四君子湯對高乳糖飼喂脾虛證大鼠的治療作用研究?

盧夢雄， 黃金科， 王一帆， 薛 紅， 王鳳云， 唐旭東,△

(1.北京大學中醫(yī)藥臨床醫(yī)學院(西苑)， 北京 100091；2.中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院， 北京 100091)

脾是中醫(yī)藏象理論的重要組成部分，生理功能主要體現(xiàn)在脾主運化谷食和水飲，脾主統(tǒng)血，在體合肉主四肢[1]。脾虛證多由飲食失節(jié)、損傷脾胃，或過于勞神、損傷脾氣，或素稟不足、年老體衰，或過服苦寒瀉下藥物、損傷脾陽所致。脾虛證者出現(xiàn)氣短乏力、語聲低微、面色萎黃、食少便溏、四肢無力等癥狀。四君子湯由人參、白術(shù)、茯苓、炙甘草4味藥物組成，出自《太平惠民和劑局方》，具有補氣健脾之功效，是治療脾胃氣虛證的經(jīng)典名方，臨床應用較多[2]。梔子性苦寒傷胃，脾虛便溏者不宜用，用之則加重病情。

東亞人群由于成年后乳糖酶活性缺乏，乳糖不能被消化、吸收，易出現(xiàn)腹痛、腹脹、腹瀉、腸鳴等乳糖不耐受癥狀[3-5]。隨著乳制品消耗增加，乳糖不耐受在我國發(fā)病逐漸上升[5-7]。此癥狀與脾虛證有類似之處，故可用于脾虛證模型研究[8]。本研究用高乳糖飼料飼喂模擬飲食偏嗜和瀉下之法，用水平臺站立法模擬勞倦過度，并增加不定時投喂模擬饑飽失常。使用定制AIN-93 G純化飼料作為基本飼料[9]，以滿足大鼠生長發(fā)育所需營養(yǎng)，并在各大營養(yǎng)素總量不變的基礎上設計高乳糖飼料，避免普通飼料中不可控因素對實驗結(jié)果的影響。根據(jù)課題組前期研究結(jié)果選擇3周的造模時間，并用梯度高乳糖飼料[10]，使模型達到最佳效果。

目前對脾虛證模型的評價，除類比人的脾虛表現(xiàn)外，多根據(jù)脾的功能和特性類比相應指標，如血清D-木糖吸收率、甘油三酯(triglycerides,TG)和胃蛋白酶原作為脾主運化功能輔助實驗室參考指標[10-12]，血小板數(shù)量作為脾主統(tǒng)血功能的參考指標[13]，抓力、骨骼肌三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)含量、肌糖原含量作為脾在體合肉、主四肢的參考指標[14-16]，胃饑餓素含量作為脾在志為思的參考指標[17]。但目前研究評價指標多較單一且不全面，故本研究將對上述指標進行檢測以全面評價四君子湯對高乳糖飼喂脾虛證大鼠模型的療效和作用，并用加重脾虛的梔子干預，以期達到方與證的互相驗證。本研究通過中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院動物倫理委員會批準(批號2019XLC004)。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量(260±20)g，購于斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司，實驗動物許可證號SCXK (京) 2019-0010。常規(guī)飼料適應性喂養(yǎng)1周，每日日光燈照射(8∶00-20∶00)，室內(nèi)溫度(22±2)℃。

1.2 藥物

實驗所用藥物均購自中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院藥房，四君子湯按《太平惠民和劑局方》原方比例，即人參、白術(shù)、茯苓、炙甘草的質(zhì)量比為3∶3∶3∶2，用水煎成湯劑，分別濃縮成生藥含量0.5 g/mL(低劑量)、1 g/mL(中劑量)、2 g/mL(高劑量)的藥劑。同樣梔子用水煎成湯劑，濃縮成生藥含量1 g/mL。

1.3 主要試劑及儀器

40%、45%、50%高乳糖飼料和標準AIN-93 G標準飼料(北京科澳協(xié)力飼料有限公司);D-木糖(北京Coolaber公司，貨號 CX12001-100 G)；D-木糖試劑盒(英國Cohesionbio公司，貨號 CAK1238)；大鼠胃蛋白酶原酶聯(lián)免疫試劑盒、大鼠饑餓素酶聯(lián)免疫試劑盒、TG生化試劑盒、ATP生化試劑盒、肌糖原生化試劑盒(湖北艾恩斯生物科技有限公司，貨號34607、30838、30371 S、30726 S、34667 S)(見表1)。

表1 飼料配方(單位：g)

自制水環(huán)境小平臺站立箱(112 cm×62 cm×41 cm)，設置15個小平臺，平臺直徑8 cm、高10 cm，平臺周邊注水，水深 2 cm，水溫保持(20±2)℃。Z326K型高速冷凍離心機，德國Siemens公司；Synergy LX型酶標儀，美國Biotek公司；YLS-13A型大小鼠抓力測定儀，上海移數(shù)信息科技有限公司。

