花椒及花椒制品中羥基-α-山椒素檢測(cè)方法

馬偉，鐘慈平，何成軍，溫泉，杜鋼

四川省食品檢驗(yàn)研究院（成都 611731）

花椒為蕓香科植物青椒（Zanthoxylum schinifoliumSieb.et Zucc）或花椒（Zanthoxylum bungeanumMaxim）除去種子和雜質(zhì)后的干燥成熟果皮。性辛，溫。歸脾、胃、腎經(jīng)。溫中止痛，殺蟲止癢。用于脘腹冷痛，嘔吐泄瀉，蟲積腹痛；外治濕疹[1]。花椒在我國(guó)的應(yīng)用已有兩千余年的歷史，其廣泛用于調(diào)味料、香料及中藥，被譽(yù)為我國(guó)傳統(tǒng)的“八大調(diào)味品”之一[2-3]?；ń吩谌澜缬?50多種，亞洲是花椒主產(chǎn)區(qū)，中國(guó)約有45種，13個(gè)變種[4]。花椒在我國(guó)栽培歷史悠久，范圍廣產(chǎn)量大，主要分布在陜西、四川、甘肅、云南等地，總產(chǎn)量居世界第一[5]。四川作為花椒的主要產(chǎn)區(qū)之一，研究開發(fā)、轉(zhuǎn)化推廣一批新品種、新技術(shù)、新產(chǎn)品、新模式，支撐引領(lǐng)全省花椒產(chǎn)業(yè)的創(chuàng)新發(fā)展[5]。

花椒的化學(xué)成分較復(fù)雜，包括生物堿、揮發(fā)油、脂肪酸、香豆素、酰胺、黃酮苷、甾醇和三萜類等，花椒中富含的揮發(fā)油是香氣的主要來(lái)源[7]，酰胺類物質(zhì)是花椒呈麻味的主要成分，大多為鏈狀不飽和脂肪酰胺類物質(zhì)，其中以羥基-山椒素為代表，具有強(qiáng)烈的刺激性，是衡量花椒品質(zhì)的重要指標(biāo)之一[8-9]。關(guān)于麻味物質(zhì)，相關(guān)研究從花椒果皮中分離出超過(guò)25種花椒麻素[10-13]。較多的有羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素、羥基-γ-山椒素和羥基-ε-山椒素等，其中以花椒中羥基-α-山椒素含量為最高[14-16]。羥基-α-山椒素首次由Yasuda等[17]從日本花椒中分離，是花椒果皮中最早分離出來(lái)的花椒麻素和食物中最主要誘發(fā)獨(dú)特刺痛感（麻味）的化合物。

隨著國(guó)內(nèi)花椒產(chǎn)業(yè)的迅猛發(fā)展，針對(duì)花椒品質(zhì)的等級(jí)分類沒有形成統(tǒng)一量化的標(biāo)準(zhǔn)，嚴(yán)重制約了整個(gè)產(chǎn)業(yè)健康、高質(zhì)的發(fā)展，而針對(duì)麻味物質(zhì)作為衡量花椒品質(zhì)的重要指標(biāo)，至今未出臺(tái)相關(guān)的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。試驗(yàn)通過(guò)對(duì)花椒中麻味物質(zhì)含量最高、最主要誘發(fā)麻味的羥基-α-山椒素檢測(cè)方法進(jìn)行研究，旨在為后期花椒麻素相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的制定提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花椒、花椒粉、花椒油、花椒提取物（產(chǎn)地：四川）；羥基-α-山椒素（純度98.0%，成都普思生物科技股份有限公司）；甲醇、無(wú)水乙醇、乙腈、乙酸乙酯（均為分析純）。

1.2 儀器與設(shè)備

紫外-可見分光光度計(jì)（EVOLUTION 201，Thermo）；電子天平（ME203，METTLER TOLEDO）；渦旋儀（Multi Reax，Heidolph）；超聲儀（IDH30，IRM）；離心機(jī)（ROTANTA 460R，Hettich）。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)品的配制

羥基-α-山椒素儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取29.71 mg羥基-α-山椒素于5 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得羥基-α-山椒素儲(chǔ)備液（質(zhì)量濃度5.823 2 mg/mL，有效期3個(gè)月）。

羥基-α-山椒素：準(zhǔn)確吸取100 μL上述儲(chǔ)備溶液置5 mL容量瓶中，用乙醇定容至刻度，搖勻，即得羥基-α-山椒素標(biāo)準(zhǔn)工作液（質(zhì)量濃度116.464 μg/mL，有效期1個(gè)月）。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別準(zhǔn)確吸取0.05，0.10，0.20，0.30，0.40和0.50 mL上述標(biāo)準(zhǔn)工作液，置于10 mL容量瓶中，用乙醇稀釋至刻度，搖勻，羥基-α-山椒素系列標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度（臨用現(xiàn)配）分別為0.582 3，1.164 6，2.329 3，3.493 9，4.658 6和5.823 2 μg/mL，用分光光度計(jì)在268 nm處，以試劑空白為參比，在1 cm比色皿測(cè)定吸光度，以羥基-α-山椒素的量（μg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 供試樣制備方法

