破壁靈芝孢子粉破壁率的測(cè)定

高志城，周敏，張任廣，蘇水嬌，寧禮信，黎子林

廣東省科學(xué)院測(cè)試分析研究所（中國(guó)廣州分析測(cè)試中心），廣東省化學(xué)測(cè)量與應(yīng)急檢測(cè)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省原位電離質(zhì)譜分析工程技術(shù)研究中心（廣州 510070）

破壁靈芝孢子粉是開發(fā)較多的靈芝產(chǎn)品之一。研究表明，顯微鏡下破壁孢子粉與未破壁孢子粉的形態(tài)明顯不同，同時(shí)經(jīng)過破壁處理后，靈芝孢子中的還原性糖和多肽等化學(xué)成分更容易被提取出來，破壁孢子粉的醇提取液也比未破壁孢子粉具有更強(qiáng)的體外抗腫瘤活性[1-3]。因此，破壁率也常被認(rèn)為是衡量靈芝破壁孢子粉質(zhì)量的重要指標(biāo)之一[4-6]。靈芝孢子粉破壁率的檢測(cè)方法可分為血球計(jì)數(shù)法[7-8]、水裝片結(jié)合顯微技術(shù)法[9]、懸浮法結(jié)合物理技術(shù)[10-11]、化學(xué)指紋法[12]等。在“保健食品原料目錄 破壁靈芝孢子粉 破壁靈芝孢子粉原料技術(shù)要求/理化指標(biāo) 1 破壁率的測(cè)定”的基礎(chǔ)上，改善相關(guān)試驗(yàn)條件，進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)，建立一個(gè)適用于破壁靈芝孢子粉破壁率的測(cè)定方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

蔗糖（分析純，阿拉丁工業(yè)公司）；聚山梨酯-80（分析純，廣州化學(xué)試劑廠）。

1.1.2 主要儀器與設(shè)備

Olympus生物顯微鏡（CX23LEDRFS1C，奧林巴斯工業(yè)有限公司）；血球計(jì)數(shù)板（25個(gè)中格×16個(gè)小格，上海市求精生化試劑儀器有限公司）；超聲波振蕩器（AS3120型，天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；電熱鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9140A，上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；不銹鋼藥典篩6號(hào)；100 mL容量瓶。

1.2 樣品制備

分別取同一批次有代表性靈芝孢子粉和破壁靈芝孢子粉的樣品，各100 g，分別充分混勻，置于密閉的容器內(nèi)。

1.3 樣品前處理

取適量同一批次的靈芝孢子粉A和破壁靈芝孢子粉B，于烘箱60 ℃烘干5 h。

準(zhǔn)確稱取經(jīng)烘干的孢子粉A1，A2和破壁靈芝孢子粉B1，B2，其中mA=0.100 0 g，mB=0.150 0 g。

對(duì)照組：分別稱取5.0 g經(jīng)過研磨后過0.150 mm（100目）篩的蔗糖粉末，分別與孢子粉A1、B1充分混合至色澤均一。用蒸餾水分別溶解上述樣品，在樣品溶液中加0.1 mL聚山梨酯-80，用蒸餾水定容到100 mL容量瓶中，并在室溫超聲振蕩30 min，使孢子充分分散。

試驗(yàn)組：分別稱取5.0 g經(jīng)過3次重復(fù)研磨后過0.150 mm（100目）篩的蔗糖粉末，分別與孢子粉A2、B2充分混合至色澤均一。用蒸餾水分別溶解上述樣品，在樣品溶液中加0.1 mL聚山梨酯-80，用蒸餾水定容到100 mL容量瓶中，并在室溫超聲振蕩60 min，使孢子充分分散。

1.4 測(cè)定

1.4.1 進(jìn)樣

將待測(cè)孢子懸液，用吸管吸取1滴置于蓋玻片的邊緣，使液體緩緩滲入，多余的液體用吸水紙吸取，進(jìn)樣完成后靜置約30 s，將血球計(jì)數(shù)板置于400倍數(shù)的光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察計(jì)數(shù)。

1.4.2 靈芝孢子粉

置于顯微鏡下觀察孢子呈卵圓形，頂端鈍圓或截形，如圖1所示。

圖1 靈芝孢子粉顯微形態(tài)（400倍）

1.4.3 破壁靈芝孢子粉

置于顯微鏡下觀察，孢壁多破碎，可見多數(shù)黃褐色的大小不等的微粒、孢子破碎程度不同的殼段或孢子破碎后里面的黃色至黃褐色的內(nèi)容物，如圖2所示。

圖2 破壁靈芝孢子粉顯微形態(tài)（400倍）

1.4.4 觀察計(jì)數(shù)

使用25個(gè)中格×16個(gè)小格的計(jì)數(shù)板，如圖3所示，應(yīng)計(jì)算出血球計(jì)數(shù)板4個(gè)角上與中央5個(gè)中格中含完整靈芝孢子的數(shù)目（即以80個(gè)小格為1個(gè)計(jì)數(shù)單位）[13-14]，每個(gè)樣品有效觀察計(jì)數(shù)不少于3次，計(jì)算它們的平均數(shù)n。

圖3 血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)區(qū)域圖

1.5 計(jì)算方法

使用25個(gè)中格×16個(gè)小格的計(jì)數(shù)板時(shí)，每克孢子粉中含完整靈芝孢子數(shù)按式（1）計(jì)算。

式中：N為每克孢子粉含完整的靈芝孢子數(shù)，個(gè)/g；n為80個(gè)小方格內(nèi)含完整靈芝孢子的總數(shù)，個(gè)；V為孢子稀釋液的體積，mL；m為樣品的質(zhì)量，g；400為血球計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)室內(nèi)共有400個(gè)小方格；10 000為血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)室的容積，為0.1 mm3，1 mL相當(dāng)于10 000個(gè)血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)室的容積。

