超高效液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)分析黃芩-槐花藥對(duì)活性成分及其治療慢性腎臟病的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

管怡晴，鄭鑫楠，顏夢(mèng)秋，吳煥賢，張國(guó)華*，呂 琳*

超高效液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)分析黃芩-槐花藥對(duì)活性成分及其治療慢性腎臟病的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

管怡晴1，鄭鑫楠2，顏夢(mèng)秋2，吳煥賢2，張國(guó)華1*，呂 琳2*

1. 南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，廣東 廣州 510080 2. 南方醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 510080

分析鑒定黃芩-槐花藥對(duì)的活性成分，探究活性成分治療慢性腎臟病（chronic kidney disease，CKD）的潛在作用機(jī)制。采用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（UPLC-ESI-TOF/MS）技術(shù)，對(duì)黃芩-槐花有效成分進(jìn)行分析，結(jié)合中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)查找黃芩-槐花中有效成分的作用靶點(diǎn)。分別在比較毒物基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)（comparative toxicogenomics database，CTD)、在線人類孟德?tīng)栠z傳數(shù)據(jù)（online mendelian inheritance in man，OMIM）、GeneCards和DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)中以“Chronic kidney disease，CKD”為關(guān)鍵詞，查找疾病相關(guān)蛋白，用Venny圖取交集篩選出二者共同作用靶點(diǎn)。利用Cytoscape 3.8.2軟件構(gòu)建“活性成分靶點(diǎn)-疾病”的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，運(yùn)用String數(shù)據(jù)庫(kù)獲取蛋白相互作用關(guān)系（Protein-protein interation，PPI），將疾病和有效成分的共同核心蛋白進(jìn)行基因本體論（Gene ontology，GO）以及京都基因組百科全書(shū)（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析，并構(gòu)建“核心靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖。黃芩-槐花藥對(duì)共鑒別出29種有效活性成分，其中槲皮素、染料木素、漢黃芩素、山柰酚等17種關(guān)鍵活性成分的作用靶點(diǎn)與疾病相關(guān)蛋白取交集，共篩選出包括白介素-6（interleukin-6，IL-6）、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor-A，VEGFA）、趨化因子-8（chemokine factor-8，CXCL-8）等36個(gè)核心靶點(diǎn)。對(duì)關(guān)鍵作用靶點(diǎn)進(jìn)行通路富集分析，黃芩-槐花藥對(duì)中有效成分主要通過(guò)磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）-絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶 B（protein kinase，PKB，AKT）、Janus激酶（janus kinase，JAK）-信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子（signal transducer and activator of transcription，STAT）、白介素-17（interleukin-17，IL-17）、晚期糖基化終末化產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGE）及晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（receptor for dvanced glycation end products，RAGE）等信號(hào)通路對(duì)慢性腎臟病發(fā)揮治療作用。確定了黃芩-槐花藥對(duì)中含有的29種有效成分，分析出黃酮類、類黃酮類、黃酮醇類以及皂苷類4類化合物中主要成分漢黃芩苷、槲皮素、山柰酚和槐花皂苷III的質(zhì)譜裂解規(guī)律；探究黃芩-槐花藥對(duì)在治療CKD中的潛在機(jī)制，為后續(xù)臨床應(yīng)用提供科學(xué)的理論基礎(chǔ)。

黃芩；槐花；藥對(duì)；UPLC-ESI-TOF/MS；慢性腎臟??；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；漢黃芩苷；槲皮素；山柰酚；槐花皂苷III

慢性腎臟?。╟hronic kidney disease，CKD）是因?yàn)槟I臟功能或生理結(jié)構(gòu)改變所導(dǎo)致的一種臨床綜合癥，具有不可逆和緩慢進(jìn)行的特點(diǎn)。根據(jù)2021年世界腎臟大會(huì)提出的最新報(bào)告，全球約有11.7%的人患有慢性腎臟病[1]。我國(guó)慢性腎臟病的患病率同樣高達(dá)10.8%，且其發(fā)病率一直都在不斷上升中。然而，由于CKD患者在早中期并不表現(xiàn)出明顯的癥狀，直到晚期才會(huì)出現(xiàn)典型腎功能不全的并發(fā)癥，因此慢性腎臟疾病已成為人類健康生活中不可忽視的潛在殺手。

目前，CKD的臨床治療手段分為保守治療與替代治療2種[2]。然而2種治療方法均具有價(jià)格昂貴、患者耐受性差、治療時(shí)間長(zhǎng)的缺點(diǎn)。因此，尋找有效的輔助療法就變得十分重要。中醫(yī)藥在CKD的臨床治療中有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，某些單味中藥及其提取物以及一些中藥復(fù)方可以減輕炎癥損傷，延緩CKD進(jìn)展，且治療具有不良反應(yīng)較小、價(jià)格相對(duì)便宜的優(yōu)勢(shì)。