1.4 分組、模型制備與藥物干預

隨機將60只SD大鼠分為正常組、模型組、四君子湯低劑量組、四君子湯中劑量組、四君子湯高劑量組、梔子組6組各10只。正常組給予標準配方飲食，每日灌胃0.9%氯化鈉溶液2 mL作為對照。其余組按每周增高5%濃度乳糖給予40%、45%、50%高乳糖飼料，每日水平臺站立15 h，不定時喂食，并每日灌胃對應中藥2 mL，造模與給藥共3周。

1.5 檢測指標與方法

1.5.1 體質(zhì)量測定 每天觀察動物毛發(fā)神態(tài)活力，取材前稱量動物體質(zhì)量。

1.5.2 糞便含水量測定 取材前收集各組大鼠濕便稱重，放入37 ℃烘箱中烘烤24 h干便稱重，含水量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.5.3 抓力測定 每只大鼠取材前均進行抓力測定，每次連續(xù)測3次取平均值。

1.5.4 血清D-木糖含量測定 取材時按1 mL/100 g劑量給大鼠灌胃3% D-木糖溶液，2 h后麻醉，腹主動脈取血，離心取血清，分光光度法測量全部大鼠血清D-木糖含量。

1.5.5 血清胃蛋白酶原、胃饑餓素、甘油三酯測定 腹主動脈取血離心后取血清，每組各取5只大鼠進行檢測。胃蛋白酶原與胃饑餓素用Elisa法、TG用分光光度法進行測定。

1.5.6 肌肉三磷酸腺苷、糖原測定 每組取5只左后腿腓腸肌，液氮冷凍備用，分光光度法測定ATP、糖原含量。

1.5.7 小腸病理學 截取所有大鼠幽門下15 cm腸段，用0.9%氯化鈉溶液清洗干凈，放入多聚甲醛固定，石蠟包埋后切片，蘇木素-伊紅染色觀察小腸絨毛和腺體的病理形態(tài)。

1.6 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 一般體征

正常組大鼠皮毛光亮，肛門干凈，精神良好，活動度正常，糞便顆粒分明，體質(zhì)量正常增長。模型組大鼠給予高乳糖飼料1～2 d后出現(xiàn)明顯黃色水樣稀便，且隨著造模時間的延長，皮毛逐漸變黃凌亂、失去光澤，肛周出現(xiàn)污穢，倦臥瞇眼，活動度差，體質(zhì)量增長緩慢甚至負增長。四君子湯低、中、高劑量組大鼠最開始表現(xiàn)與模型組相同，用藥后水樣便癥狀逐漸緩解，個別大鼠排出成型便，皮毛逐漸光亮順滑整潔，精神狀態(tài)及活動度轉(zhuǎn)好。梔子組大鼠則一直維持脾虛狀態(tài)到實驗結(jié)束。

2.2 各組大鼠體質(zhì)量比較

圖1示，與正常組比較，模型組大鼠體質(zhì)量明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，四君子湯各劑量組大鼠體質(zhì)量雖有升高但差異無統(tǒng)計學意義，梔子組大鼠體質(zhì)量明顯低于模型組(P<0.01)。

注: 與正常組比較：**P<0.01；與模型組比較：△ △P<0.01；與梔子組比較：##P<0.01；低、中、高劑量組均給予四君子湯圖1 各組大鼠體質(zhì)量比較

2.3 各組大鼠抓力比較

圖2示，與正常組比較，模型組大鼠抓力明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，四君子湯低、中、高劑量組大鼠抓力明顯升高(P<0.05，P<0.01)。

注: 與正常組比較：**P<0.01；與模型組比較：△ P<0.05，△ △P<0.01；低、中、高劑量組均給予四君子湯圖2 各組大鼠抓力比較

2.4 各組大鼠糞便含水量比較

圖3示，與正常組比較，模型組大鼠糞便含水量明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，梔子組大鼠糞便含水量明顯升高(P<0.05)，其余組比較差異無統(tǒng)計學意義。

注: 與正常組比較：*P<0.05；與模型組比較：△ P<0.05；低、中、高劑量組均給予四君子湯圖3 各組大鼠糞便含水量比較

2.5 各組大鼠血清D-木糖含量比較

圖4示，與正常組比較，模型組大鼠血清D-木糖含量明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，高劑量組大鼠血清D-木糖含量明顯升高(P<0.05)。

注: 與正常組比較：*P<0.05；與模型組比較：△P<0.05；低、中、高劑量組均給予四君子湯圖4 各組大鼠血清D-木糖含量比較

2.6 各組大鼠血清胃蛋白酶原含量比較

圖5示，各組大鼠血清胃蛋白酶原含量比較差異無統(tǒng)計學意義。

注：低、中、高劑量組均給予四君子湯圖5 各組大鼠血清胃蛋白酶原含量比較

2.7 各組大鼠血清胃饑餓素含量比較

圖6示，與正常組比較，模型組大鼠血清胃饑餓素含量明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，各用藥組大鼠血清胃饑餓素含量有所升高，但差異無統(tǒng)計學意義。

