微波輔助萃取法提取葛根總黃酮工藝優(yōu)化

李東 ，姚氏麗，張小勤 *，蔣思峽 ，宋亞 ，喻仕瑞 *

1. 茅臺(tái)學(xué)院食品科學(xué)與工程系（仁懷 564507）；2. 貴州保健酒釀造工程研究中心（仁懷 564507）

葛根（Radix puerariae）為豆科植物野葛的根，藤本植物，藤長(zhǎng)可達(dá)10 m以上，根系發(fā)達(dá)，根粗大、肥厚，一般呈拳形、長(zhǎng)圓形或紡錘形；外皮呈土黃色，肉呈白色，肉質(zhì)堅(jiān)韌，富含纖維素。葛根生長(zhǎng)于我國(guó)南方地區(qū)山坡草叢中或路旁及較溫暖陰濕處，素有“亞洲人參”的美譽(yù)，在我國(guó)有悠久的入藥歷史[1]。因其味道清甜爽口，一些地區(qū)也常把葛根作為蔬菜食用，屬于藥食兩用天然植物資源[2]。世界上葛根約20余種，我國(guó)有10余種，其中以野葛和粉葛分布最廣、產(chǎn)量最高，主要分布在廣西、貴州、廣東、湖南和四川等省份。廣西是我國(guó)最大的粉葛產(chǎn)區(qū)，種植面積達(dá)10 201 hm2，加工企業(yè)10余家，產(chǎn)量近30萬(wàn) t[3]。葛根中含有碳水化合物、蛋白質(zhì)、膳食纖維等多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，及黃酮類、三萜類、生物堿類生物活性物質(zhì)，此外還富含人體必需的多種氨基酸和微量元素等[4-5]。黃酮類物質(zhì)達(dá)30余種，主要為葛根素、金雀異黃素、大豆苷、大豆苷元、染料木素和香豆素，其中葛根素是被研究最多的活性成分[6-7]。藥食兩用的特點(diǎn)使葛根具有極大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，其顯著的藥理價(jià)值和生理活性作用被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥工業(yè)、食品工業(yè)、日用化工等多個(gè)領(lǐng)域，且國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)對(duì)黃酮需求量逐步擴(kuò)大[8]。

葛根中的黃酮類化合物為其主要的生理活性物質(zhì)[2,9]，具有抑制體內(nèi)活性氧自由基的產(chǎn)生、提高體內(nèi)組織的抗氧化能力、修復(fù)細(xì)胞損傷、延緩和抑制細(xì)胞衰老、加速血液中酒精代謝及解酒護(hù)肝、預(yù)防心血管疾病等諸多生理功能[10-14]。葛根黃酮類化合物的提取方法主要有水煎法、加熱回流法、酶解法和超臨界流體萃取法[15-19]。有研究表明，這些方法均或多或少地存在提取率低、耗時(shí)長(zhǎng)、雜質(zhì)多、能耗高、操作復(fù)雜及安全性低等缺陷，這些都造成資源的浪費(fèi)和環(huán)境污染，與加熱回流法、水煎法、酶解法、超臨界流體萃取法相比，微波輔助萃取法溶劑用量較少，萃取時(shí)間較短，微波穿透力強(qiáng)，選擇性高，輻射均勻，加熱效率高[20-23]。微波輻射可以加快物質(zhì)的反應(yīng)速度，具有節(jié)省時(shí)間、工作效力高、節(jié)約資源、操作簡(jiǎn)單且能有效保護(hù)天然植物的活性成分等特點(diǎn)，以乙醇作為溶劑，能降低提取的成本和減少對(duì)環(huán)境的污染。探索成本低、效率高、質(zhì)量好的葛根黃酮提取工藝，對(duì)葛根資源深入開(kāi)發(fā)利用提供有價(jià)值的參考，對(duì)我國(guó)中草藥和天然植物資源的綜合開(kāi)發(fā)具有一定的借鑒意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葛根（市售）；葛根素標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%，合肥博美生物科技有限責(zé)任公司）；無(wú)水乙醇（廣東林氏化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

MD8H（pluss）微波合成儀（奧普樂(lè)科學(xué)儀器成都有限公司）；UV-8000ST紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)（上海元析儀器有限公司）；BGG-9140A鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；H1650R離心機(jī)（長(zhǎng)沙高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開(kāi)發(fā)區(qū)湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；FA2204N電子天平（上海箐海儀器有限公司）；JSP-500A粉碎機(jī)（天津泰斯特儀器有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 葛根黃酮的測(cè)定方法

1.3.1.1 葛根素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

參考楊麗維等[24]的方法進(jìn)行測(cè)定，以葛根素為標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)測(cè)定的吸光度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算葛根黃酮的含量。

1.3.1.2 提取液黃酮得率的測(cè)定

各吸取0.2 mL干葛根和鮮葛根提取液，參考楊青青[25]的方法計(jì)算葛根黃酮得率。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

