高組胺魚罐頭中5種生物胺含量的LC-MS分析方法

楊清華，史玉坤，戴志英，蔡秀麗，施逸嵐，張衛(wèi)兵

南通市疾病預(yù)防控制中心（南通 226002）

生物胺廣泛存在于日常生活的食品中，適量的生物胺對(duì)人體有益，但是高濃度的生物胺會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生嚴(yán)重的毒害作用，其中組胺是毒性最強(qiáng)的生物胺，其次是尸胺和酪胺[1-3]。水產(chǎn)品是生物胺的主要研究領(lǐng)域，特別高組胺魚類[4]因組胺含量高是重點(diǎn)研究對(duì)象。高組胺魚經(jīng)常會(huì)被加工成魚罐頭而被人們喜愛(ài)。但是在魚罐頭的生產(chǎn)加工過(guò)程需要多種程序從而引起生物胺含量的變化，尤其是組胺和酪胺的變化最大，所以加強(qiáng)對(duì)高組胺魚罐頭中生物胺含量的監(jiān)測(cè)和分析對(duì)于人們的飲食健康有著重要的意義[5-8]。

目前已有多種方法應(yīng)用于生物胺的檢測(cè)，主要有紫外可見(jiàn)分光光度法[9]、高效液相色譜法（LC）[10-11]、氣相色譜質(zhì)譜法（GC-MS）[12]、離子色譜法[13]和液相質(zhì)譜法（LC-MS）[14-15]。LC法作為GB 5009.208—2016[16]中第一法，其定量限較高，且需要衍生化處理，步驟相對(duì)繁瑣，分析時(shí)間長(zhǎng)，增加了檢測(cè)的不確定性因素。液質(zhì)聯(lián)用法具有靈敏度高、定性準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，逐漸被廣泛應(yīng)用，文獻(xiàn)中與該方法聯(lián)用的前處理手段主要有固相萃取、分散固相萃取以及QuEChERS提取等[17-20]，研究建立了高氯酸消解與LC-MS/MS聯(lián)用檢測(cè)魚罐頭中生物胺的方法，該方法具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、重現(xiàn)性好和有機(jī)試劑消耗少等優(yōu)點(diǎn)，可以滿足魚罐頭樣品中生物胺的定性和定量分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

標(biāo)準(zhǔn)品：尸胺（純度＞98%）、腐胺鹽酸鹽（純度＞99%）、酪胺鹽酸鹽（純度＞98%）、色胺（純度＞98%）、組胺鹽酸鹽（純度＞99%）：上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；甲醇（色譜純，默克）；甲酸銨（色譜級(jí)，阿拉?。?；三氯乙酸（分析純，國(guó)藥）；高氯酸（純度約為70%，國(guó)藥）；氫氧化鈉（試劑純，國(guó)藥）；魚肉粉中組胺殘留量檢測(cè)質(zhì)控樣品（CFAPA-QC056B-1，452.8±64.9 mg/kg，大連中食國(guó)實(shí)檢測(cè)技術(shù)有限公司）；甲酸（LC-MS級(jí)，F(xiàn)luka）；PTFE針式過(guò)濾器（0.22 μm，Agilent）。

1.2 儀器與設(shè)備

API 3200三重四極桿串聯(lián)液相色譜質(zhì)譜儀（AB公司，美國(guó)）；UFLCXR超快速液相色譜儀（島津，日本）；Primo R高速冷凍離心機(jī)（Thermo Fisher公司，美國(guó)）；JY10002型電子分析天平（梅特勒，瑞士）；試驗(yàn)用水均來(lái)自Mili-Q純水系統(tǒng)（Milipore公司，美國(guó)）；Vortex1旋渦混勻儀（IKV，德國(guó)）。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)和溶液的配制

分別稱取10.0 mg 5種生物胺標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈溶解并定容至100 mL容量瓶中，制得100 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；用乙腈稀釋配制標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量濃度分別為1.0，2.5，5.0，10.0，20.0，50.0和100.0 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液；100 mL 5%高氯酸溶液是由7.1 mL高氯乙酸加92.9 mL純水配制得到的，0.5%的高氯酸是由5%高氯酸溶液十倍稀釋所得。

