色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定中藥材中33種禁用農(nóng)藥殘留量的方法探討

劉俊俊,蔡 丹,羅秋紅,章亞玲,高麗球,韓 穎,萬建春,占春瑞

(南昌海關技術(shù)中心,南昌 330038)

中藥是我國寶貴的文化遺產(chǎn),在醫(yī)學領域發(fā)揮著越來越重要的作用。隨著需求量的不斷增長,人工種植中藥材越來越多,隨之而來的農(nóng)藥殘留不僅危害人體健康[1-2],也是制約中藥走向國際市場的瓶頸,因此加強中藥材中農(nóng)藥殘留的監(jiān)測具有重要意義。《中華人民共和國藥典》(2020版)(簡稱Ch P2020)四部通則中規(guī)定了33種禁用農(nóng)藥甲胺磷、甲基對硫磷、對硫磷、久效磷、磷胺、六六六、滴滴涕、殺蟲脒、除草醚、艾氏劑、狄氏劑、苯線磷、地蟲硫磷、硫線磷、蠅毒磷、治螟磷、特丁硫磷、氯磺隆、胺苯磺隆、甲磺隆、甲拌磷、甲基異柳磷、內(nèi)吸磷、克百威、涕滅威、滅線磷、氯唑磷、水胺硫磷、硫丹、氟蟲腈、三氯殺螨醇、硫環(huán)磷和甲基硫環(huán)磷,按照化學結(jié)構(gòu),其可被分為有機磷類、有機氯類和氨基甲酸酯類。有機磷類農(nóng)藥是一種含磷的廣譜性殺蟲劑,甲胺磷、甲拌磷、水胺硫磷等均為常見的有機磷類農(nóng)藥,具有不穩(wěn)定、易分解、殘留期短的性質(zhì),大多數(shù)有機磷類農(nóng)藥都有劇毒[3]。有機氯類農(nóng)藥是一種廣譜性殺蟲劑,常見的有六六六、滴滴涕,該類農(nóng)藥的特點是穩(wěn)定性好、不易降解,且會通過生物鏈富集在動植物體內(nèi),危害人類健康及環(huán)境安全[4]。氨基甲酸酯類農(nóng)藥是在有機磷酸酯類之后發(fā)展起來的合成農(nóng)藥,是一類具有高效、易分解、殘留期短特點的廣譜性農(nóng)藥,應用于作物殺蟲、殺螨、除草等,克百威、涕滅威是常用的氨基甲酸酯類農(nóng)藥,此類農(nóng)藥在空氣和陽光下易分解,土壤中的半衰期較短,毒性較有機磷酸酯類低[5]。

Ch P2020四部通則第五法“藥材及飲片(植物類)中禁用農(nóng)藥多殘留測定法”中給出了直接提取法、Qu ECh ERS法和固相萃取法(分散型凈化材料凈化管、HLB柱和復合氨基柱)等3種樣品前處理方法。直接提取法適用于基質(zhì)相對簡單的樣品;QuEChERS法通用性高,但復雜基質(zhì)共萃取物的凈化效果不好;分散型凈化材料凈化管操作簡單,但同樣不適用于復雜基質(zhì)樣品的前處理;HLB柱可以去除部分葉綠素、揮發(fā)性油和磷脂,但對色素含量較高的物質(zhì)凈化效果不好;復合氨基柱對復雜基質(zhì)樣品的除雜效果較好,但對部分酸性農(nóng)藥可能有吸附作用。農(nóng)藥殘留的檢測方法有氣相色譜法(GC)[6-7]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(GC-MS/MS)[8-10]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)[11-12]等。其中,GC主要用于有機磷類和有機氯類農(nóng)藥的檢測,但分離能力有限,不適用于多種農(nóng)藥的同時分析;GCMS/MS和HPLC-MS/MS具有較高的準確度、靈敏度和較好的抗干擾能力,可同時分析多種農(nóng)藥。針對不同中藥材應采用哪種前處理方法、選用哪種檢測技術(shù),Ch P2020中未做闡述。

本工作采用GC-MS/MS和HPLC-MS/MS,測定了8種中藥材中33種禁用農(nóng)藥的含量,對不同前處理方式、不同檢測方法結(jié)果的差異性進行了探討,以期為中藥材農(nóng)藥殘留檢測技術(shù)的選擇提供參考。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