在我國(guó)，黃芩至少有兩千年的藥用歷史，據(jù)中醫(yī)四大經(jīng)典著作之一的《神農(nóng)本草經(jīng)》記載，黃芩具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血、安胎的作用，現(xiàn)已正式收錄于《中國(guó)藥典》2020年版、《歐洲藥典》（EP 9.0版）和《英國(guó)藥典》（BP 2018版）[3]?；被ǔ鲎浴度杖A子本草》，具有一千多年的藥用歷史，其可清肝瀉火、涼血止血。大量臨床研究證明，黃芩與槐花中含有許多活性成分，且對(duì)慢性腎臟病具有獨(dú)特的治療作用。黃芩素、黃芩苷、蘆丁、槲皮素、槐花皂苷等均具有抗炎效果[3-5]。黃芩苷、黃芩素等黃酮類提取物在小鼠體外關(guān)節(jié)炎中能緩解踝關(guān)節(jié)腫脹[6-7]。此外，漢黃芩苷可通過(guò)減少細(xì)胞產(chǎn)生的炎癥介質(zhì)一氧化氮（nitric oxide，NO）和前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2），抑制促炎細(xì)胞因子的釋放[8-10]。同時(shí)有臨床實(shí)驗(yàn)證明漢黃芩素通過(guò)抑制炎癥因子進(jìn)而對(duì)慢性腎臟病有較好的緩解作用。此外，槲皮素已被證明可用于治療炎性腸病，其抗氧化劑作用與抑制促炎性介質(zhì)的釋放作用具有廣闊的研究前景[11-13]。南方醫(yī)科大學(xué)張國(guó)華教授首次提出利用黃芩-槐花輔助治療慢性腎臟疾病，且療效較為顯著[14]。但現(xiàn)階段對(duì)此藥對(duì)的有效成分尚不清楚，且其具體作用機(jī)制仍需探究。本研究采用UPLC-ESI-TOF/MS技術(shù)對(duì)黃芩-槐花中的多種化學(xué)成分進(jìn)行分析鑒定，并通過(guò)生物信息學(xué)分析手段，構(gòu)建多成分、多靶點(diǎn)的相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，探究黃芩-槐花中有效成分可能的調(diào)控機(jī)制，為此藥對(duì)的臨床運(yùn)用提供充分的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 儀器與設(shè)備

島津LC-30A色譜儀，AB Sciex Triple TOF 5600+質(zhì)譜儀，C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm，Thermo Scientific，美國(guó)），Xcalibur 2.2.0化學(xué)工作站Centrifuge5702型離心機(jī)（Eppendorf），AL204型電子天平（梅特勒-托利多公司），KQ3200DE型超聲超聲清洗器（江蘇省昆山市超聲儀器有限公司），超純水制備儀（Millipore），0.22 μm微孔濾膜（Pall Corporation 6229286）。

1.2 材料

黃芩（批號(hào)70704610）、槐花（批號(hào)7110901）免煎顆粒均購(gòu)自南方醫(yī)院，為廣東一方制藥有限公司生產(chǎn)。對(duì)照品漢黃芩苷（批號(hào)P09J8F28374）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司、槲皮素（批號(hào)LP087-201408）、山柰酚（批號(hào)LP057-201406）購(gòu)自沈陽(yáng)瀧浦科技有限公司，對(duì)照品質(zhì)量分?jǐn)?shù)均≥98%。甲醇（分析純，天津大茂化學(xué)試劑廠），甲醇色譜純（OCEANPAK ME-00040203），甲酸色譜純（Aladdin K1414066），乙腈色譜純（OCEANPAK 000406281/03），實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

2 方法

2.1 供試品溶液的制備

分別精密稱取黃芩、槐花樣品各0.3 g至10 mL EP管中，加入甲醇-水溶液8 mL，超聲處理30 min，13 000 r/min，離心10 min，取上清，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，裝入1.5 mL自動(dòng)進(jìn)樣瓶?jī)?nèi)，最終獲得黃芩-槐花藥對(duì)的樣品提取液?？瞻讓?duì)照樣品也經(jīng)相同條件與步驟處理。將處理好的提取物置于4 ℃的冷藏環(huán)境儲(chǔ)存，在分析前取出，保存時(shí)間不能超過(guò)24 h。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱取漢黃芩苷、槲皮素、山柰酚對(duì)照品適量，用70%甲醇水溶液溶解，配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液，?20 ℃保存?zhèn)溆谩＞芰咳? mg/mL的各儲(chǔ)備液用甲醇稀釋后得到混合對(duì)照品溶液。

2.3 色譜條件

HALO C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，2.7 μm）；流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），柱溫為40 ℃，體積流量0.3 mL/min，進(jìn)樣量為5 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)為360 nm。梯度洗脫條件見(jiàn)表1。

2.4 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（electronic spray ion，ESI）正負(fù)離子模式掃描，正離子電壓為5500 V，離子源溫度為 600 ℃，去簇電壓（declustering power，DP）為100 V，碰撞能量（collision energy，CE）為35 V，碰撞能量擴(kuò)展（collision energy expansion，CES）為15 V。負(fù)離子電壓為?4500 V，離子源溫度為500 ℃，DP分別為100 V，CE分別為?35 V，CES為15 V。霧化氣體為氮?dú)?，GS1壓強(qiáng)為413 kPa，GS2壓強(qiáng)為344 kPa，輔助氣為275 kPa。一級(jí)質(zhì)譜母離子掃描范圍為/50～1000，IDA設(shè)置響應(yīng)值超過(guò)100 cps的6個(gè)最高峰進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，子離子掃描范圍為/50～1000，開(kāi)啟動(dòng)態(tài)背景扣除（dynamic background subtraction，DBS）。