注: 與正常組比較*P<0.05；低、中、高劑量組均給予四君子湯圖6 各組大鼠血清胃饑餓素含量比較

2.8 各組血清甘油三酯含量比較

圖7示，與正常組比較，模型組大鼠血清TG含量明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，高劑量組大鼠血清TG含量明顯降低(P<0.05)。

注: 與正常組比較：**P<0.01；與模型組比較：△ P<0.05；低、中、高劑量組均給予四君子湯圖7 各組大鼠血清甘油三酯含量比較

2.9 各組肌肉大鼠三磷酸腺苷含量比較

圖8示，與正常組比較，模型組大鼠肌肉ATP含量明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，高劑量組大鼠肌肉ATP含量明顯升高(P<0.01)。

注: 與正常組比較：**P<0.01；與模型組比較：△△P<0.01；低、中、高劑量組均給予四君子湯圖8 各組大鼠肌肉三磷酸腺苷含量比較

2.10 各組大鼠肌肉糖原含量比較

圖9示，與正常組比較，模型組大鼠肌肉糖原含量明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，四君子湯低、中、高劑量組和梔子組大鼠肌肉糖原含量均明顯升高(P<0.05，P<0.01)。

注: 與正常組比較：**P<0.01；與模型組比較：△P<0.05，△△P<0.01；低、中、高劑量組均給予四君子湯圖9 各組大鼠肌肉糖原含量比較

2.11 各組大鼠血小板含量比較

圖10示，各組大鼠血小板含量比較差異無統(tǒng)計學意義。

注：低、中、高劑量組均給予四君子湯圖10 各組大鼠血小板含量比較

2.12 各組大鼠小腸病理形態(tài)比較

圖11示，與正常組比較，模型組大鼠小腸絨毛和腺體結(jié)構(gòu)完全破壞。與模型組比較，四君子湯低、中、高劑量組大鼠小腸絨毛結(jié)構(gòu)完整，絨毛和腺體逐漸增密，以高劑量組效果最明顯。

圖11 各組大鼠小腸病理形態(tài)比較(HE染色×100)

3 討論

依據(jù)中華中醫(yī)藥學會脾胃病分會發(fā)布的《脾虛證中醫(yī)診療專家共識意見(2017)》中脾虛證診斷標準[18]，高乳糖飼喂復合因素法脾虛證大鼠模型一般體征判定可為溏稀便或水樣便，體質(zhì)量增加緩慢或減輕，納呆、少動、皮毛干枯少光、抓力下降等。模型組大鼠脾虛體征明顯，梔子組更甚，各劑量四君子湯組大鼠精神和活動度等逐漸好轉(zhuǎn)，說明脾虛模型造模成功，且四君子湯起到了對證治療作用。

在脾主運化功能方面，血清D-木糖含量是判別脾虛證的經(jīng)典指標，血清TG可作為脾運化脂質(zhì)能力的指標，糞便含水量可作為脾運化水液能力的指標，小腸的病理性改變反映脾吸收水谷精微的功能失調(diào)。四君子湯對上述指標的改善作用說明四君子湯能夠?qū)ψC治療這一脾虛證模型，使脾主運化的功能恢復。四君子湯干預后，大鼠運化脂質(zhì)能力趨于正常，脂質(zhì)在體內(nèi)累積減少，水液運化功能部分恢復，小腸絨毛和腺體恢復完整。梔子對本模型則無明顯治療作用，有的指標甚至加重。各組血清胃蛋白酶原含量比較差異無統(tǒng)計學意義，可能與相關文獻中造模方法不同有關。

脾在體合肉、主四肢方面的指標可以抓力、肌肉ATP和糖原含量為代表。四君子湯使大鼠抓力恢復到正常水平，高劑量組大鼠肌肉ATP含量升高明顯，梔子則無改善作用。各四君子湯組和梔子組大鼠的肌肉糖原含量均明顯升高，梔子組大鼠的含量升高可能與其藥理成分有關。上述抓力、肌肉ATP和糖原含量的上升說明四君子湯對脾主肌肉的功能有恢復作用。

脾主統(tǒng)血方面，各組大鼠血小板含量比較差異無統(tǒng)計學意義，可能是由于取材時間錯過了本模型脾主統(tǒng)血功能降低最明顯的時間點。脾在志為思可體現(xiàn)于血清胃饑餓素的水平，胃饑餓素是“腦腸軸”調(diào)控激素，模型組大鼠胃饑餓素含量明顯降低，各用藥組大鼠有所升高,但差異無統(tǒng)計學意義，內(nèi)在機制有待深入研究。

綜上所述，本研究證明四君子湯能夠顯著改善高乳糖飼喂疊加水平臺法及饑飽失常因素所致脾虛證模型的一般體征、生化指標、病理表現(xiàn)，方與證互相印證，梔子不能改善則反證上述結(jié)論。