U3000-TSQ Quantiva型液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀;7890-7000型氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀;IKA T25型均質(zhì)器;R-215型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀;BSA2202S型電子天平;ME155DU型電子天平;TDL-5-A型離心機;IKA MS3型渦旋振蕩器;ELGA Q15型超純水裝置。

單標準儲備溶液:分別稱取適量的農(nóng)藥及其異構(gòu)體或氧類似物標準品,根據(jù)各物質(zhì)的溶解性分別采用甲醇、乙腈或丙酮溶解并定容至10 mL,配制成1.0 g·L-1單標準儲備溶液。其中,三氯殺螨醇現(xiàn)用現(xiàn)配。

內(nèi)標溶液:稱取適量的磷酸三苯酯,用乙腈溶解并定容至10 mL,配制成100 mg·L-1內(nèi)標溶液,應用于GC-MS/MS。

混合標準儲備溶液:根據(jù)單標準儲備溶液的定容液將其分為3組,分別移取適量的單標準儲備溶液,用甲醇、乙腈或丙酮稀釋并定容至10 mL,配制成10 mg·L-1混合標準儲備溶液。

磷酸三苯酯、33種農(nóng)藥及其異構(gòu)體或氧類似物標準品的純度均大于98.0%;甲醇、乙腈為色譜純;無水硫酸鈉、無水硫酸鎂、無水乙酸鈉、甲苯均為分析純;試驗用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 HPLC-MS/MS

1)色譜條件 Agilent Eclipse Plus C18色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.8μm);柱溫35℃;流動相A為含0.1%(體積分數(shù))甲酸的5 mmol·L-1甲酸銨溶液,B為乙腈;流量0.30 mL·min-1;進樣量5μL。梯度洗脫程序:0～1.0 min時,A為70%;1.0～11.0 min時,A由70%降至6%;11.0～11.1 min時,A由6%跳轉(zhuǎn)至0,保持2.9 min;14.0～14.1 min時,A由0跳轉(zhuǎn)至70%,保 持2.9 min。

2)質(zhì)譜條件 電噴霧離子源,正離子模式;離子傳輸管溫度350℃,霧化器溫度320℃;多反應監(jiān)測模式掃描。其他質(zhì)譜參數(shù)見表1和表2,其中,“*”為定量離子對。

表1 部分農(nóng)藥的質(zhì)譜參數(shù)(HPLC-MS/MS)Tab.1 MS parameters of some pesticides(HPLC-MS/MS)

1.2.2 GC-MS/MS

1)色譜條件 Agilent Technologies HP-5MS毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm,0.25μm),載氣為氦氣(純度不小于99.999%);流量1.2 mL·min-1;進樣口溫度250℃;進樣量1μL,不分流進樣。柱升溫程序:初始溫度為50℃,保持2 min;以50℃·min-1速率升溫至150℃,再以5℃·min-1速率升溫至200℃,最后以16℃·min-1速率升溫至280℃,保持8 min。

2)質(zhì)譜條件 電子轟擊離子源,正離子模式;離子源溫度300℃,接口溫度280℃;多反應監(jiān)測模式掃描。其他質(zhì)譜參數(shù)見表2和表3,其中,“*”為定量離子對。

表2 部分農(nóng)藥的質(zhì)譜參數(shù)(HPLC-MS/MS和GC-MS/MS)Tab.2 MS parameters of some pesticides(HPLC-MS/MS and GC-MS/MS)

表3 部分農(nóng)藥的質(zhì)譜參數(shù)(GC-MS/MS)Tab.3 MS parameters of some pesticides(GC-MS/MS)

表3(續(xù))

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品前處理

1)固相萃取法

稱取樣品粉末5 g(精確至0.01 g)和氯化鈉1 g,混勻,加入50 mL乙腈,以轉(zhuǎn)速12 000 r·min-1均質(zhì)2 min,以轉(zhuǎn)速4 200 r·min-1離心5 min,取上清液于200 mL雞心瓶中,沉淀中再加入乙腈50 mL,以轉(zhuǎn)速12 000 r·min-1均質(zhì)1 min,以轉(zhuǎn)速4 200 r·min-1離心5 min,合并兩次上清液,減壓濃縮至1～3 mL,再用乙腈定容至10 mL,得到提取液。