表1 色譜洗脫梯度條件

Table 1 Gradient conditions of chromatographic elution

tR/minA/%B/% 0.01955 15.007030 30.00995 32.00595 35.000100

2.5 質(zhì)譜分析

對(duì)樣品溶液所得總離子流圖進(jìn)行分析，推測(cè)成分的分子式，并與中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)（traditional chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP，http:// libts.hkbu.edu.hk lLSP/tcmsp.php）數(shù)據(jù)庫(kù)[15]中收錄的中藥成分進(jìn)行比對(duì)，初步確定各化合物類型后，將得到的化合物進(jìn)行分類，根據(jù)各化合物所屬大類的質(zhì)譜裂解規(guī)律，質(zhì)譜碎裂的分子離子峰與碎片離子峰同時(shí)參照相關(guān)文獻(xiàn)推測(cè)化合物在負(fù)離子模式下的裂解路徑，并與所得二級(jí)質(zhì)譜圖進(jìn)行比對(duì)。

2.6 黃芩-槐花藥對(duì)活性成分靶點(diǎn)篩選和疾病靶點(diǎn)匯集

借助TCMSP（http://libts.hkbu.edu.hk lLSP/ tcmsp.php）檢索出黃芩槐花所含的29種有效成分，包括蘆丁、漢黃芩苷、槲皮素、黃芩素、山柰酚、漢黃芩素等，同時(shí)匯集活性成分對(duì)應(yīng)的有效靶點(diǎn)，將納入的活性化合物和有效靶點(diǎn)進(jìn)行刪除重復(fù)值處理，最后以表格形式闡明化合物基本信息。

CTD數(shù)據(jù)庫(kù)有助于了解影響疾病的分子機(jī)制以及基因和蛋白質(zhì)之間復(fù)雜的相互作用網(wǎng)絡(luò)。OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)側(cè)重于呈現(xiàn)疾病表型與其致病基因的關(guān)聯(lián)。GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)可查詢基因的基本功能，還可查詢疾病相關(guān)的基因列表。DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)是臨床導(dǎo)向的藥品百科全書(shū)，可提供藥物靶目標(biāo)、藥物作用機(jī)制的詳細(xì)信息。分別在CTD（http://lctdbase.org/）、OMIM（https://llomim.org/）、GeneCards（https://l/www.genecards.org/）和DrugBank（https://llgo.drugbank.com/）數(shù)據(jù)庫(kù)中以“chronic kidney disease”為關(guān)鍵詞進(jìn)行查詢，得到與CKD相關(guān)的基因，整合各數(shù)據(jù)庫(kù)的結(jié)果，刪除重復(fù)結(jié)果，得到疾病相關(guān)蛋白。

2.7 Venny分析共有靶點(diǎn)

為了進(jìn)一步得到黃芩-槐花中29種有效成分治療CKD的潛在靶點(diǎn)，將篩選得到的269個(gè)CKD相關(guān)蛋白與黃芩-槐花有效活性成分的246個(gè)治療靶點(diǎn)信息分別導(dǎo)入U(xiǎn)niport（https://www.uniprot org/）網(wǎng)站進(jìn)行Gene Symbol轉(zhuǎn)換，利用Venny2.1.0（http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）軟件取交集篩選獲得靶基因。

2.8 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過(guò)String 10.0軟件（http://string db.org）分析黃芩-槐花治療慢性腎臟病靶基因之間的相互作用，設(shè)定置信度閾值＞0.7,得到相互作用關(guān)系，將其導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2中，利用富集插件cytohubba篩選核心靶點(diǎn)，并構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖，將結(jié)果可視化。

2.9 基因本體論（gene ontology，GO）以及京都基因組百科全書(shū)（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析

通過(guò)Cytoscape插件BiNGO3.0.3對(duì)目的基因進(jìn)行GO以及KEGG分析，進(jìn)一步了解靶基因的功能及在信號(hào)通路中的調(diào)節(jié)作用，設(shè)定＜0.01篩選相應(yīng)的GO條目，繪制功能富集圖。應(yīng)用Clue GO插件繪制信號(hào)通路圖，選擇前10條通路進(jìn)行分析。

3 結(jié)果

3.1 黃芩-槐花藥對(duì)的正、負(fù)離子流圖

通過(guò)采用液質(zhì)聯(lián)用飛行時(shí)間質(zhì)譜儀對(duì)黃芩-槐花提取物進(jìn)行分析，得到該藥對(duì)的正、負(fù)離子流圖，如圖1所示。

3.2 有效成分鑒定及分類

與TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中收錄的中藥成分進(jìn)行比對(duì)，共檢測(cè)到29種中藥活性成分，根據(jù)化合物的母環(huán)以及取代基的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，對(duì)以上活性成分進(jìn)行分類以及對(duì)應(yīng)離子碎片結(jié)果見(jiàn)表2。