破壁率按式（2）計(jì)算。

式中：X為破壁靈芝孢子粉的破壁率，%；NB為每克破壁靈芝孢子粉中含完整的靈芝孢子數(shù)，個(gè)/g；NA為每克靈芝孢子粉中含完整的靈芝孢子數(shù)，個(gè)/g。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法改變前結(jié)果

對(duì)樣品A1、B1分別有效觀察計(jì)數(shù)3次，計(jì)數(shù)結(jié)果見表1。靈芝孢子粉3次計(jì)數(shù)的平均值為99，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為10.25%；破壁靈芝孢子粉3次計(jì)數(shù)的平均值為3，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為21.65%；根據(jù)公式計(jì)算得出破壁率98%。

表1 方法改變前結(jié)果

2.2 方法改進(jìn)后結(jié)果

對(duì)樣品A2、B2分別有效觀察計(jì)數(shù)3次，計(jì)數(shù)結(jié)果見表2。靈芝孢子粉3次計(jì)數(shù)的平均值為168，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.79%，破壁靈芝孢子粉3次計(jì)數(shù)的平均值為2，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.0%。根據(jù)公式計(jì)算得出破壁率99%。

表2 方法改進(jìn)后結(jié)果

2.3 結(jié)果分析

試驗(yàn)結(jié)果表明，由于孢子懸液分布不均勻，樣品A1、B1在原方法中與研磨后過0.150 mm（100目）篩的蔗糖粉末混勻后超聲振蕩30 min，破壁率為98%，每次計(jì)數(shù)的5個(gè)視野得到的數(shù)值不平均，3次計(jì)數(shù)的總數(shù)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差較大，而樣品A2、B2在與經(jīng)過3次研磨后過0.150 mm（100目）篩的蔗糖粉末混勻后超聲振蕩60 min，破壁率為99%，每次計(jì)數(shù)的5個(gè)視野得到的數(shù)值相對(duì)平均，3次計(jì)數(shù)的總數(shù)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差有明顯降低，結(jié)果提高1%。

3 結(jié)論與討論

3.1 討論

為保證破壁率測(cè)試結(jié)果的準(zhǔn)確性，因此對(duì)試驗(yàn)人員和試驗(yàn)用器具都有嚴(yán)格的要求。在實(shí)際檢驗(yàn)過程中要注意幾點(diǎn)：一是鏡檢計(jì)數(shù)室。因前一次清洗不到位，或者保存過程中存在污染，更或者因操作不當(dāng)導(dǎo)致的計(jì)數(shù)室存在劃痕，若不及時(shí)清洗或更換，則會(huì)對(duì)后期試驗(yàn)計(jì)數(shù)產(chǎn)生極大影響。所以，在每次使用血球計(jì)數(shù)板之前都需要認(rèn)真鏡檢計(jì)數(shù)室，如若在鏡檢時(shí)發(fā)現(xiàn)計(jì)數(shù)室有污物，則需按要求清洗并吹干后進(jìn)行試驗(yàn)[15]。二是搖勻后取液。在吸出孢子懸液進(jìn)行計(jì)數(shù)之前，需輕輕振蕩試管，使孢子分布均勻，防止聚集沉淀，從而提高計(jì)數(shù)的代表性和準(zhǔn)確性。三是掌握計(jì)數(shù)原則，并采用“計(jì)上不計(jì)下，計(jì)左不計(jì)右”的計(jì)數(shù)原則[16]。四是通過延長(zhǎng)超聲振蕩時(shí)間，重復(fù)多次研磨蔗糖粉末來解決孢子懸液分布不均勻的問題，提高試驗(yàn)的準(zhǔn)確性。

3.2 結(jié)論

使用血球計(jì)數(shù)板的優(yōu)點(diǎn)是試驗(yàn)成本不高、操作簡(jiǎn)單，適合于大批量、長(zhǎng)期穩(wěn)定的樣品的分析，是生產(chǎn)企業(yè)和檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)的不錯(cuò)的選擇。但是由于孢子懸液分布不均勻的不確定性，也存在重復(fù)性差、準(zhǔn)確度較低、測(cè)得的平行樣的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差大等缺點(diǎn)，試驗(yàn)通過延長(zhǎng)超聲振蕩的時(shí)間，重復(fù)多次研磨蔗糖粉末，使孢子懸液分布更加均勻，明確計(jì)數(shù)原則減少計(jì)數(shù)誤差，得到令人滿意的試驗(yàn)結(jié)果。但尚有問題亟待解決：因?yàn)橐獙⒋郎y(cè)孢子懸液，用吸管吸取1滴置于蓋玻片的邊緣，使液體緩緩滲入，多余的液體用吸水紙吸取，在這個(gè)操作過程中容易造成氣泡的產(chǎn)生，容易導(dǎo)致每次取樣量不一致，導(dǎo)致結(jié)果存在誤差。后續(xù)研究的重點(diǎn)就是解決因氣泡產(chǎn)生造成的結(jié)果差異性的問題，簡(jiǎn)化分析程序，提高檢測(cè)準(zhǔn)確度，為實(shí)際檢測(cè)工作提供有效參考和數(shù)據(jù)支持。