在裝有石墨化碳黑(GCB)的氨基復合固相萃取小柱(500 mg/6 mL)中加入約2 g的無水硫酸鈉,用10 mL體積比為3∶1的乙腈-甲苯混合液淋洗固相萃取小柱,棄去流出液;下接25 mL離心管,取上述提取液4 mL于固相萃取小柱中,用25 mL體積比為3∶1的乙腈-甲苯混合液洗脫,將洗脫液置氮吹儀上,于40℃水浴濃縮至近干,加入0.02 mL內(nèi)標溶液和2 mL乙腈溶解后,再用0.22μm有機濾膜過濾,收集濾液。

2)Qu ECh ERS法

稱取樣品粉末3 g(精確至0.01 g),置于50 mL聚苯乙烯具塞離心管中,加入1%(體積分數(shù))冰乙酸溶液15 mL,渦旋使樣品充分浸潤,靜置30 min,加入乙腈15 mL,渦旋混勻,劇烈振蕩1 min,加入7.5 g質(zhì)量比為4∶1的無水硫酸鎂-無水乙酸鈉混合粉末,混勻,再劇烈振蕩1 min,于冰浴中冷卻10 min,以轉(zhuǎn)速4 200 r·min-1離心5 min,取上清液置于凈化管[400 mgN-丙基乙二胺(PSA)/400 mg C18吸附劑/200 mg GCB/1 200 mg硫酸鎂]中,渦旋混勻,劇烈振蕩1 min,以轉(zhuǎn)速4 200 r·min-1離心5 min,吸取上清液5 mL,置氮吹儀上于40℃水浴濃縮至近干,加入0.01 mL內(nèi)標溶液,再用乙腈稀釋至1 mL,渦旋混勻,得到待測樣品溶液。

1.3.2 樣品測定

按照儀器工作條件進行測定,HPLC-MS/MS采用外標法定量,GC-MS/MS采用內(nèi)標法定量。六六六的含量以α-666、β-666、δ-666、γ-666的含量之和表示;滴滴涕的含量以4,4′-滴滴伊、4,4′-滴滴滴、4,4′-滴滴涕、2,4′-滴滴涕的含量之和表示;苯線磷的含量以苯線磷、苯線磷砜、苯線磷亞砜的含量之和表示;特丁硫磷的含量以特丁硫磷、特丁硫磷砜、特丁硫磷亞砜的含量之和表示;甲拌磷的含量以甲拌磷、甲拌磷砜、甲拌磷亞砜的含量之和表示;克百威的含量以克百威、3-羥基克百威的含量之和表示;涕滅威的含量以涕滅威、涕滅威砜、涕滅威亞砜的含量之和表示;硫丹的含量以α-硫丹、β-硫丹、硫丹硫酸酯的含量之和表示;氟蟲腈的含量以氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈砜、氟蟲腈亞砜的含量之和表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 凈化管的選擇

Qu ECh ERS法中GCB可去除色素等非極性干擾物;PSA可吸附糖類、有機酸等極性干擾物;C18吸附劑可去除脂類、固醇等非極性雜質(zhì);硅膠則可除掉糖類等極性較大的雜質(zhì);硫酸鎂可去除水分。填料越多,去除雜質(zhì)的效果也越好,但是對目標物的吸附也越多。試驗考察了3種凈化管(250 mg PSA/35 mg GCB/750 mg硫酸鎂/250 mg C18吸附劑;300 mg PSA/300 mg C18吸附劑/90 mg GCB/900 mg硫酸鎂/300 mg硅膠;400 mg PSA/400 mg C18吸附劑/200 mg GCB/1 200 mg硫酸鎂)對空白加標樣品(加標量0.02 mg·kg-1)凈化效果的影響。結(jié)果表明:樣品經(jīng)前兩種凈化管凈化后,待測樣品溶液顏色較深,檢測時對儀器的傷害較大;填料為400 mg PSA/400 mg C18吸附劑/200 mg GCB/1 200 mg硫酸鎂的凈化管對大多數(shù)目標物的凈化效果較好,各目標物的回收率均在55.0%～110%內(nèi)。因此,QuECh ERS法中選用填料為400 mg PSA/400 mg C18吸附劑/200 mg GCB/1 200 mg硫酸鎂的凈化管來對樣品進行前處理。