圖1 黃芩-槐花藥對(duì)提取物(空白組背景扣除) 正 (A)、負(fù)(B) 離子模式下總離子流圖

表2 UPLC-Q-TOF-MS黃芩槐花藥對(duì)中含有的化合物

Table 2 Compounds ofSB-SJdrug pairby UPLC-Q-TOF-MSanalysis

序號(hào)tR/min分類名稱MS (m/z)加合離子分子式 110.32查耳酮類2,6,2′,4′-四羥基-6′-甲氧基查耳酮301.072 [M＋H]+C16H14O6 28.01類黃酮類蘆丁609.145[M＋H] +C27H30O16 38.90山柰酚-3-O-蕓香糖苷593.151[M＋H] +C27H30O15 48.53槲皮素301.035[M＋H]+C15H10O7 512.73黃酮類漢黃芩苷459.092[M＋H] +C22H20O11 610.73黃芩苷445.077[M＋H]+C21H18O11 718.37黃芩新素II373.093[M＋H]+C19H18O8 815.05黃芩素269.046[M＋H]+C15H10O5 914.60去甲漢黃芩素269.046[M＋H]+C15H10O5 1018.03漢黃芩素283.062[M＋H]+C16H12O5 1111.06粘毛黃芩素III345.061[M＋H]+C17H14O8 1218.23白楊素253.051[M＋H]+C15H10O4 1319.14黃芩黃酮343.082[M＋H]+C18H16O7 1418.62黃芩黃酮I313.072[M＋H]+C17H14O6 1515.29粘毛黃芩素II329.066[M＋H]+C17H14O7

續(xù)表2

序號(hào)tR/min分類名稱MS (m/z)加合離子分子式 1617.33皂苷類（五環(huán)三萜）大豆皂苷Bb941.512[M＋H]+C48H78O18 1717.93槐花皂苷III925.517[M＋H]+C48H78O17 1811.39二氫黃芩素447.093[M＋H]+C21H20O11 199.34二氫黃芩苷447.092[M＋H]+C21H20O11 2011.585,7,2′,6′-四羥基二氫黃酮醇287.050[M＋H]+C15H12O6 2113.41滇黃芩新苷301.720[M＋H]+C16H14O6 2210.737,2′,6′-三羥基-5-甲氧基二氫黃酮297.040[M＋H]+C16H10O6 2318.70二氫木蝴蝶素A285.077[M＋H]+C16H14O5 2411.04二氫黃酮醇類左旋圣草素287.056[M＋H]+C15H12O6 2510.73異黃酮類染料木素269.045[M＋H]+C15H10O5 2610.322,6,2′,4′-四羥基-6′-甲氧基查耳酮301.072[M＋H]+C16H14O6 2712.44黃酮醇類粘毛黃芩素I301.036[M＋H]+C15H10O7 2814.57山柰酚285.041[M＋H]+C15H10O6 2914.90異鼠李素315.051[M＋H]+C16H12O7

3.3 有效成分分析

從29種化合物中，選取漢黃芩苷（黃酮類）、槲皮素（類黃酮類）、山柰酚（黃酮醇類）以及槐花皂苷III（皂苷類）4種代表性化合物進(jìn)行波譜解析。

3.3.1 漢黃芩苷 負(fù)離子模式下，質(zhì)譜圖顯示化合物相對(duì)分子質(zhì)量為/459.092 9，見(jiàn)圖2。在TCMSP中與黃芩-槐花有關(guān)的中藥化合物成分進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)漢黃芩苷的相對(duì)分子質(zhì)量與其相近，漢黃芩苷為黃酮類取代衍生化合物，其相對(duì)分子質(zhì)量為459.092 9，在高能碰撞的正離子掃描模式下，此化合物往往先丟失1個(gè)電子，從而生成質(zhì)量為459的碎片離子峰。在正離子掃描模式下，由于漢黃芩苷為葡萄糖醛酸取代的黃酮類衍生物，較易先脫去葡萄糖醛酸部分[M－193]，即首先丟失1分子葡萄糖醛酸自由基，得到碎片離子/283。接下來(lái)，脫去母環(huán)上的甲基自由基，得到碎片離子/268。根據(jù)以上規(guī)律，將各個(gè)標(biāo)志性碎片離子與得到的二級(jí)質(zhì)譜圖比對(duì)，發(fā)現(xiàn)主要碎片質(zhì)量基本一致，結(jié)合以往文獻(xiàn)報(bào)道[16]進(jìn)一步可確定此化合物即為漢黃芩苷，漢黃芩苷的二級(jí)質(zhì)譜以及可能的裂解途徑如圖2所示。

圖2 漢黃芩苷的一級(jí)(A)、二級(jí)(B) 質(zhì)譜圖和可能的裂解途徑 (C)