1.3.3.1 提取試劑選擇

分別準(zhǔn)確稱取0.3 g花椒、花椒粉、花椒油和花椒提取物，置于150 mL三角瓶中，分別準(zhǔn)確加入50 mL甲醇、乙腈、無(wú)水乙醇、乙酸乙酯、水，超聲提取15 min，放冷后取適量提取液于4 500 r/min離心5 min。準(zhǔn)確吸取0.1 mL花椒和花椒粉提取液、0.5 mL花椒油提取液、0.025 mL花椒提取物提取液分別置于25 mL容量瓶中，加相應(yīng)提取試劑定容至刻度，搖勻，即得待測(cè)溶液。

1.3.3.2 提取試劑體積選擇

分別準(zhǔn)確稱取0.3 g花椒、花椒粉、花椒油和花椒提取物，置于150 mL三角瓶中，分別準(zhǔn)確加入10，25，50和100 mL無(wú)水乙醇，超聲提取15 min，放冷后取適量提取液以4 500 r/min離心5 min。分別準(zhǔn)確吸取0.02，0.05，0.10和0.20 mL花椒和花椒粉提取液，0.10，0.25，0.50和1.00 mL花椒油提取液，0.02，0.05，0.10和0.20 mL花椒提取物提取液，分別置于25mL（花椒、花椒粉、花椒油提取液）和100 mL（花椒提取物提取液）容量瓶中，加無(wú)水乙醇定容至刻度，搖勻，即得待測(cè)溶液。

1.3.3.3 提取時(shí)間選擇

分別準(zhǔn)確稱取0.3 g花椒、花椒粉、花椒油和花椒提取物，置于150 mL三角瓶中，各準(zhǔn)確加入50 mL無(wú)水乙醇，分別超聲提取5，10，15，30和60 min，放冷后取適量提取液以4 500 r/min離心5 min。分別準(zhǔn)確吸取0.1 mL花椒和花椒粉提取液、0.5 mL花椒油提取液、0.025 mL花椒提取物提取液各置于25 mL容量瓶中，加無(wú)水乙醇定容至刻度，搖勻，即得待測(cè)溶液。

1.3.3.4 提取方式選擇

分別準(zhǔn)確稱取0.3 g花椒、花椒粉、花椒油和花椒提取物，置于150 mL三角瓶中，各準(zhǔn)確加入50 mL無(wú)水乙醇，分別超聲提取15 min、渦旋提取15 min、常溫浸提24 h，放冷后取適量提取液以4 500 r/min離心5 min。分別準(zhǔn)確吸取0.1 mL花椒和花椒粉提取液、0.5 mL花椒油提取液、0.025 mL花椒提取物提取液各置于25 mL容量瓶中，加無(wú)水乙醇定容至刻度，搖勻，即得待測(cè)溶液。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

配制適當(dāng)濃度羥基-α-山椒素對(duì)照品，與處理后樣品分別放入紫外-分光光度計(jì)中進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，掃描結(jié)果見圖1～圖2。結(jié)果發(fā)現(xiàn)其最大吸收峰都為268±1 nm，所以選擇268 nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

圖1 羥基-α-山椒素對(duì)照品掃描圖譜

圖2 花椒樣品掃描圖譜

2.2 提取試劑的選擇

甲醇、乙腈、無(wú)水乙醇、乙酸乙酯、水5種試劑提取羥基-α-山椒素結(jié)果見圖3。結(jié)果發(fā)現(xiàn)提取試劑甲醇、乙腈、乙酸乙酯和無(wú)水乙醇在4品類樣品花椒、花椒油、花椒粉、花椒提取物中提取率無(wú)顯著性差異，水提取率最低，考慮成本及安全性，建議采用無(wú)水乙醇為提取試劑。

圖3 5種提取試劑提取羥基-α-山椒素結(jié)果

2.3 提取體積的選擇

不同提取試劑體積提取羥基-α-山椒素結(jié)果見圖4～圖7。結(jié)果發(fā)現(xiàn)提取溶劑分別為10，25，50和100 mL時(shí)，提取溶劑量對(duì)提取率無(wú)明顯差異，100 mL提取率基本達(dá)到最大。由于花椒制品品類較多，為保證麻味物質(zhì)能完全提取，建議提取試劑100 mL。

