蟬花延壽及抗氧化作用

孫長勝，徐振棟，沈佳奇

浙江泛亞生物醫(yī)藥股份有限公司（平湖 314200）

蟬花（Cordyceps chanhuaZ.Z. Li，F(xiàn).G. Luan，Hywel-Jones，C.R. Li & S.L. Zhang，sp. nov.），是蟲草科（Cordycipitaceae）、蟲草屬（Cordyceps）[1]的一種，是在我國有上千年利用歷史的藥食兩用真菌，是寄生在蟬若蟲上形成的一種蟲生真菌。其主要成分有蟲草素、蟲草多糖、腺苷、甘露醇和麥角甾醇[2]，現(xiàn)代研究表明，其具有增強免疫力[3]、改善睡眠[4]、抗疲勞[5]、抗腫瘤[6]、鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛[7]等功能。2021年1月蟬花子實體獲批新食品原料，成為繼蛹蟲草、廣東蟲草之后的第三個蟲草類新食品原料。

現(xiàn)有的研究發(fā)現(xiàn)蟬花多糖對果蠅有延壽抗氧化的功效，但對單純的蟬花子實體和孢子粉的延壽抗氧化功能還未有研究。此次研究將不同劑量不同蟬花產(chǎn)品添加到果蠅基礎(chǔ)培養(yǎng)基中飼養(yǎng)果蠅，以探究不同劑量不同蟬花產(chǎn)品對果蠅壽命的延長作用，隨后通過測定各組果蠅組織勻漿中超氧化物歧化酶（SOD）的活性及丙二醛（MDA）的含量來探究蟬花的抗氧化作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

試驗動物：黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）W1118；蟬花子實體粉和孢子粉由浙江泛亞生物醫(yī)藥股份有限公司提供。

試劑：玉米粉、蔗糖、瓊脂、酵母粉、冰醋酸、無水乙醚；SOD試劑盒、MDA試劑盒、TP試劑盒（上海撫生實業(yè)有限公司）。

1.2 主要儀器與設(shè)備

HPX-300BSH-3恒溫恒濕培養(yǎng)箱（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）；ZHJH-C1214B超凈工作臺（上海智城分析儀器制造有限公司）；H2100R高速離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）；ML304T分析天平（美國梅特勒-托利多公司）；Infinite 200 Pro多功能酶標(biāo)儀（瑞士帝肯公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 果蠅培養(yǎng)基的配制

將10 g瓊脂、80 g蔗糖、108 g玉米粉加入鍋中，再加900 mL涼水，充分攪拌，使玉米粉分散均勻，后加熱攪拌成糊狀，停止加熱，加入冰醋酸6 mL攪拌均勻，再加入溶于100 mL溫水的10 g酵母粉，攪拌均勻，然后使用注射器將培養(yǎng)基注入培養(yǎng)管中，每管培養(yǎng)基高約2 cm（大約8 mL），用脫脂棉球塞上管口，報紙封口，于121 ℃高壓蒸汽滅菌30 min，隨后置于超凈工作臺冷卻凝固培養(yǎng)基，再置于37 ℃烘箱烘20 h使水汽蒸發(fā)，即獲得果蠅基礎(chǔ)培養(yǎng)基。在基礎(chǔ)培養(yǎng)基分裝前加入特定量的樣品混勻，即制成試驗培養(yǎng)基。

1.3.2 不同蟬花產(chǎn)品對果蠅壽命影響的測定

在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加0.2%，1%和5%的蟬花孢子粉、子實體粉、混合粉（5%孢子粉+95%子實體粉，以該比例為蟬花孢子粉與子實體整體采收時的產(chǎn)品組成）飼養(yǎng)的果蠅為試驗組，以僅用基礎(chǔ)培養(yǎng)基飼養(yǎng)的果蠅為空白對照組。選取8 h內(nèi)羽化成蟲的果蠅，用乙醚麻醉后鑒別分離雌雄果蠅，裝入培養(yǎng)管飼喂，每管10只果蠅，雌雄各設(shè)置3個重復(fù)，于25 ℃恒溫60%恒濕培養(yǎng)，每天記錄果蠅存活情況，最后統(tǒng)計果蠅平均壽命，半數(shù)死亡時間及最高壽命。

1.3.3 不同蟬花產(chǎn)品對果蠅體內(nèi)SOD活性及MDA含量的影響

果蠅5%組織勻漿的制備：取不同培養(yǎng)基培養(yǎng)25 d后的果蠅，乙醚麻醉，稱量其質(zhì)量（精確到0.000 1 g），用0.9%的生理鹽水充分研磨配制成5%的果蠅組織勻漿，并以4 000 r/min離心15 min，取上清液備用。果蠅組織中可溶性蛋白含量、SOD活力、MDA含量的測定均按試劑盒說明書進行操作。

1.3.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)使用SPSS Statistics 17.0軟件進行數(shù)據(jù)處理和分析，試驗結(jié)果用“平均值±標(biāo)準差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 對果蠅壽命的影響