3.3.2 槲皮素 在負(fù)離子模式下，通過(guò)質(zhì)譜圖獲得的化合物相對(duì)分子質(zhì)量為/301.035 8，見(jiàn)圖3，經(jīng)比對(duì)，發(fā)現(xiàn)槲皮素與之相匹配，槲皮素的相對(duì)分子質(zhì)量為302.238 7，其在高能碰撞的負(fù)離子的掃描模式下，此類化合物往往發(fā)生丟失1個(gè)氫離子，從而生成質(zhì)量為301的碎片離子峰。在負(fù)離子掃描模式下它的準(zhǔn)分子離子裂解規(guī)律為標(biāo)志性的逆-迪爾斯-阿德裂解，即RDA裂解[17]，從而分離出標(biāo)志性的碎片離子/283、175、151。由于槲皮素易發(fā)生中性碎片丟失，脫去H2O，即脫去C環(huán)3位上的羥基與B環(huán)6′位氫，脫水后得到碎片離子/283。通過(guò)RDA反應(yīng)，C環(huán)裂解，分別得到碎片離子/151和/175。根據(jù)以上規(guī)律，將各個(gè)標(biāo)志性碎片離子與得到的碎片離子峰圖對(duì)比，標(biāo)志性碎片的相對(duì)分子質(zhì)量相同，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)記載的裂分規(guī)律可進(jìn)一步推斷該化合物即為槲皮素，槲皮素可能的分子裂解途徑見(jiàn)圖3。

3.3.3 山柰酚 在負(fù)離子模式下，通過(guò)MS譜圖獲得的化合物相對(duì)分子質(zhì)量為/285.041 4，見(jiàn)圖4，與黃芩-槐花有關(guān)的中藥化合物成分比對(duì)后，確定與之相對(duì)分子質(zhì)量最相似的化合物為山柰酚，通過(guò)二級(jí)質(zhì)譜，進(jìn)一步確定山柰酚為黃酮醇類化合物，中間環(huán)被羥基取代導(dǎo)致其穩(wěn)定性較弱，裂解規(guī)律為此環(huán)失去1個(gè)羰基和取代的羥基 [M－28－17]，生成相對(duì)分子質(zhì)量為239的標(biāo)志性離子峰。然后，脫去母環(huán)上的3個(gè)小分子羥基[M－52]，生成相對(duì)分子質(zhì)量為187的標(biāo)志性離子峰。黃酮醇類化合物由于羥基取代，因此較少發(fā)生RDA裂解[18]，而是發(fā)生上述方式的裂解，見(jiàn)圖4。根據(jù)此規(guī)律，將各個(gè)標(biāo)志性碎片離子與得到的碎片離子峰圖對(duì)比，標(biāo)志性碎片的相對(duì)分子質(zhì)量相當(dāng)，確定此化合物為山柰酚。

圖3 槲皮素的一級(jí)(A)、二級(jí)(B) 質(zhì)譜圖和可能的裂解途徑(C)

圖4 山柰酚的一級(jí)(A)、二級(jí)(B) 質(zhì)譜圖和可能的裂解途徑(C)

3.3.4 槐花皂苷III 如圖5所示，在負(fù)離子模式下，通過(guò)MS譜圖獲得的化合物分子質(zhì)量為/925.5174，在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中尋找相關(guān)成分，發(fā)現(xiàn)槐花皂苷III質(zhì)量與其相近，故初步確定其為槐花皂苷。接下來(lái)對(duì)其進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析。在其二級(jí)質(zhì)譜圖中可以觀察到2個(gè)離子峰之間相差416，根據(jù)環(huán)三萜類皂苷裂解規(guī)律，此類化合物首先斷開(kāi)末端的鼠李糖[19]，然后脫去小分子基團(tuán)如羥基，羧基等相連的碎片峰，最后進(jìn)行RDA裂解。此裂解方式為五環(huán)三萜類皂苷天然化合物的標(biāo)志裂解，將各個(gè)標(biāo)志性碎片離子與得到的碎片離子峰圖對(duì)比，標(biāo)志性碎片的相對(duì)分子質(zhì)量相當(dāng)，進(jìn)一步確定此化合物為槐花皂苷III?；被ㄔ碥盏亩?jí)質(zhì)譜以及推測(cè)裂解途徑如圖5所示。

3.4 活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的建立和拓?fù)浞治?/h3>

借助TCMSP搜索質(zhì)譜分析中檢測(cè)出的29種活性成分，包括蘆丁、漢黃芩苷、槲皮素、黃芩素、山奈酚、漢黃芩素等，刪除重復(fù)并去除假陽(yáng)性，整合得到17種有效成分及246個(gè)靶點(diǎn)。其中，槲皮素作用靶點(diǎn)最多，為127個(gè)，其次是染料木素75個(gè)，漢黃芩素72個(gè)（表3）。利用Cytoscape 3.8.2構(gòu)建活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖（圖6），該網(wǎng)絡(luò)涉及266個(gè)節(jié)點(diǎn)和493條邊，外圍節(jié)點(diǎn)代表化合物，中央節(jié)點(diǎn)表示藥物靶點(diǎn)，每條邊代表化合物與靶點(diǎn)之間的互作關(guān)系。