2.2 標準曲線、檢出限和測定下限

移取適量的混合標準儲備溶液和內(nèi)標溶液,分別用甲醇、乙腈或丙酮逐級稀釋,配制成各目標物質(zhì)量濃度為5,10,20,50,100,200μg·L-1,內(nèi)標質(zhì)量濃度為1 mg·L-1的混合標準溶液系列,按照儀器工作條件對上述混合標準溶液系列進行測定。以各目標物的質(zhì)量濃度為橫坐標,對應的峰面積(HPLC-MS/MS)或目標物峰面積與內(nèi)標峰面積的比值為縱坐標(GC-MS/MS)繪制標準曲線。結(jié)果顯示,33種農(nóng)藥及其異構(gòu)體或氧類似物標準曲線的線性范圍為5～200μg·L-1(HPLC-MS/MS)或10～200μg·L-1(GC-MS/MS),線性參數(shù)見表4～表6。

對0.02 mg·kg-1空白加標樣品進行測定,以信噪比為3和10時對應的質(zhì)量分數(shù)為檢出限和測定下限,結(jié)果見表4～表6。

表4 部分農(nóng)藥的線性參數(shù)、檢出限和測定下限(HPLC-MS/MS)Tab.4 Linearity parameters,detection limits and lower limits of determination of some pesticides(HPLC-MS/MS)

表5 部分農(nóng)藥的線性參數(shù)、檢出限和測定下限(GC-MS/MS)Tab.5 Linearity parameters,detection limits and lower limits of determination of some pesticides(GC-MS/MS)

表5(續(xù))

表6 部分農(nóng)藥的線性參數(shù)、檢出限和測定下限(HPLC-MS/MS和GC-MS/MS)Tab.6 Linearity parameters,detection limits and lower limits of determination of some pesticides(HPLC-MS/MS and GC-MS/MS)

2.3 精密度和回收試驗

按照試驗方法對陰性黃芩樣品進行3個濃度水平的加標回收試驗,每個濃度水平平行測定6次,計算回收率和測定值的RSD,結(jié)果見表7～表9。

表7 兩種前處理方式下部分農(nóng)藥的精密度和回收試驗結(jié)果(HPLC-MS/MS,n＝6)Tab.7 Results of tests for precision and recovery of some pesticides with two pretreatment methods(HPLC-MS/MS,n＝6)

表8 兩種前處理方式下部分農(nóng)藥的精密度和回收試驗結(jié)果(GC-MS/MS,n＝6)Tab.8 Results of tests for precision and recovery of some pesticides with two pretreatment methods(GC-MS/MS,n＝6)

表9 兩種前處理方式下部分農(nóng)藥的精密度和回收試驗結(jié)果(HPLC-MS/MS和GC-MS/MS,n＝6)Tab.9 Results of tests for precision and recovery of some pesticides with two pretreatment methods(HPLC-MS/MS and GC-MS/MS,n＝6)

結(jié)果表明:兩種前處理方式、兩種檢測方法下各目標物的回收率為54.8%～128%,測定值的RSD為0.99%～21%,表明方法準確可靠,可用于實際樣品的分析檢測。

2.4 樣品分析

按照試驗方法,對黃芩片、紫蘇葉、黃苓、黃柏、小茴香、當歸、半夏、山麥冬等中藥材樣品進行測定,結(jié)果見表10,“?！北硎緶y定結(jié)果超出Ch P2020限值。除表10檢出的物質(zhì)外,其余農(nóng)藥均未檢出。Ch P2020中涕滅威的限值為100μg·kg-1,甲胺磷、磷胺、克百威、水胺硫磷的限值為50μg·kg-1,硫環(huán)磷的限值為30μg·kg-1,滅線磷、硫線磷、甲基異柳磷、苯線磷、特丁硫磷、甲拌磷的限值為20μg·kg-1。

