、噴嘴電壓、毛細管電壓、霧化氣壓力、干燥氣溫度及流速等,考察質(zhì)譜響應,來滿足靈敏度的要求。為避免樣品基質(zhì)對儀器的污染和雜質(zhì)測定的干擾,根據(jù)雜質(zhì)的出峰時間選擇質(zhì)譜的監(jiān)測時間,使得方法的靈敏度更高。

4 結(jié) 論

綜上所述,本研究建立了LC-MS法測定LPM3770164中樟腦磺酸甲酯、樟腦磺酸乙酯,經(jīng)方法學驗證結(jié)果表明,其專屬性、線性、加樣回收率、重復性等結(jié)果良好,檢測限分別達到0.59 ng·mL-1、0.57 ng·mL-1,滿足藥物中樟腦磺酸甲酯、乙酯的限度需求。該方法操作簡便,專屬性強,靈敏度高,可以有效測定出LPM3770164中樟腦磺酸酯的含量,保證藥物的質(zhì)量安全,同時可為其他藥物中樟腦磺酸酯的測定提供方法參考。