1.3.2 試樣制備

從江蘇、北京以及廣東不同省份采集以70份鯖魚、鰹魚、金槍魚、秋刀魚、馬鮫魚、鲅魚、青占魚、沙丁魚等高組胺魚做成的罐頭樣品，棄去油汁取可食部分的魚肉，將其切碎，用組織搗碎機(jī)搗碎將其裝入潔凈的盛樣容器，密封并做好標(biāo)記，于-20 ℃冷凍保存，盡快檢測(cè)。

1.3.3 樣品的提取凈化

稱取2 g（精確至0.01 g）粉碎的魚肉樣品于50 mL離心管中，加入15 mL 5%高氯酸溶液，均質(zhì)旋渦5 min，冰浴超聲20 min，后靜置20 min，按8 000 r/min離心10 min后將上清液轉(zhuǎn)移至另一50 mL容量瓶中；樣品殘?jiān)偌尤?5 mL 5%高氯酸溶液重復(fù)提取1次，合并上清液。往上述上清液中加入適量400 g/L氫氧化鈉溶液，用pH試紙調(diào)節(jié)pH至2～3，再用0.5%高氯酸溶液定容至50 mL。準(zhǔn)確移取2 mL上述溶液至離心管，加入2 mL 0.5%高氯酸溶液，加5 mL正己烷，振蕩混勻，離心，棄去正己烷層；再加入5 mL正己烷凈化，棄去正己烷層。吸取0.25 mL上述溶液于玻璃管中，加入0.75 mL乙腈，混勻過(guò)0.22 μm濾膜，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定，對(duì)于高濃度的樣品需要逐級(jí)稀釋至線性范圍進(jìn)行檢測(cè)分析。

1.3.4 儀器條件

液相條件：色譜柱：waters Atlantis HILIC silica（3 μm，2.1 mm×100 mm）；流動(dòng)相：A相為含10 mmol/L甲酸銨，0.5%甲酸的水溶液；B相為含10 mmol/L甲酸銨的0.5%甲酸的乙腈溶液；柱溫：35 ℃；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：5 μL。梯度洗脫情況見(jiàn)表1。

表1 流動(dòng)相的梯度變化

質(zhì)譜條件：Turbo V離子源；電離方式：ESI正離子模式；定量檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）；氣簾氣壓力CUS：30.0 psi；碰撞氣壓力CAS：8 psi；電噴霧電壓IS：5 500 V；去溶劑溫度：500 ℃；霧化器壓力GS1：50 psi；輔助氣壓力GS2：50 psi。碰撞室入口電壓（EP）：10.0 V；碰撞室出口電壓（CXP）：3.0 V；檢測(cè)方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM），優(yōu)化后的母離子、子離子和碰撞能量見(jiàn)表2。

表2 5種生物胺的MRM分析條件

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Origin統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

定性分析：在相同色譜條件和質(zhì)譜條件下，對(duì)著生物胺的標(biāo)準(zhǔn)品定性離子對(duì)以及出峰時(shí)間，對(duì)樣品中的生物胺進(jìn)行定性分析。

定量分析：通過(guò)生物胺定量離子的峰面積以及標(biāo)準(zhǔn)的線性回歸方程，按照式（1）計(jì)算樣品中生物胺的含量（mg/kg）。

式中：c為標(biāo)準(zhǔn)曲線上得到生物胺的質(zhì)量濃度，μg/L；m為魚肉的樣量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化

在電噴霧正離子方式下，對(duì)100 μg/L的生物胺標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行一極質(zhì)譜掃描（Q1），得到分子離子，即母離子；對(duì)被測(cè)物的分子離子碰撞后，進(jìn)行二極質(zhì)譜分析，得到子離子質(zhì)譜圖。通過(guò)優(yōu)化去簇電壓和碰撞氣電壓等參數(shù)，以達(dá)到最佳靈敏度。5種生物胺的MRM圖見(jiàn)圖1。