3.5 潛在靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

分別在CTD、OMIM、GeneCard和DrugBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中以“Chronic kidney disease，CKD”為關(guān)鍵詞進(jìn)行查詢，整合各數(shù)據(jù)庫(kù)的結(jié)果，去除重復(fù)結(jié)果，篩選出269個(gè)CKD相關(guān)靶點(diǎn)，應(yīng)用Venny2.1.0軟件獲得40個(gè)藥物與疾病的共有靶點(diǎn)（圖7）。為了進(jìn)一步探究黃芩-槐花的有效成分在治療慢性腎臟病中的潛在靶點(diǎn)，運(yùn)用Cytoscape 3.8.2軟件繪制有效成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)的作用關(guān)系（圖8），藍(lán)節(jié)點(diǎn)代表黃芩-槐花藥對(duì)有效成分靶點(diǎn)，綠節(jié)點(diǎn)代表CKD疾病相關(guān)蛋白，連線表示兩者的相互作用。

3.6 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

基于String和Cytoscape3.8.2軟件構(gòu)建有效成分與疾病相關(guān)靶點(diǎn)的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，并利用cytohubba 插件篩選核心靶點(diǎn)（圖9）。該圖由36個(gè)蛋白質(zhì)節(jié)點(diǎn)和125條邊組成，邊代表蛋白間相互作用關(guān)系，線條越多表示關(guān)聯(lián)度（degree）越大，節(jié)點(diǎn)的大小和顏色均代表degree值的大小。依據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)性質(zhì)可知，有較多節(jié)點(diǎn)的化合物或藥物靶點(diǎn)在整個(gè)網(wǎng)絡(luò)中可能起到核心作用，由此預(yù)測(cè)黃芩-槐花藥對(duì)中的關(guān)鍵蛋白可直接干預(yù)CKD的作用機(jī)制，靶點(diǎn)及值排名見(jiàn)表4。

3.7 GO與KEGG通路分析

對(duì)核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO和KEGG富集分析，以＜0.05為篩選閾值，選取前10的GO分析（圖10），GO分析包括生物過(guò)程（biological process，BP）、細(xì)胞組分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）；對(duì)前20的KEGG代謝通路繪制氣泡圖（圖11），氣泡面積代表通路富集基因數(shù)，面積越大，則參與該功能的靶基因越多，氣泡顏色代表值大小，顏色越紅，值越小。黃芩-槐花藥對(duì)治療CKD的GO分析中BP與上皮細(xì)胞增殖（epithellal cell prollferation）、氧化應(yīng)激（response to oxidative stress）、活性氧代謝（reactive oxgen spocies metabolic process）、酪氨酸磷酸化（reguation of pepioyr tyrosine poshryatot）、JAK-STAT通路等相關(guān)。在CC中作用靶點(diǎn)主要富集在膜筏（membrane raft）、胞質(zhì)囊腔（cytoplasmicvesicle lumen）、膜微區(qū)（membrane microdomain）、胞吞泡（endocytic vesiclet）、RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控（RNA polymerase II transcription factor complex）等。而MF方面靶點(diǎn)主要富集在細(xì)胞因子受體結(jié)合（cyokine receptor binding）、生長(zhǎng)因子受體結(jié)合（growth factor receptor binding）、蛋白磷酸化（protein phosphatase binding）等。黃芩-槐花藥對(duì)治療CKD的KEGG代謝通路與動(dòng)脈粥樣硬化（lipid and atherosclerosis，degree 16）、PI3K-Akt（degree 15）、晚期糖基化（AGE-RAGE，degree 15）、JAK-STAT（degree 13）、流體剪切應(yīng)力（fluid shear stress and atherosclerosis，degree 13）、缺氧誘導(dǎo)因子1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1，degree 11）等密切相關(guān)。

表3 黃芩-槐花藥對(duì)活性成分靶點(diǎn)預(yù)測(cè)基本信息預(yù)測(cè)

Table 3 Prediction potential targets of active ingredients of SB-SJdrug pair

MOL ID活性成分degree值MOL ID活性成分degree值 MOL000098槲皮素127MOL002560白楊素11 MOL000481染料木素75MOL002927黃芩新素II11 MOL000173漢黃芩素72MOL002932黃芩黃酮Ⅰ9 MOL000422山柰酚50MOL002919粘毛黃芩素III7 MOL002714黃芩素28MOL000525去甲漢黃芩素6 MOL012266黃芩黃酮22MOL005190左旋圣草素5 MOL003653槐花皂苷III19MOL002916粘毛黃芩素II4 MOL000415蘆丁17MOL0029255,7,2′,6′-四羥基二氫黃酮醇3 MOL002917粘毛黃芩素II17

圖6 黃芩-槐花藥對(duì)活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

圖7 黃芩-槐花藥對(duì)活性成分-慢性腎臟病靶基因韋恩圖

圖8 藥物活性成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖

圖9 活性成分-疾病靶點(diǎn)互作網(wǎng)絡(luò)圖

表4 黃芩-槐花藥對(duì)中的關(guān)鍵靶點(diǎn)預(yù)測(cè)及P值排序

Table 4 Prediction of key targets and ordering of P values of SB-SJdrug pair

核心靶點(diǎn)P值核心靶點(diǎn)P值核心靶點(diǎn)P值 IL-621CCL-210CCND15 STAT317MAPK110APOA14 TNF17TP5310CRP3 VEGFA13FN-19NOS33 CXCL-812INS9PPARG3 IL-1312STAT19SPP13 IL-1β12EGF8CFTR2 IL-412ICAM17HMOX12 AKT111IFNG7ATM1 EGFR11MMP67MPO1 IL-1011MYC6PON11 IL-211