表10 樣品分析結(jié)果Tab.10 Analytical results of the samples

由表10可以看出,目前所用到的農(nóng)藥主要為有機磷和氨基甲酸酯兩類農(nóng)藥,且果實種子類和根及根莖類中藥材中的部分農(nóng)藥含量超出Ch P2020限值。在檢出的農(nóng)藥中,苯線磷及其兩種代謝物苯線磷砜和苯線磷亞砜均有檢出,甲拌磷和特丁硫磷只檢出亞砜代謝物甲拌磷亞砜和特丁硫磷亞砜,氨基甲酸酯類農(nóng)藥中主要檢出克百威。農(nóng)業(yè)部公告199號[13]中已全面禁止甲胺磷、磷胺等19種高毒性農(nóng)藥在蔬菜、果樹、茶葉、中草藥材中的使用;農(nóng)農(nóng)發(fā)[2010]2號[14]中禁止克百威、甲基異柳磷用于蔬菜、果樹、茶葉、中草藥材,但仍有少量的甲胺磷及超出Ch P2020限值的克百威和甲基異柳磷被檢出。一方面可能是土壤中含有該類農(nóng)藥殘留,其在中藥材的生長中發(fā)生富集導致;另一方面和一些農(nóng)藥母體的使用有關,如乙酰甲胺磷代謝產(chǎn)生甲胺磷,丁硫克百威代謝產(chǎn)生克百威,這兩種藥物于2017年農(nóng)業(yè)部公告2552號[15]中被禁止使用。

2.4.1 固相萃取法和QuECh ERS法凈化效果的比較

試驗發(fā)現(xiàn):采用氨基復合固相萃取小柱凈化后,黃柏、小茴香和當歸的提取液均呈現(xiàn)不同程度的黃色;而采用QuECh ERS法處理后,小茴香和當歸樣品溶液沒有顏色,黃柏仍有黃色;紫蘇葉經(jīng)氨基復合固相萃取小柱凈化后沒有顏色,經(jīng)Qu ECh ERS法凈化后顏色較深,氨基復合固相萃取小柱對其余7種樣品的凈化效果優(yōu)于Qu ECh ERS法的,但前者的處理時間較長,且試驗中用到較多對環(huán)境極不友好的甲苯和乙腈。因此,紫蘇葉在批量檢測時建議采用氨基固相萃取小柱結(jié)合QuEChERS法處理,其余7種中藥材樣品建議直接采用Qu ECh ERS法處理。

2.4.2 同一物質(zhì)測定結(jié)果的比較

超出Ch P2020限值的農(nóng)藥中,HPLC-MS/MS和GC-MS/MS均檢出的物質(zhì)有甲拌磷、水胺硫磷和甲基異柳磷。從檢測方法來看,小茴香經(jīng)固相萃取法和QuEChERS法處理后,甲拌磷在HPLCMS/MS上的檢測結(jié)果無明顯差異,而在GC-MS/MS上的檢測結(jié)果差異較大,建議分析甲拌磷時以靈敏度更高的HPLC-MS/MS分析結(jié)果為準;采用HPLC-MS/MS和GC-MS/MS分析甲基異柳磷所得結(jié)果無明顯差異,可根據(jù)實際情況選擇儀器分析;水胺硫磷在HPLC-MS/MS上的檢測結(jié)果約為GCMS/MS檢測結(jié)果的2倍,并且試驗發(fā)現(xiàn)水胺硫磷在HPLC-MS/MS中有較強的基質(zhì)效應,因此實際分析中建議選用GC-MS/MS分析。

從前處理方法來看,固相萃取法的檢出率相比Qu ECh ERS法的要高,樣品經(jīng)QuECh ERS法處理后存在誤判的情況。如黃苓經(jīng)兩種方法處理后,甲基異柳磷的測定結(jié)果存在合格與不合格的差異,建議樣品在QuEChERS法處理后,若甲基異柳磷檢出結(jié)果大于0.01μg·kg-1但低于Ch P2020限值或者高于Ch P2020限值時,應采用固相萃取法處理復檢;小茴香經(jīng)固相萃取法、Qu ECh ERS法處理后,克百威的測定值差異較大,可能是QuEChERS法凈化效果不佳導致目標物出現(xiàn)假陽性的結(jié)果。

本工作通過優(yōu)化QuEChERS法中凈化管的填料,分別采用固相萃取法和QuECh ERS法對8種中藥材進行前處理,用HPLC-MS/MS和GC-MS/MS測定樣品中33種禁用農(nóng)藥的含量,比較了不同前處理方法的凈化效果,分析了不同前處理方法對同一農(nóng)藥檢測結(jié)果的差異性、不同類別中藥材中農(nóng)藥殘留的檢出情況以及不同檢測方法對同一農(nóng)藥檢測結(jié)果的影響,得出不同用藥部位中藥材宜采用的前處理方法和檢測手段,可為中藥材的農(nóng)殘分析檢測提供參考。