以用基礎(chǔ)培養(yǎng)基飼養(yǎng)的果蠅為空白對照組，以添加0.2%，1%和5%的不同蟬花產(chǎn)品飼養(yǎng)的果蠅為試驗組，探究蟬花孢子粉和子實體對果蠅壽命的影響。試驗結(jié)果如表1和表2所示。

表1 不同處理對雌果蠅壽命的影響

表2 不同處理對雄果蠅壽命的影響

對比表1空白對照組和劑量組的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對于雌果蠅來說，培養(yǎng)基中加入中、低劑量的孢子粉、子實體粉時，能極顯著增加雌果蠅平均壽命和半數(shù)死亡時間（P＜0.01），且低劑量的效果更高，平均壽命提高率分別為21.31%和21.94%，半數(shù)死亡時間提高率分別為20.8%和22.48%。此外，添加低劑量的孢子粉和子實體粉還能顯著增加雌果蠅最高壽命（P＜ 0.05），分別提高4.69%和8.33%。低劑量的混合粉也能極顯著增加雌果蠅平均壽命和半數(shù)死亡時間（P＜ 0.01），提高率為14.39%和15.09%，不及純子實體粉和孢子粉。以劑量組內(nèi)比較結(jié)果來看，各蟬花產(chǎn)品對雌果蠅延壽作用并不隨濃度的提高而增強，甚至在最高壽命方面有降低。

對比表2空白對照組和劑量組的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對于雄果蠅來說，除中、高劑量的孢子粉組外，其余各組均能不同程度地顯著增加雄果蠅平均壽命和半數(shù)死亡時間（P＜0.05），且對平均壽命來說，各低劑量組的提升效果更好，分別提高19.92%，27.15%和19.19%；對半數(shù)死亡時間來說，孢子粉和混合粉組中低劑量組提升效果好，分別為25.41%和22.95%，子實體粉組為中劑量組提升效果最好，達30.33%。從最高壽命來看，僅有低劑量的子實體組能顯著增加雄果蠅最高壽命（P＜0.05），提高率為20.99%。此外，與雌果蠅類似，各蟬花產(chǎn)品對雄果蠅的延壽作用也并不隨濃度的提高而增強。

綜合雌雄果蠅結(jié)果，蟬花子實體和孢子粉對果蠅壽命有提升作用，并且0.2%劑量的子實體組的提升效果最好。

2.2 對果蠅SOD活性和MDA含量的影響

將在各組培養(yǎng)基中培養(yǎng)了25 d的果蠅制成5%組織勻漿，按照試劑盒的方法測定組織勻漿的SOD活力和MDA含量。測定結(jié)果如表3和表4所示。

表3 不同處理對果蠅SOD活力的影響

從表3中可以看出，對于雌果蠅，只有0.2%孢子粉組和子實體組相比于空白對照組體內(nèi)的SOD活力有顯著提升（P＜0.01），分別比空白對照組提高了12.92%和14.07%，而中、高劑量的孢子粉反而顯著降低了雌果蠅SOD活力。對于雄果蠅，0.2%孢子粉組和子實體組及1%子實體組比空白對照組對SOD活力有顯著提升（P＜0.05），分別為5.53%，6.99%和4.96%，而中、高劑量的孢子粉組和混合組則顯著降低了雄果蠅的SOD活力。從結(jié)果來看，果蠅SOD活力在低濃度的孢子粉和子實體粉組中提升效果最好，隨著濃度升高，果蠅SOD活力呈下降趨勢。

從表4結(jié)果來看，對于雌果蠅，僅0.2%子實體組能顯著降低MDA含量（P＜0.05），降低了30.08%，其余低劑量組能降低，但效果不顯著，并且5%孢子粉組還極顯著地增加了MDA含量（P＜0.01）；對于雄果蠅，0.2%孢子粉組、子實體組和混合組及1%子實體組均能極顯著降低果蠅體內(nèi)MDA含量（P＜0.01），分別降低了42.34%，49.55%，36.94%和45.05%。其余各組效果均不顯著。

表4 不同處理對果蠅MDA含量的影響

綜合雌雄果蠅的SOD、MDA結(jié)果可知，蟬花孢子粉和子實體能提高果蠅體內(nèi)SOD活性、降低MDA含量，且0.2%子實體組的效果最優(yōu)。

3 結(jié)論

果蠅是雙翅目果蠅屬昆蟲，因其世代周期短、繁殖速度快、壽命較短，且許多代謝途徑、生理功能和發(fā)育階段與哺乳動物相似等優(yōu)勢而作為模式動物常被用于抗衰老研究[8]。超氧陰離子自由基（O2-）是生物體代謝過程中產(chǎn)生的一種可攻擊生物大分子的自由基，其能破壞細胞結(jié)構(gòu)和功能，引起機體衰老或病變。超氧化物歧化酶（SOD）能清除超氧陰離子自由基（O2-），防止其損傷細胞[9]。氧自由基攻擊細胞膜中的多不飽和脂肪酸時，會發(fā)生脂質(zhì)過氧化作用，形成丙二醛（MDA）等脂質(zhì)過氧化物[10]。因此SOD活力與MDA含量的測定結(jié)果能反映機體清除氧自由基的能力和細胞受氧自由基攻擊的損傷情況[11]。在我國《保健食品功能學(xué)評價程序和檢驗方法》中將果蠅生存試驗、過氧化脂質(zhì)和抗氧化酶這三項指標(biāo)的結(jié)果是否呈陽性作為判定保健食品是否具有延緩衰老功能的檢驗標(biāo)準。