3.8 有效成分-核心靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

根據(jù)蛋白靶點(diǎn)與信號(hào)通路之間的相互作用關(guān)系，選取關(guān)鍵的前20條可能與CKD相關(guān)的通路，同時(shí)與黃芩-槐花活性成分的作用靶點(diǎn)一一對(duì)應(yīng)，構(gòu)建活性成分-CKD核心靶點(diǎn)-通路多維網(wǎng)絡(luò)圖（圖12）。節(jié)點(diǎn)的degree值代表網(wǎng)絡(luò)中與該節(jié)點(diǎn)相連的邊的數(shù)量。黃芩-槐花藥對(duì)有效成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖含有53個(gè)節(jié)點(diǎn)、32條通路、21個(gè)個(gè)靶點(diǎn)、以及446條邊；最大degree值為16，最小為1，平均degree值8.4，其中13個(gè)靶點(diǎn)，18條通路在平均值以上。

4 討論

現(xiàn)代研究表明，CKD的發(fā)生發(fā)展過(guò)程與氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、血管硬化以及自身免疫等病理生理機(jī)制密切相關(guān)[20]。黃芩作為一種傳統(tǒng)植物，在中國(guó)已有數(shù)千年的藥用歷史，多項(xiàng)研究表明黃芩通過(guò)抑制促炎因子IL-1β、IL-18、TNF-α的產(chǎn)生，發(fā)揮顯著的免疫抑制作用，廣泛應(yīng)用于肝炎、肺炎、腸炎、過(guò)敏反應(yīng)、痢疾、呼吸道感染等疾病的治療[21]。同時(shí)課題組前期研究證明漢黃芩素可治療慢性腎臟疾病，其通過(guò)抑制炎癥因子的產(chǎn)生以及抑制氧化應(yīng)激通路來(lái)達(dá)到調(diào)節(jié)腸道菌群，進(jìn)而減輕腎臟損傷[14]。

本研究定性鑒別了黃芩-槐花藥對(duì)中29種活性成分，如黃芩素、黃芩苷以及槐花中含有的蘆丁、槲皮素、槐花皂苷等，這些活性成分都已證明具有抗炎效果。如黃芩苷可通過(guò)上調(diào)腸內(nèi)NF-κB和p65蛋白水平，激活NF-κB信號(hào)通路，以提高下游抗炎細(xì)胞因子和IL-8、IL-6、IL-10、IFN-γ的蛋白表達(dá)水平，降低腸道炎癥和氧化作用，從而治療潰瘍性腸道炎癥[22-23]。此外，漢黃芩苷已被證明可通過(guò)減少巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的肺浸潤(rùn)來(lái)改善脂多糖誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷[24]。姜紅寶等[25]研究者證明蘆丁可改善四氧嘧啶誘導(dǎo)的糖尿病腎病大鼠，其機(jī)制可能與抑制醛糖還原酶活性和消除氧自由基有關(guān)，阻止葡萄糖轉(zhuǎn)變?yōu)樯嚼娲迹瑴p弱山梨醇通路對(duì)大鼠造成的損害。另外，蘆丁可降低腎組織脂質(zhì)過(guò)氧化物酶（lipid peroxidase，LPO）活性，延緩氧自由基對(duì)機(jī)體的進(jìn)一步損傷。蘆丁還可通過(guò)NO-鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶途徑產(chǎn)生內(nèi)皮依賴性的血管舒張作用[26]。有研究表明槲皮素與蘆丁有相似的抗氧化以及血管舒張作用[27]，同時(shí)，槲皮素還被證明對(duì)口腔癌、多發(fā)性骨髓癌、白血病等多種癌癥具有化學(xué)治療作用[28-30]。另外，槲皮素能夠顯著抑制急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型大鼠的腫脹程度，降低炎癥反應(yīng)，減少炎癥因子IL-1β、COX-2及NO水平，從而證實(shí)槲皮素有較強(qiáng)的抗炎作用[31-32]。本研究利用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)到黃芩-槐花中17種活性成分在治療CKD過(guò)程中發(fā)揮作用的潛在靶標(biāo)共36個(gè)，關(guān)鍵潛在靶點(diǎn)包括IL-6、MAPK1、AKT1、TNF、STAT3、IL-1β等，各靶點(diǎn)之間相互關(guān)聯(lián)，具有協(xié)同治療作用?；钚猿煞?CKD靶標(biāo)-KEGG通路網(wǎng)絡(luò)結(jié)果顯示，黃芩-槐花藥對(duì)治療CKD涉及多個(gè)信號(hào)通路。有研究表明黃芩苷能減輕HT-29細(xì)胞炎癥反應(yīng)，抑制P13K磷酸化，下調(diào)AKT的活化，抑制NF-κB的活化入核，從而抑制TNF-α、IL-6等炎癥因子的分泌，發(fā)揮其抗炎效應(yīng)[33]。黃芩苷還可通過(guò)抑制NLRP3炎性小體和TLR4/NF-κB信號(hào)通路，減輕認(rèn)知障礙，保護(hù)神經(jīng)元免受小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥[34]。黃芩苷還通過(guò)上調(diào)腺苷A2a受體、下調(diào)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β1和磷酸化ERK1/2，抑制博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化[35-36]。