圖1 5種生物胺的標(biāo)準(zhǔn)MRM圖譜

2.2 提取條件優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑選擇

生物胺具有強(qiáng)極性及較好的水溶性，所以采用極性強(qiáng)的溶劑提取，一般使用三氯乙酸（TCA）、甲酸、乙腈、甲醇和高氯酸溶液進(jìn)行提取[20-22]，魚罐頭是一類高蛋白腌制品，提取生物胺前需要消解蛋白質(zhì)，酸解法是一種簡(jiǎn)便快捷的蛋白質(zhì)消解方法，常用消解試劑有TCA和高氯酸；另外罐頭中含有較多的油和鹽分，因此試驗(yàn)過(guò)程中需要通過(guò)正己烷去除油脂。研究以實(shí)際檢出5種生物胺的鲅魚罐頭樣品進(jìn)行不同提取溶劑的提取效果分析，樣品分別經(jīng)5% TCA、2.5% TCA-2.5%高氯酸混合溶液和5%高氯酸溶液進(jìn)行消解提取，再經(jīng)正己烷去除脂肪凈化，三種提取溶液對(duì)提取效果的影響見(jiàn)圖2。結(jié)果表明，當(dāng)提取溶劑為5%三氯乙酸和2.5%三氯乙酸-2.5%高氯酸溶液時(shí)酪胺、腐胺和組胺的檢出濃度較低，所以選擇5%高氯酸對(duì)實(shí)際魚罐頭樣品中5種生物胺進(jìn)行提取。

表3 三種提取溶劑對(duì)生物胺提取效率的影響（n=3）

2.2.2 提取溶劑濃度選擇

方法使用高氯酸對(duì)魚肉進(jìn)行蛋白質(zhì)沉淀和生物胺提取，所以高氯酸濃度對(duì)生物胺的提取效率影響較大。該方法考察了魚罐頭樣品在不同濃度高氯酸溶液中的提取效率，結(jié)果見(jiàn)圖2。生物胺提取效率是以不同濃度高氯酸消解樣品后測(cè)定生物胺的含量與表2中5%高氯酸溶液提取時(shí)測(cè)得生物胺含量的比值（%）來(lái)表示。結(jié)果表明，高氯酸質(zhì)量濃度從1%到8%升高時(shí)，生物胺的提取效果變高，尤其是對(duì)于腐胺組分，隨著高氯酸濃度的增加，提取效率增加明顯，但是當(dāng)高氯酸濃度高于5%時(shí)，5種生物胺提取效率雖有所增加，但是考慮到高氯酸濃度較高，會(huì)給LC-MS/MS帶來(lái)較多損害和干擾，所以選擇5%高氯酸進(jìn)行樣品消解。

圖2 不同濃度高氯酸對(duì)5種生物胺提取效率的影響

2.3 方法驗(yàn)證

2.3.1 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)（matrix effect，ME）指樣品處理過(guò)程中除目標(biāo)化合物外，其他組分對(duì)定量分析準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性的影響。ME采用公式（2）計(jì)算：

式中：km為基質(zhì)匹配校準(zhǔn)曲線的斜率，k為溶劑校準(zhǔn)曲線的斜率。

參照步驟1.2.3小節(jié)處理過(guò)程提取空白魚罐頭基質(zhì)溶液，分別用乙腈和空白基質(zhì)溶液配制相同濃度的工作液，按LC-MS/MS的檢測(cè)條件進(jìn)行分析測(cè)定。以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制基質(zhì)匹配校準(zhǔn)曲線和溶劑校準(zhǔn)曲線，并計(jì)算每種生物胺的基質(zhì)效應(yīng)，其中5種生物胺的ME值在0.86～1.0范圍內(nèi)，表明該方法的基質(zhì)效應(yīng)不明顯。因此，采用乙腈溶劑的校準(zhǔn)曲線外標(biāo)法對(duì)樣品進(jìn)行定量分析。

2.3.2 線性關(guān)系與檢出限

采用外標(biāo)法對(duì)“1.2.1小節(jié)”方法制備的1.0，2.5，5.0，10，20，50和100 μg/L系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)，以生物胺的峰面為縱坐標(biāo)，生物胺的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，5種生物胺的相關(guān)線性r均大于0.99。按照定性離子通道中信噪比（rSN）不小于3時(shí)在實(shí)際樣品中目標(biāo)化合物的濃度為檢出限，定量離子通道中信噪比（rSN）不小于10時(shí)在實(shí)際樣品中目標(biāo)化合物的濃度為定量限。該法生物胺的檢出限（rLOD）和定量限（rLQD）在0.31～4.1 mg/kg和1.0～13.6 mg/kg范圍內(nèi)。