1.3.2.1 不同料液比對(duì)葛根黃酮得率的影響

分別稱取3.0 g干葛根和鮮葛根，各5份，置于250 mL錐形瓶中，按料液比1∶10，1∶15，1∶20，1∶25和1∶30（g/mL）分別加入體積分?jǐn)?shù)30%的乙醇溶液攪拌均勻，浸泡5 min；在微波功率255 W、溫度60 ℃條件下提取2 min；提取結(jié)束后將提取液以5 000 r/min離心5 min，取上清液，定容測(cè)定；計(jì)算總黃酮得率，選擇最佳的料液比。

1.3.2.2 不同微波功率對(duì)葛根黃酮得率的影響

分別稱取3.0 g干葛根和鮮葛根，各5份，置于250 mL錐形瓶中，按料液比1∶20（g/mL），加入30%的乙醇溶液攪拌均勻，浸泡5 min；在不同微波功率（85，170，255，340和425 W）、溫度60 ℃條件下提取2 min；提取結(jié)束后將提取液以5 000 r/min離心5 min，取上清液，定容測(cè)定；計(jì)算總黃酮得率，選擇最佳的微波功率。

1.3.2.3 不同微波處理時(shí)間對(duì)葛根黃酮得率的影響

分別稱取3.0 g干葛根和鮮葛根，各5份，置于250 mL錐形瓶中，按料液比1∶20（g/mL），加入30%的乙醇溶液攪拌均勻，浸泡5 min；在微波功率255 W、溫度60 ℃條件下分別提取1.0，1.5，2.0，2.5和3.0 min；提取結(jié)束后將提取液以5 000 r/min離心5 min，取上清液，定容測(cè)定；計(jì)算總黃酮得率，選擇最佳的微波處理時(shí)間。

1.3.2.4 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)葛根黃酮得率的影響

分別稱取3.0 g干葛根和鮮葛根，各5份，置于250 mL錐形瓶中，按料液比1∶20（g/mL），分別加入20%，30%，40%，50%和60%的乙醇溶液攪拌均勻，浸泡5 min；在微波功率255 W、溫度60 ℃的條件下提取2 min；提取結(jié)束后將提取液以5 000 r/min離心5 min，取上清液，定容測(cè)定；并計(jì)算總黃酮得率，選擇最佳的乙醇體積分?jǐn)?shù)。

1.3.3 正交試驗(yàn)

結(jié)合單因素試驗(yàn)及統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果，以葛根總黃酮得率為考察指標(biāo)，選擇恰當(dāng)?shù)囊蛩睾退皆O(shè)計(jì)并開(kāi)展正交試驗(yàn)，優(yōu)化（干、鮮）葛根的提取工藝條件。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS分析軟件和Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 葛根黃酮的測(cè)定方法

根據(jù)1.3.1小節(jié)中的方法，配制不同質(zhì)量濃度的葛根素并測(cè)定吸光度，繪制葛根素標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示。經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)處理，回歸方程為y=68.179x+0.005 2，式中：y為吸光度，x為葛根素質(zhì)量濃度（mg/mL），相關(guān)系數(shù)R2=0.999。

圖1 葛根素標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 不同料液比對(duì)葛根黃酮得率的影響

不同料液比對(duì)葛根黃酮得率的影響結(jié)果見(jiàn)圖2。結(jié)果表明：干葛根料液比1∶10（g/mL）時(shí)總黃酮得率最低，隨著液體占比的增加，總黃酮得率也逐漸增加；料液比1∶20（g/mL）之后總黃酮得率增加的速度開(kāi)始放緩；料液比1∶25（g/mL）之后總黃酮得率開(kāi)始下降。由此可知，干葛根適宜的料液比為1∶25（g/mL），此時(shí)總黃酮得率為（19.92±0.09）mg/g。鮮葛根料液比1∶10（g/mL）時(shí)總黃酮得率最低，料液比1∶15（g/mL）之后，葛根中總黃酮的溶出速度加快；料液比1∶20（g/mL）之后總黃酮得率則開(kāi)始緩慢下降。由此可知，鮮葛根適宜的料液比為1∶20（g/mL），此時(shí)總黃酮得率為（5.88±0.06）mg/g。

圖2 不同料液比對(duì)葛根黃酮得率的影響

2.2.2 不同微波功率對(duì)葛根黃酮得率的影響

不同微波功率對(duì)葛根黃酮得率的影響結(jié)果見(jiàn)圖3。微波功率小于255 W時(shí)，隨著微波功率的上升，鮮、干葛根總黃酮得率均逐漸增加；微波功率大于255 W時(shí)總黃酮得率隨著微波功率的增大而下降；微波功率255 W時(shí)，鮮、干葛根總黃酮得率達(dá)到最大，此時(shí)干葛根總黃酮得率為（20.14±0.24）mg/g，鮮葛根總黃酮得率為（5.74±0.13）mg/g。因此，葛根適宜的微波功率為255 W。