圖4 從花椒中用不同無(wú)水乙醇體積提取羥基-α-山椒素結(jié)果

圖5 從花椒油中用不同無(wú)水乙醇體積提取羥基-α-山椒素結(jié)果

圖6 從花椒粉中用不同無(wú)水乙醇體積提取羥基-α-山椒素結(jié)果

圖7 從花椒提取物中用不同無(wú)水乙醇體積提取羥基-α-山椒素結(jié)果

2.4 提取時(shí)間的選擇

圖9 從花椒油中用不同提取時(shí)間提取羥基-α-山椒素結(jié)果

圖10 從花椒粉中用不同提取時(shí)間提取羥基-α-山椒素結(jié)果

不同提取時(shí)間羥基-α-山椒素結(jié)果見圖8～圖11。結(jié)果發(fā)現(xiàn)提取時(shí)間分別為5，10，15，30和60 min時(shí)，花椒、花椒油、花椒粉、花椒提取物提取率均無(wú)明顯差異，15 min提取率基本達(dá)到最大。從提取率及檢測(cè)效率考慮，建議提取時(shí)間15 min。

圖8 從花椒中用不同提取時(shí)間提取羥基-α-山椒素結(jié)果

圖11 從花椒提取物中用不同提取時(shí)間提取羥基-α-山椒素結(jié)果

2.5 提取方式的選擇

不同方式提取羥基-α-山椒素結(jié)果見圖12。結(jié)果發(fā)現(xiàn)提取方式分別為超聲提取、渦旋提取、浸泡提取時(shí)，花椒、花椒油、花椒粉、花椒提取物提取率基本相同，從檢測(cè)方便性及檢測(cè)效率出發(fā)考慮，建議采用超聲的提取方式。

圖12 3種提取方式提取羥基-α-山椒素結(jié)果

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

配制0.582 3～5.823 2 μg/mL質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液（現(xiàn)用現(xiàn)配），用分光光度計(jì)在268 nm處，以試劑空白為參比，測(cè)定吸光度，以羥基-α-山椒素的質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖13所示。結(jié)果表明在現(xiàn)有濃度范圍內(nèi)線性回歸方程為Y=0.165 9X-0.001，r=0.999 9，線性良好。

圖13 羥基-α-山椒素標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.7 回收率考察

采用優(yōu)化后的條件進(jìn)行方法回收率考察。由于樣品的稀釋倍數(shù)較大，采取增大稱樣量即測(cè)得已知樣品含量后加入樣品的加標(biāo)方式考察該方法的可行性，結(jié)果見表1。結(jié)果表明平均回收率在96.8%～97.8%，SRSD＜4%。

2.8 方法精密度考察

準(zhǔn)確取花椒、花椒粉、花椒油、花椒提取物各0.3 g，各6份，置于錐形瓶中，按照優(yōu)化好的方法條件進(jìn)行提取和稀釋，供紫外分光光度計(jì)測(cè)定，計(jì)算方法精密度，結(jié)果見表2。結(jié)果表明SRSD＜3%，方法精密度良好。

2.9 方法穩(wěn)定性考察

取質(zhì)量濃度為2.3 μg/mL的對(duì)照品溶液和質(zhì)量濃度約為2.2 μg/mL的樣品溶液，分別于0，2，4，18，20和24 h在紫外分光光度計(jì)268 nm處測(cè)定吸光度，結(jié)果見表3。結(jié)果表明，對(duì)照品溶液和樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

表3 對(duì)照品溶液和樣品溶液紫外穩(wěn)定性結(jié)果

2.10 不同產(chǎn)地花椒中羥基-α-山椒素成分分析

通過(guò)表4數(shù)據(jù)比對(duì)可以得出四川、甘肅和陜西3地紅花椒中羥基-α-山椒素含量以四川最高101.22 mg/g，陜西最低57.76 mg/g，竹葉花椒中羥基-α-山椒素含量相比較于3地紅花椒和青花椒含量最低，為46.88 mg/g。

表4 不同產(chǎn)地花椒樣品中羥基-α-山椒素含量比對(duì)

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)花椒及花椒制品中羥基-α-山椒素檢測(cè)方法進(jìn)行研究，通過(guò)全波長(zhǎng)掃描確定該方法的檢測(cè)波長(zhǎng)為268 nm，最終確定該方法供試品的制備以乙醇為提取試劑，提取溶劑體積100 mL，提取時(shí)間15 min，提取方式采用超聲，該方法得出在質(zhì)量濃度范圍0.582 3～5.823 2 μg/mL時(shí)線性回歸方程Y=0.165 9X-0.001，r=0.999 9，線性良好，方法精密度良好，SRSD＜3%，平均加標(biāo)回收率在96.8%～97.8%之間，該方法對(duì)照品溶液和樣品溶液在24 h內(nèi)檢測(cè)穩(wěn)定性良好，SRSD＜3%。該方法通過(guò)對(duì)關(guān)鍵參數(shù)的研究，提供一種簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確測(cè)定花椒及花椒制品中羥基-α-山椒素的檢測(cè)方法，為后期麻味物質(zhì)檢測(cè)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的出臺(tái)提供參考依據(jù)。該方法可對(duì)全國(guó)范圍內(nèi)的花椒及其制品中羥基-α-山椒素的含量進(jìn)行研究，以考察全國(guó)不同產(chǎn)區(qū)、品種花椒麻味物質(zhì)含量分布，為花椒產(chǎn)業(yè)的發(fā)展奠定良性基礎(chǔ)。