試驗探究了蟬花不同產(chǎn)品不同添加量對果蠅壽命的影響，并以超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）含量為指標(biāo)探究了其抗氧化活性。

在對果蠅壽命影響方面，0.2%添加量的孢子粉、子實體粉及混合粉和1%添加量的子實體粉均能顯著提高雌雄果蠅的平均壽命和半數(shù)死亡時間（P＜0.05），0.2%子實體粉組能顯著提高雌雄果蠅的最高壽命（P＜ 0.05）。其中，0.2%的子實體粉組綜合效果最好，使雌雄果蠅平均壽命分別延長了21.94%和27.15%，使雌雄果蠅半數(shù)死亡時間提高了22.48%和25.41%，最高壽命提高了8.33%和20.99%。綜合來看，孢子粉、子實體粉對果蠅壽命的延長不隨劑量的增加而增加，只有在適當(dāng)?shù)臐舛认虏疟憩F(xiàn)出顯著的正向作用。上述結(jié)果表明，蟬花具有延長果蠅壽命的作用，且雌雄果蠅延壽效果顯著時所需劑量偏低。

在抗氧化作用方面，0.2%添加量的孢子粉和子實體粉能顯著提高雌雄果蠅體內(nèi)SOD活力（P＜0.05），0.2%的子實體粉能顯著降低雌雄果蠅體內(nèi)MDA含量（P＜0.05）。0.2%的孢子粉能顯著降低雄果蠅體內(nèi)MDA含量（P＜0.05），對雌果蠅來說，雖能降低27.64%的MDA含量，但不夠顯著。綜合來看，孢子粉、子實體粉對果蠅抗氧化作用的影響不隨劑量的增加而增加，與壽命試驗的結(jié)果一致。該結(jié)果表明，低劑量的蟬花子實體和孢子粉對雌雄果蠅均表現(xiàn)出抗氧化作用。

除蟬花之外，目前市面上還有如冬蟲夏草、蛹蟲草、廣東蟲草等蟲草類產(chǎn)品被廣泛使用。這些不同的蟲草對果蠅壽命的影響均存在一定的研究報道，如：劉玉香[12]的研究發(fā)現(xiàn)，0.02，0.06和0.2 mg/mL的冬蟲夏草口服液能分別提高雄果蠅平均壽命25%，31%和32%；閆文娟等[13]的研究發(fā)現(xiàn)，1%劑量的廣東蟲草子實體粉能延長果蠅壽命，雌雄分別延長10.97%和9.78%；王菊鳳等[14]的研究發(fā)現(xiàn)濃度為0.15%的蛹蟲草多糖可以使雌雄果蠅的平均壽命延長率分別達34.3%和11.24%，使雌雄果蠅的半數(shù)死亡時間延長率分別為61.76%和23%，且蛹蟲草多糖對果蠅的延壽作用并不隨多糖濃度的提高而增強；張明等[15]的研究發(fā)現(xiàn)，蛹蟲草分級多糖P60能顯著延長雌雄果蠅的最高平均壽命，分別為12.54%和14.02%，并能顯著提高雌雄果蠅SOD活力6.95%和9.14%，降低MDA含量10.53%和27.07%；于士軍等[16]發(fā)現(xiàn)蟬花孢梗束粗多糖有延壽和抗氧化作用，雌雄果蠅壽命延長率分別是18.78%和26.23%；邵穎等[17]發(fā)現(xiàn)蟬花孢梗束分級多糖P60能顯著提高雌雄果蠅平均壽命、半數(shù)死亡時間、最高壽命和SOD活力（P＜0.05）；趙節(jié)昌等[18]研究發(fā)現(xiàn)1.0 mg/mL的蟬花孢子粉多糖可以顯著提高雌雄果蠅的平均壽命、半數(shù)死亡時間和最高壽命（P＜0.05）；中、高劑量組蟬花孢梗束粗多糖均顯著提高雌雄性果蠅的半數(shù)死亡時間和最高壽命（P＜0.05），且蟬花孢子粉和孢梗束粗多糖均具有提高果蠅體內(nèi)SOD活力和降低MDA含量的效果。從上述研究結(jié)果中可以發(fā)現(xiàn)各種蟲草均具有延壽和抗氧化的作用，有效成分可能為蟲草多糖，有待進一步研究其中的有效成分及其作用機制。