圖3 不同微波功率對(duì)葛根黃酮得率的影響

2.2.3 不同微波處理時(shí)間對(duì)葛根黃酮得率的影響

不同微波處理時(shí)間對(duì)葛根黃酮得率的影響結(jié)果見(jiàn)圖4。微波處理時(shí)間1～2.5 min時(shí)，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，鮮、干葛根的總黃酮得率均不斷增加；微波處理時(shí)間超過(guò)2.5 min時(shí)，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，總黃酮得率逐漸下降；微波處理時(shí)間2.5 min時(shí)，葛根總黃酮得率達(dá)到最大，此時(shí)干葛根總黃酮得率為（20.45± 0.07） mg/g，鮮葛根總黃酮得率為（5.69±0.08）mg/g。因此，葛根適宜的微波處理時(shí)間約2.5 min。

圖4 不同微波處理時(shí)間對(duì)葛根黃酮得率的影響

2.2.4 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)葛根黃酮得率的影響

不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)葛根黃酮得率的影響結(jié)果見(jiàn)圖5。在微波提取過(guò)程中，乙醇體積分?jǐn)?shù)小于30%時(shí)，干葛根總黃酮得率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加呈上升趨勢(shì)；乙醇體積分?jǐn)?shù)30%時(shí)提取效果最好，總黃酮得率為（20.85±0.10）mg/g；乙醇體積分?jǐn)?shù)30%～40%時(shí)，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，總黃酮得率快速下降；乙醇體積分?jǐn)?shù)超過(guò)40%時(shí)，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，總黃酮得率緩慢下降。鮮葛根總黃酮得率則隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加整體呈先緩慢上升后緩慢下降的趨勢(shì)，也是乙醇體積分?jǐn)?shù)30%時(shí)總黃酮得率最高，為（5.95±0.09）mg/g。因此，葛根適宜的乙醇體積分?jǐn)?shù)為30%。

圖5 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)葛根黃酮得率的影響

2.2.5 單因素方差分析

對(duì)單因素試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，以確定各因素對(duì)葛根黃酮得率影響的顯著性，分析結(jié)果見(jiàn)表1。4個(gè)因素均對(duì)干葛根和鮮葛根總黃酮得率有極顯著影響（**，P＜0.01）。

表1 單因素方差分析

2.3 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素結(jié)果及統(tǒng)計(jì)分析，確定具體因素水平，見(jiàn)表2和表3。采用L9(34)正交表，進(jìn)一步進(jìn)行正交試驗(yàn)，研究各因素對(duì)葛根黃酮得率影響，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果如表4所示。

表2 干葛根正交試驗(yàn)因素及水平

表3 鮮葛根正交試驗(yàn)因素及水平

表4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

由正交試驗(yàn)結(jié)果可知：各因素對(duì)干葛根總黃酮得率影響的大小順序?yàn)锳＞D＞B＞C，即料液比＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞微波功率＞微波處理時(shí)間，最佳工藝為A2B2C1D2，即料液比1∶25（g/mL）、微波功率255 W、微波處理時(shí)間2 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)30%，此條件下，干葛根總黃酮得率為（21.7±0.2）mg/g；各因素對(duì)鮮葛根總黃酮得率影響的大小順序?yàn)锽＞D＞A＞C，即微波功率＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞料液比＞微波處理時(shí)間，最佳工藝為A2B2C2D2，即料液比1∶20（g/mL）、微波功率255 W、微波處理時(shí)間2.5 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)30%，鮮葛根總黃酮得率為（6.37±0.05）mg/g。

3 結(jié)論

以干葛根和鮮葛根為原料，以乙醇為溶劑，總黃酮得率為評(píng)定指標(biāo)，采用微波輔助萃取法提取葛根中的總黃酮，通過(guò)對(duì)單因素試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果表明料液比、微波處理時(shí)間、微波功率、乙醇體積分?jǐn)?shù)4個(gè)因素對(duì)干葛根和鮮葛根總黃酮得率均有極顯著影響（P＜0.01）。由正交試驗(yàn)結(jié)果可得：各因素對(duì)干葛根總黃酮得率影響的大小順序?yàn)榱弦罕龋疽掖俭w積分?jǐn)?shù)＞微波功率＞微波處理時(shí)間，其最佳提取工藝為料液比1∶25（g/mL）、乙醇體積分?jǐn)?shù)30%、微波功率255 W、微波處理時(shí)間2 min。在此條件下干葛根總黃酮得率為（21.7±0.2）mg/g。各因素對(duì)鮮葛根總黃酮得率影響的大小順序?yàn)槲⒉üβ剩疽掖俭w積分?jǐn)?shù)＞料液比＞微波處理時(shí)間，其最佳提取工藝為微波功率255 W、乙醇體積分?jǐn)?shù)30%、料液比1∶20（g/mL）、微波處理時(shí)間2.5 min。在此條件下鮮葛根總黃酮得率為（6.37±0.05）mg/g。試驗(yàn)方法可為葛根及其他天然植物資源的黃酮提取和綜合開(kāi)發(fā)提供一定借鑒。