圖10 GO-BP、GO-CC、GO-MF富集分析

圖11 KEGG富集分析

圖12 黃芩-槐花藥對(duì)有效成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)

中藥在治療慢性腎臟病方面具有顯著療效，可通過(guò)調(diào)節(jié)一系列信號(hào)通路減輕腎組織的炎性損傷，延緩CKD進(jìn)展[37]，但是仍面臨藥物成分多，靶點(diǎn)不明確，作用機(jī)制復(fù)雜的困難。本研究通過(guò)高效液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析有效成分，再結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)初步探究并推測(cè)黃芩-槐花藥對(duì)主要通過(guò)影響HIF-1、TNF、NF-κB、MAPK、P13K-AKT等信號(hào)通路共同參與機(jī)體細(xì)胞凋亡調(diào)控、炎癥反應(yīng)、缺氧反應(yīng)、血管生成、老化、血管內(nèi)皮調(diào)控等生物過(guò)程以達(dá)到治療CKD的目的，以期為后續(xù)研究提供思路與依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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[35] 張沂, 穆杰, 高偉華, 等. 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)從系統(tǒng)層面探討黃芩苷治療肺纖維化的效應(yīng)機(jī)制研究[J]. 世界中醫(yī)藥, 2020, 15(10): 1373-1380.

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Analysis of effective components of-drug pair by UPLC-ESI-TOF/MS and network pharmacology analysis of its effect on chronic kidney disease

GUAN Yi-qing1, ZHENG Xin-nan2, YAN Meng-qiu2, WU Huan-xian2, ZHANG Guo-hua1, LYU Lin2

1. School of Traditiongal Chinese Medicine, Southern Medicial University, Guangzhou 510080, China 2. School of Pharmaceutical Sciences, Southern Medicial University, Guangzhou 510080, China

To establish the identification and analysis method of effective ingredients of(SB-SJ) drug pair, and explore the potential mechanism in the treatment of chronic kidney disease (CKD) by network pharmacology analysis.Ultra Performance Liquid Chromatography Electrospray Ionization-ion Trap-time Of Flight mass spectrometry (UPLC-ESI-TOF/MS) was used to analyze the active components ofSB-SJ drug pair. Seeking the action targets of SB-SJ drug pair via the Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platfom (TCMSP), and the disease-related proteins were found by using the key words "Chronic kidney disease" in Comparative Toxicogenomics Database (CTD), Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM), GeneCards and DrugBank databases, respectively. In addition, the interaction between the targets of active components and disease was analyzed on Venny platform, and the same targets of two were then screened. The regulatory network of "active component-disease targets" was constructed by Cytoscape 3.8.2 software. Moreover, the PPI was obtained by String software. The function and pathway enrichment analysis of core proteins were used GO and KEGG, and the "core target-pathway" network was further constructed.A total of 29 kinds of effect components were identified, including one chalcone, three flavonoids, eleven flavonoids, two saporins (pentacyclic titerpenes), seven dihydrofavonoids, one dihy doflavonol, one isoflavone and three flavonols. Among them, there were 17 active ingredients related to CKD, such as quercetin, genistein, wogonin and kaempferol, which were intersected with disease targets, and 36 core targets containing IL-6, STAT3, TNF, VEGFA and CXCL-8 were screened. According to the pathway enrichment analysis of the key targets, the active components of SB-SJ drug pairhave the therapeutic effect on CKD mainly through PI3K-AKT, JAK-STAI, IL-17, AGE-RAGE and other signal pathways.In this study, 29 active components in SB-SJ drug pairwere determined, and the mass spectrometric cleavage rules of wogonoside, quercetin, kaempferol and kaikasaponin III were analyzed. Based on network pharmacology, the mechanism of SB-SJ drug pair in the treatment of CKD was explored, which provides a scientific basis for future clinical application.

Georgi;L.; drug pair; UPLC-ESI-TOF/MS; chronic kidney disease; network pharmacology; wogonoside; quercetin; kaempferol; kaikasaponin III

R284.1

A

0253 - 2670(2022)20 - 6388 - 13

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.20.011

2022-03-14

廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2019A1515011124）；廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2021A1515011674）

管怡晴（1993—），女，碩士研究生，專業(yè)方向?yàn)橹形麽t(yī)結(jié)合治療心血管疾病。Tel: 13411214868 E-mail: 1040052@qq.com

張國(guó)華，男，教授，主任醫(yī)師，博士，研究方向?yàn)橹形麽t(yī)結(jié)合治療心血管疾病。Tel: 13189098311 E-mail: zghgz@163.com

呂 琳，女，副教授，博士，研究方向?yàn)榭谷橄侔┧幬锏乃幚韺W(xué)研究。Tel: 13560490259 E-mail: lynnlv@smu.edu.cn

[責(zé)任編輯 王文倩]