2.3.3 質(zhì)控樣的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取2 g魚粉質(zhì)控樣品（CFAPA-QC056B- 1），前處理同1.2.3小節(jié)，平行處理6次，取平均值，測(cè)得魚粉中組胺含量的平均值為409.2 mg/kg，在質(zhì)控樣證書質(zhì)量分?jǐn)?shù)452.8±64.9 mg/kg范圍內(nèi)，說(shuō)明方法的準(zhǔn)確性良好。

2.3.4 方法的回收率和精密度

開(kāi)展某鲅魚罐頭樣品的加標(biāo)和精密度試驗(yàn)，準(zhǔn)確稱取2 g粉碎的魚肉樣品，分別進(jìn)行5，50和100 mg/kg三個(gè)不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)水平的加標(biāo)回收試驗(yàn)，每個(gè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)水平需要獨(dú)立檢測(cè)6次，計(jì)算其加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見(jiàn)表4。其中加標(biāo)回收率在76.0%～ 108%范圍內(nèi)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.89%～5.08%范圍內(nèi)，說(shuō)明該方法的準(zhǔn)確度和精密度良好。

表4 加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）

2.4 樣品測(cè)定

分別應(yīng)用該方法對(duì)70份高組胺類魚罐頭進(jìn)行生物胺含量的檢測(cè)分析，5種生物胺的總含量在未檢出（ND）～652.9 mg/kg范圍內(nèi)，每種生物胺的含量結(jié)果見(jiàn)圖4。每種罐頭中單生物胺的含量大部分＜50 mg/kg，色胺的檢出質(zhì)量分?jǐn)?shù)在ND～56.5 mg/kg范圍內(nèi)；酪胺的檢出質(zhì)量分?jǐn)?shù)在ND～381.5 mg/kg范圍內(nèi)；組胺的檢出質(zhì)量分?jǐn)?shù)在ND～330.5 mg/kg范圍內(nèi)；尸胺的檢出質(zhì)量分?jǐn)?shù)在ND～198.3 mg/kg范圍內(nèi)；腐胺的檢出質(zhì)量分?jǐn)?shù)在ND～217.6 mg/kg范圍內(nèi)。目前尚未有針對(duì)高組胺魚罐頭中生物胺的檢測(cè)分析報(bào)道，只有研究測(cè)定部分金槍魚、沙丁魚以及鯖魚品種罐頭中組胺的含量，有報(bào)道沙丁魚罐頭中組胺含量在ND～354.05 mg/kg之間，金槍魚罐頭中組胺含量在ND～197.47 mg/kg之間；鯖魚罐頭中組胺含量在ND～64.05 mg/kg[23-24]之間。研究測(cè)定結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道基本在相同水平范圍內(nèi)。

圖3 5種生物胺在高組胺魚罐頭樣品中的結(jié)果統(tǒng)計(jì)

3 討論與結(jié)論

研究?jī)?yōu)化了提取試劑種類和濃度對(duì)魚罐頭樣品中生物胺提取效果的影響，建立了5種生物胺的高氯酸消解與LC-MS/MS聯(lián)用的檢測(cè)方法，檢出限和定量限分別0.31～4.1 mg/kg和1.0～13.6 mg/kg之間，5種生物胺化合物的回收率在76.0%～108%之間，方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、靈敏、分析時(shí)間短，完全滿足對(duì)魚罐頭樣品中多種生物胺的同時(shí)檢測(cè)分析。

將所建方法應(yīng)用于70份不同品種高組胺魚罐頭中生物胺含量的檢測(cè)分析，經(jīng)檢測(cè)驗(yàn)證，完全能滿足檢測(cè)需求，該方法的組胺檢測(cè)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的高組胺魚罐頭中組胺含量相近。方法在定性和靈敏度方面明顯優(yōu)于國(guó)標(biāo)方法，克服了分光光度法和液相色譜法檢測(cè)過(guò)程繁瑣、準(zhǔn)確度差、檢出限高等缺點(diǎn)，既簡(jiǎn)化了前處理步驟，又在保證準(zhǔn)確度的前提下，減少了大量有毒溶劑的使用，適用于魚罐頭中生物胺的定性和定量分析。